Exécution sous-rétinienne injections chez les rongeurs de produire des cellules de l'épithélium pigmentaire rétinien Suspension

Résumé

Here we present a community accepted protocol in multimedia format for subretinally injecting a bolus of RPE cells in rats and mice. This approach can be used for determining rescue potentials, safety profiles, and survival capacities of grafted RPE cells upon implantation in animal models of retinal degeneration.

Résumé

La conversion de la lumière en impulsions électriques se produit dans la rétine externe et est réalisée en grande partie par bâtonnets et des cônes photorécepteurs et l'épithélium pigmentaire rétinien (EPR) des cellules. RPE fournir un soutien essentiel pour les photorécepteurs et la mort ou le dysfonctionnement des cellules RPE est caractéristique liée à l'âge dégénérescence maculaire (DMLA), la principale cause de perte de vision permanente chez les personnes de 55 ans et plus. Alors pas de remède pour AMD a été identifié, l'implantation d'un EPR sain dans les yeux malades peut se avérer un traitement efficace, et un grand nombre de cellules RPE peut être facilement généré à partir de cellules souches pluripotentes. Plusieurs questions intéressantes quant à l'innocuité et l'efficacité de la prestation des cellules RPE peuvent encore être examinés dans des modèles animaux, et des protocoles bien acceptées utilisées pour injecter RPE ont été développés. La technique décrite ici a été utilisé par plusieurs groupes dans diverses études et consiste à créer d'abord un trou dans l'œil avec une aiguille. Ensuite, une seringue avec une bluaiguille nt chargé avec des cellules est inséré à travers le trou et passe à travers le corps vitré jusqu'à ce qu'il touche le RPE. En utilisant cette méthode d'injection, ce qui est relativement simple et nécessite un minimum d'équipement, nous obtenons une intégration cohérente et efficace des cellules RPE dérivés de cellules souches dans le RPE entre hôte qui empêche la quantité importante de dégénérescence des photorécepteurs chez des modèles animaux. Bien que ne faisant pas partie du protocole proprement dit, on décrit également comment déterminer l'ampleur du traumatisme induit par l'injection, et la façon de vérifier que les cellules ont été injectées dans l'espace sous-rétinien en utilisant des modalités d'imagerie in vivo. Enfin, l'utilisation de ce protocole ne est pas limitée aux cellules RPE; il peut être utilisé pour injecter ne importe quel composé ou d'une cellule dans l'espace sous-rétinien.

Introduction

The sensory retina is organized in functional tiers of neurons, glia, and endothelial cells. Photoreceptors at the back of the retina are activated by light; through phototransduction they convert photons into electrical signals that are refined by interneurons and transmitted to the visual cortex in the brain. Phototransduction cannot occur without the coordinated efforts of Mueller glia and retinal pigment epithelium (RPE) cells. RPE are organized in a monolayer directly behind the photoreceptors and perform multiple and diverse functions integral to photoreceptor function and homeostasis. In fact, RPE and photoreceptors are so co-dependent that they are considered to be one functional unit. Death or dysfunction of RPE results in devastating secondary effects on photoreceptors and is associated with age-related macular degeneration (AMD), the leading cause of blindness in the elderly^1,2.

While no cure has been discovered for AMD, several clinical studies have shown that RPE cell replacement may be a promising therapeutic option^3-13. With the advent of stem cell technology, it is now possible to generate large numbers of RPE cells in vitro from embryonic and induced pluripotent stem cells (hES and hiPS) that strongly resemble their somatic counterparts functionally and anatomically^14-26. Stem cell-derived RPE have also been shown to function in vivo by multiple independent groups, including our own, to significantly slow retinal degeneration in rat and mouse lines with spontaneous retinal degeneration^{16,18,21,22,25,28,29}. This combination of clinical and preclinical supporting evidence is so compelling that several clinical trials to prevent retinal degeneration using stem cell-derived RPE cells are now ongoing^30,31.

