Süspansiyon Retina pigment epiteli Hücreleri sunun Kemirgenler Subretinal Enjeksiyonları Sahne

Özet

Here we present a community accepted protocol in multimedia format for subretinally injecting a bolus of RPE cells in rats and mice. This approach can be used for determining rescue potentials, safety profiles, and survival capacities of grafted RPE cells upon implantation in animal models of retinal degeneration.

Özet

elektriksel uyarıların içine ışık dönüşümü dış retina oluşur ve çubuk ve koni fotoreseptör ve retina pigment epiteli (RPE) hücreleri tarafından büyük ölçüde gerçekleştirilir. RPE fotoreseptör ve ölüm ya da RPE hücrelerinin disfonksiyonu yaşa bağlı makula dejenerasyonu (YBMD), insanlar yaş 55 ve üzeri kalıcı görme kaybının önde gelen nedeni karakteristik için kritik destek sağlamaktadır. AMD için bir tedavi tespit edilmiş olmakla birlikte, hasta göze sağlıklı RPE implantasyonu etkili bir tedavi olduğu ortaya çıkabilir ve RPE hücreleri, çok sayıda hali hazırda, pluripotent kök hücreleri elde edilebilir. RPE hücre teslim ve güvenliğine ilişkin birçok ilginç sorular hala hayvan modellerinde incelenebilir ve RPE enjekte için kullanılan kabul görmüş protokoller geliştirilmiştir. Burada açıklanan teknik çeşitli çalışmalarda çoklu gruplar tarafından kullanılan ve ilk keskin iğne ile göz delik oluşturarak içerir. Bir blu ile daha sonra bir şırıngaHücre yüklü nt iğne deliğinden sokulur ve hafifçe RPE temas edene kadar vitröz geçirilir. Nispeten basittir ve çok az ekipman gerektirmektedir, bu enjeksiyon yöntemi kullanarak, hayvan modellerinde fotoreseptör dejenerasyonu önemli miktarda önleyen ana RPE arasında kök hücre türetilmiş RPE hücreleri, tutarlı ve etkili bir entegrasyon sağlamak. Gerçek protokolünün bir parçası değildir, biz de enjeksiyon, ve nasıl hücreler in vivo görüntüleme yöntemleri kullanarak subretinal boşluğa enjekte edildi doğrulamak için neden olduğu travmanın boyutlarını belirlemek için nasıl açıklar. Son olarak, bu protokolün kullanılması RPE hücreleri ile sınırlı değildir; Bu retina altına doğru herhangi bir bileşik ya da bir hücre enjekte etmek için kullanılabilmektedir.

Giriş

The sensory retina is organized in functional tiers of neurons, glia, and endothelial cells. Photoreceptors at the back of the retina are activated by light; through phototransduction they convert photons into electrical signals that are refined by interneurons and transmitted to the visual cortex in the brain. Phototransduction cannot occur without the coordinated efforts of Mueller glia and retinal pigment epithelium (RPE) cells. RPE are organized in a monolayer directly behind the photoreceptors and perform multiple and diverse functions integral to photoreceptor function and homeostasis. In fact, RPE and photoreceptors are so co-dependent that they are considered to be one functional unit. Death or dysfunction of RPE results in devastating secondary effects on photoreceptors and is associated with age-related macular degeneration (AMD), the leading cause of blindness in the elderly^1,2.

While no cure has been discovered for AMD, several clinical studies have shown that RPE cell replacement may be a promising therapeutic option^3-13. With the advent of stem cell technology, it is now possible to generate large numbers of RPE cells in vitro from embryonic and induced pluripotent stem cells (hES and hiPS) that strongly resemble their somatic counterparts functionally and anatomically^14-26. Stem cell-derived RPE have also been shown to function in vivo by multiple independent groups, including our own, to significantly slow retinal degeneration in rat and mouse lines with spontaneous retinal degeneration^{16,18,21,22,25,28,29}. This combination of clinical and preclinical supporting evidence is so compelling that several clinical trials to prevent retinal degeneration using stem cell-derived RPE cells are now ongoing^30,31.