RPE can be readily derived from hES and/or hiPS and implanted in the subretinal space of rodents using various derivation and injection techniques^32,33. (See Westenskow et al. for a methods paper in multimedia format demonstrating the directed differentiation protocol we employ)³⁴. There are critical remaining questions regarding the safety, survival, and functional capacity of exogenously delivered RPE cells upon implantation, therefore the ability to perform subretinal injections in rodents is a critical skill^{16,18,21,29,36,37}. The delivery of RPE is not trivial, and the field is divided on the most effective injection technique. The protocol we describe here is a simple and effective way to deliver of bolus of RPE cells subretinally, and was used in the first clinical trial for stem cell-derived RPE transplantation³¹. (The reader may also refer to another JoVE article by Eberle et al. for an alternative depiction of subretinal injections in rodents.³⁸)

The technique outlined in this manuscript cannot be visualized and trauma is unavoidable (as with any subretinal injection technique). It is performed by making a hole just under the limbus vessels and inserting a blunt needle along a transscleral route to inject a bolus of cells under the diametrically opposed retina. The person doing the injection will feel resistance as the blunt needle touches the retina. The cells may be directly visualized after the injection, however, and the degree of the induced retinal detachment can be determined by labeling the RPE cells with a transient fluorescent marker and detecting them with a confocal scanning ophthalmoscope (cSLO). An optical coherence tomography (OCT) system can also be used to monitor the trauma and easily identify the injection site.

Protocole

REMARQUE: Tous les animaux ont été traités conformément aux directives éthiques établies par l'Institut de recherche Scripps.

1. Préparation des matériaux pour l'injection (~ 20 min)

1. Solution de dissociation cellulaire pré-chaud (de préférence une qui est inactivé par dilution avec du sérum non), du PBS stérile et le milieu de culture (Tableau 1).
2. Stériliser la seringue avec une aiguille émoussée de démonter les pièces d'ébullition et dans l'eau pendant 15 min.

2. Préparation des cellules RPE pour injection (~ 30 min à 1 h)

1. Détacher les cellules RPE utilisant une solution préchauffée dissociation cellulaire pour 5-8 min à 37 ° C.
2. Grattez les cellules doucement pour libérer celles qui sont encore attachés.
3. Diluer les cellules avec un grand volume de milieu de culture (remplir un tube de 15 ml) pour inactiver la solution de dissociation et les compter.
4. Centrifuger à 800 g pendant 5 min pour sédimenter les cellules.
5. Remettre en suspension les cellules à 200 000 cellules / ul (à livrer 100 000 cellules dans un volume de 0,5 pi) dans stérile préchauffée PBS et les transférer dans un tube de 1,5 ml.
6. Facultativement, ajouter un marqueur fluorescent transitoire de cellules vivantes et incuber à 37 ° C pendant 30 à 45 min.
7. Chargez la seringue avec une aiguille émoussée avec 0,5 pi de cellules. Injecter les cellules dès que possible.

3. Sous-rétinienne injection (~ 5 min par injection)

NOTE: Si possible, apprendre la technique avec des rats albinos adultes depuis les navires limbe sont beaucoup plus faciles à visualiser. Injecter la solution vert rapide lors de l'apprentissage (avant d'essayer d'injecter des cellules) pour faciliter plus facilement la visualisation du site d'injection.