RPE can be readily derived from hES and/or hiPS and implanted in the subretinal space of rodents using various derivation and injection techniques^32,33. (See Westenskow et al. for a methods paper in multimedia format demonstrating the directed differentiation protocol we employ)³⁴. There are critical remaining questions regarding the safety, survival, and functional capacity of exogenously delivered RPE cells upon implantation, therefore the ability to perform subretinal injections in rodents is a critical skill^{16,18,21,29,36,37}. The delivery of RPE is not trivial, and the field is divided on the most effective injection technique. The protocol we describe here is a simple and effective way to deliver of bolus of RPE cells subretinally, and was used in the first clinical trial for stem cell-derived RPE transplantation³¹. (The reader may also refer to another JoVE article by Eberle et al. for an alternative depiction of subretinal injections in rodents.³⁸)

The technique outlined in this manuscript cannot be visualized and trauma is unavoidable (as with any subretinal injection technique). It is performed by making a hole just under the limbus vessels and inserting a blunt needle along a transscleral route to inject a bolus of cells under the diametrically opposed retina. The person doing the injection will feel resistance as the blunt needle touches the retina. The cells may be directly visualized after the injection, however, and the degree of the induced retinal detachment can be determined by labeling the RPE cells with a transient fluorescent marker and detecting them with a confocal scanning ophthalmoscope (cSLO). An optical coherence tomography (OCT) system can also be used to monitor the trauma and easily identify the injection site.

Protokol

NOT: Tüm hayvanlar Scripps Araştırma Enstitüsü tarafından kurulan etik kurallara uygun olarak tedavi edildi.

Enjeksiyon için Materyallerin hazırlanması 1. (~ 20 dk)

1. Ön sıcak hücre ayrışma çözeltisi (tercihen serumu ile seyreltme yoluyla durdurulmuş olduğu bir), steril PBS ve kültür ortamı (Tablo 1).
2. Demontaj ve 15 dakika için su içinde parça kaynatılmasıyla bir kör iğne ile şırınga sterilize edin.

Enjeksiyon için RPE Hücreler 2. Hazırlık (30 dakika saat 1)

1. 37 ° C'de 5-8 dakika boyunca ön ısıtılmış hücre ayrışma çözeltisi kullanılarak RPE hücreleri ayırmak.
2. Hala bağlı olduğu herhangi bir serbest bırakmak için hafifçe kazıyın hücreleri.
3. Kültür ortamı büyük bir hacmi (15 ml tüp doldurmak) ayrışma çözümü inaktive ve onları saymak hücreleri seyreltin.
4. Pelet hücreleri 5 dakika boyunca 800 x g'de santrifüjleyin.
5. Steril, önceden ısıtılmış PBS / ml 200,000 hücreleri (0.5 ul hacim içinde 100,000 hücre sağlamak için) hücreleri yeniden süspanse edin ve bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içine transfer edin.
6. İsteğe bağlı olarak, bir canlı hücre geçici floresan markörü ekleyebilir ve 30-45 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
7. Hücrelerden 0.5 ul, kör bir iğne şırınga yerleştirin. Kısa sürede hücreleri enjekte edilir.

3. Alt-retinal Enjeksiyon (~ Enjeksiyon başına 5 dakika)

NOT: Mümkünse Limbustan damarları görselleştirmek için çok daha kolay olduğundan, erişkin albino sıçanlar ile tekniğini öğrenmek. Daha kolay enjeksiyon yerinde görülmesini kolaylaştırmak için (hücreleri enjekte denemeden önce) öğrenme sırasında Hızlı Yeşil çözüm enjekte edilir.