1. Anesthésier le rongeur. Utilisez injection intrapéritonéale de 100 mg / ml kétamine et 10 mg / ml de xylazine (20 pi / 10 g de corps whuit) sur isofluorane inhalation car il est difficile de manoeuvrer le rongeur et l'injecter dans l'oeil avec le museau de l'inhalateur.
   1. Assurez-vous que l'animal est profondément anesthésié en pinçant une de ses pattes. Se il sursaute, attendre encore plusieurs minutes et essayez à nouveau avant de commencer l'injection sous-rétinien.
2. Placez le rongeur sur le côté afin que l'œil qui sera injecté est confronté le plafond.
3. Sous un microscope de dissection étirer doucement la peau afin que l'œil se ouvre en légère hausse de la prise (de proptosis temporaire) et devient plus accessible en tenant la tête avec deux doigts juste au-dessus de l'oreille et de sa mâchoire et étirer doucement la peau parallèlement aux paupières de sorte que l'œil se ouvre en légère hausse de la prise (voir figure 1C). Ne pas saisir le rongeur trop près de la gorge.
4. Avec une aiguille de pré-stérilisé jetable forte 30 G, faire un trou juste au-dessous du limbe (si les navires sont touchés, saignement be significative et il sera difficile de trouver le trou plus tard) et à un angle pour éviter de toucher l'objectif avec l'aiguille (figure 1D). Évitez de toucher l'objectif avec le aiguille pointue (ou émoussée) ou la formation immédiate de la cataracte se produira.
   NOTE: Les injections fonctionnent mieux avec deux personnes. De cette façon, une personne peut passer la seringue avec l'aiguille émoussée à la personne effectuant l'injection après avoir créé le premier trou avec l'aiguille jetable forte de maintenir l'accent sur la où le trou est.
5. Rétracter l'aiguille jetable forte de l'œil tout en maintenant la poignée sur la tête. Ne oubliez pas exactement où le trou est.
6. Après soit le montage de la seringue pré-chargé avec une aiguille émoussée sur un micromanipulateur ou le tenant par la main, insérez la pointe de la seringue avec l'aiguille émoussée à travers le trou, en prenant également soin de ne pas toucher la lentille et doucement pousser à travers l'œil très doucement jusqu'à ce qu'une résistance se sentir (figure 1D).
7. Keeping tous les mouvements au minimum, injecter attentivement les cellules RPE lentement dans l'espace sous-rétinien.
   REMARQUE: décollement de l'EPR / de la rétine sera induite; ce est inévitable. Cependant, une injection propre minimise le détachement et améliore considérablement les chances de rattachement (figure 1E). Les mouvements exagérés peuvent reculer l'aiguille dans la rétine, et les mouvements latéraux peuvent endommager la rétine. L'utilisation d'une pompe d'injection est facultative, mais permet une livraison très précise.
8. Rétracter la seringue lentement. Appliquer hydratant de gouttes pour les yeux de garder l'oeil hydraté.
9. Continuer à surveiller l'animal jusqu'à ce qu'il retrouve décubitus sternal. Ne pas laisser animal sans surveillance, ou retourner à une cage avec d'autres animaux d'alerte jusqu'à ce qu'il retrouve décubitus sternal.

Résultats

Nous pouvons livrer une suspension de cellules RPE dans l'espace sous-rétinien de rongeurs rapidement et régulièrement en utilisant la technique décrite dans ce manuscrit. Bien que pas nécessaire, les traumatismes peuvent être considérablement réduits au minimum en utilisant la configuration illustrée avec un micromanipulateur à la figure 1A & B. Maintenir le rongeur comme représenté sur la figure 1C pour une exophtalmie temporaire. Les étapes sont les mêmes se il ...

Discussion

Dans cet article, nous décrivons une méthode relativement simple pour réaliser des injections sous-rétiniens de cellules RPE en suspension dans les rats et les souris. Le protocole est facile à apprendre et plus d'expérience avec la technique se traduiront par moins de traumatismes (figure 3, ce qui représente l'un des meilleurs injections), surtout si un micromanipulateur est utilisé (figure 1A). Tout traumatisme peut être contrôlée in vivo avec un système ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoethanol (55 mM)	Gibco	21985-023	50 ml x 1
Cell Scapers	VWR	89260-222	Case x 1
CellTracker Green CMFDA	Molecular Probes	C34552	50 µg x 20
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190-144	500 ml x 1
Fast Green	Sigma-Aldrich	F7258	25 g x 1
Genteal Geldrops Moderate to Severe Lubricant Eye Drops	Walmart	4060941	25 ml x 1
Hamilton Model 62 RN SYR	Hamilton	87942	Syringe x 1
Hamilton Needle 33 G, 0.5", point 3 (304 stainless steel)	Hamilton	7803-05	Needles x 6
Knockout DMEM	Gibco	10829-018	500 ml x 1
KnockOut Serum Replacement	Gibco	10828-028	500 ml x 1
L-Glutamine 200 mM	Gibco	25030-081	100 ml x 1
Magnetic Stand	Leica Biosystems	39430216	Stand x 1
MEM Non-Essential Amino Acids Solution 100X	Gibco	11140-050	100 ml x 1
Micromanipulator	Leica Biosystems	3943001	Manipulator x 1
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)	Gibco	15140-122	100 ml x 1
Slip Tip Syringes without Needles BD  (3 ml)	VWR	BD309656	Pack x 1
Specialty-Use Needles BD  (30 G, 1")	VWR	BD305128	Box x 1
TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red	Gibco	12604013	100 ml x 1