1. Kemirgen anestezisi. 100 mg / ml ketamin ve 10 mg / ml ksilazin (20 ul / 10 g vücut ağırlık intraperitoneal enjeksiyon kullanınizofluoran inhalasyon üzerinde sekiz) bu kemirgen manevra ve inhaler içinde burnu ile göz içine enjekte etmek zor olduğundan.
   1. Hayvan derinden pençeleri birini kısma anestezi emin olun. O geri çekildiğinde ise, birkaç dakika daha bekleyin ve subretinal enjeksiyon başlamadan önce tekrar deneyin.
2. Enjekte edilecek göz tavan bakacak şekilde onun yüzüne kemirgen yerleştirin.
3. Göz soketi (geçici propitozisin) biraz dışarı açılır ve sadece kulak üstünde ve çene ile ve yavaşça göz kapaklarının deri paralel germek iki parmak ile başını tutarak daha erişilebilir hale böylece mikroskop altında cildi nazikçe germek çok göz hafifçe soketten açılır ki (Şekil 1C bakınız). Boğaz çok yakın kemirgen tutmayın.
4. 30 G keskin tek ön-sterilize iğne ile, gemiler isabet eğer, kanama olacak b (hemen limbusun altında bir delik yapmakönemli e ve daha sonra delik bulmak zor olabilir) ve bir açıyla iğne (Şekil 1D) ile lensi dokunmamak için. Meydana gelecek keskin (ya da künt) iğne veya acil katarakt oluşumu ile lensi dokunmaktan kaçının.
   NOT: Enjeksiyon iki kişi ile daha iyi çalışır. Bu şekilde bir kişi onlar delik olduğu odaklanmak korumak için keskin tek iğne ile ilk delik oluşturduktan sonra enjeksiyon yapan kişiye künt iğne ile şırınga iletebilirsiniz.
5. Kafasına kavrama korurken göz atılabilir keskin iğne geri çekin. Delik tam olarak nerede unutmayın.
6. Ya bir micromanipulator bir künt bir iğne ile ön-yüklü şırınga montaj veya elle tutarak, lensi dokunma ve hafifçe göz aracılığıyla itmek için değil yine dikkat çekici, delikten künt iğne ile şırınga ucu ekledikten sonra çok yavaşça duygu direnci (Şekil 1D) kadar.
7. Kminimumda tüm hareketleri eeping, dikkatle yavaş yavaş subretinal boşluğa RPE hücreleri enjekte.
   NOT: RPE / retinanın ayrılması bağlı olacak; Bu kaçınılmazdır. Bununla birlikte, daha temiz bir enjeksiyon dekolmanı en aza indirir ve büyük ölçüde yeniden takılması (Şekil 1E) şansını arttırır. Herhangi abartılı hareketler retina geri iğneyi hareket edebilir, ve yanlara hareketler retinaya zarar edebilirsiniz. bir enjeksiyon pompasının kullanılması isteğe bağlıdır fakat çok hassas bir teslimat sağlar.
8. Yavaş yavaş şırınga geri çekin. Göz nemlendirici uygulayın hidrate göz tutmak düşer.
9. Sternal yatma kavuşur kadar hayvan izlemeye devam edin. Gözetimsiz bırakmayın hayvan veya sternum yatma kavuşur kadar diğer uyarı hayvanlarla bir kafes iade etmeyin.

Sonuçlar

Biz bu yazıda anlatılan tekniği kullanarak hızlı ve tutarlı kemirgenler subretinal boşluğa RPE hücrelerinin bir süspansiyon sunabilirsiniz. Gerekli olmamakla beraber, travmalar büyük ölçüde Şekil 1A ve B, bir mikromanipülatör ile gösterilen düzeneği kullanılarak en aza indirilebilir. Geçici propitozlar Şekil 1C'de gösterildiği gibi, kemirgen tutun. mikromanipülatör veya elle yapıldığı takdirde adımlar aynıdır; Bu Şekil 1D karikat?...

Tartışmalar

Bu yazıda sıçanlarda ve farelerde süspansiyon RPE hücrelerinin subretinal enjeksiyonları gerçekleştirmek için nispeten basit bir yöntem tarif. protokol az travmalarda tercüme edecek tekniği ile öğrenmesi kolay ve daha deneyim (Şekil 3, bu iyi enjeksiyon birini temsil) bir mikromanipülatör (Şekil 1A) kullanıldığında, özellikle. Herhangi bir travma, bir cSLO ve Ekim sistemi (Şekil 2) varsa in vivo izlenebilir. Yüksek çözünürlük ve da...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoethanol (55 mM)	Gibco	21985-023	50 ml x 1
Cell Scapers	VWR	89260-222	Case x 1
CellTracker Green CMFDA	Molecular Probes	C34552	50 µg x 20
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190-144	500 ml x 1
Fast Green	Sigma-Aldrich	F7258	25 g x 1
Genteal Geldrops Moderate to Severe Lubricant Eye Drops	Walmart	4060941	25 ml x 1
Hamilton Model 62 RN SYR	Hamilton	87942	Syringe x 1
Hamilton Needle 33 G, 0.5", point 3 (304 stainless steel)	Hamilton	7803-05	Needles x 6
Knockout DMEM	Gibco	10829-018	500 ml x 1
KnockOut Serum Replacement	Gibco	10828-028	500 ml x 1
L-Glutamine 200 mM	Gibco	25030-081	100 ml x 1
Magnetic Stand	Leica Biosystems	39430216	Stand x 1
MEM Non-Essential Amino Acids Solution 100X	Gibco	11140-050	100 ml x 1
Micromanipulator	Leica Biosystems	3943001	Manipulator x 1
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)	Gibco	15140-122	100 ml x 1
Slip Tip Syringes without Needles BD  (3 ml)	VWR	BD309656	Pack x 1
Specialty-Use Needles BD  (30 G, 1")	VWR	BD305128	Box x 1
TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red	Gibco	12604013	100 ml x 1