Выполнение субретинальных инъекции грызунов для доставки пигментного эпителия сетчатки клеток в суспензии

Резюме

Here we present a community accepted protocol in multimedia format for subretinally injecting a bolus of RPE cells in rats and mice. This approach can be used for determining rescue potentials, safety profiles, and survival capacities of grafted RPE cells upon implantation in animal models of retinal degeneration.

Аннотация

Превращение света в электрические импульсы происходит в наружной сетчатке и осуществляется в основном с помощью палочек и колбочек фоторецепторов и пигментного эпителия сетчатки (RPE) клеток. НПП обеспечить необходимую поддержку для фоторецепторов и смерти или дисфункции ПЭС клеток характерно возрастной макулярной дегенерации (ВМД), основной причиной необратимой потере зрения у людей в возрасте от 55 лет и старше. Хотя никакого лечения для AMD, выявлено не было, имплантация здорового ПЭС в пораженных глаз, может оказаться эффективным средством для лечения и большое число клетках ПЭС может быть легко генерируется из плюрипотентных стволовых клеток. Несколько интересных вопросов, касающихся безопасности и эффективности НПП доставки клеток все еще может быть рассмотрен на животных моделях, и хорошо принимаются протоколы, используемые для введения ППД были разработаны. Техника, описанная здесь была использована несколькими группами в различных исследованиях и предполагает в первую очередь создание дыру в глаза с острой иглой. Тогда шприц с BluNT иглы загружен клеток вставляется через отверстие и проходит через стекловидное тело, пока она слегка не коснется RPE. С помощью этого метода впрыска, который относительно прост и требует минимального оборудования, мы достигаем последовательное и эффективной интеграции клеток, полученных клеток RPE в стволовых между принимающей ПЭС, который предотвращает значительное количество дегенерации фоторецептора на животных моделях. Хотя это и не часть фактической протокола, но также описывают, как определить степень травмы, вызванной инъекцией, и как проверить, что клетки вводили в субретинальной пространства с помощью методов визуализации в естественных условиях. Наконец, использование данного протокола не ограничивается клетках ПЭС; он может быть использован для введения любое соединение или клетки в субретинальной пространстве.

Введение

The sensory retina is organized in functional tiers of neurons, glia, and endothelial cells. Photoreceptors at the back of the retina are activated by light; through phototransduction they convert photons into electrical signals that are refined by interneurons and transmitted to the visual cortex in the brain. Phototransduction cannot occur without the coordinated efforts of Mueller glia and retinal pigment epithelium (RPE) cells. RPE are organized in a monolayer directly behind the photoreceptors and perform multiple and diverse functions integral to photoreceptor function and homeostasis. In fact, RPE and photoreceptors are so co-dependent that they are considered to be one functional unit. Death or dysfunction of RPE results in devastating secondary effects on photoreceptors and is associated with age-related macular degeneration (AMD), the leading cause of blindness in the elderly^1,2.

While no cure has been discovered for AMD, several clinical studies have shown that RPE cell replacement may be a promising therapeutic option^3-13. With the advent of stem cell technology, it is now possible to generate large numbers of RPE cells in vitro from embryonic and induced pluripotent stem cells (hES and hiPS) that strongly resemble their somatic counterparts functionally and anatomically^14-26. Stem cell-derived RPE have also been shown to function in vivo by multiple independent groups, including our own, to significantly slow retinal degeneration in rat and mouse lines with spontaneous retinal degeneration^{16,18,21,22,25,28,29}. This combination of clinical and preclinical supporting evidence is so compelling that several clinical trials to prevent retinal degeneration using stem cell-derived RPE cells are now ongoing^30,31.

RPE can be readily derived from hES and/or hiPS and implanted in the subretinal space of rodents using various derivation and injection techniques^32,33. (See Westenskow et al. for a methods paper in multimedia format demonstrating the directed differentiation protocol we employ)³⁴. There are critical remaining questions regarding the safety, survival, and functional capacity of exogenously delivered RPE cells upon implantation, therefore the ability to perform subretinal injections in rodents is a critical skill^{16,18,21,29,36,37}. The delivery of RPE is not trivial, and the field is divided on the most effective injection technique. The protocol we describe here is a simple and effective way to deliver of bolus of RPE cells subretinally, and was used in the first clinical trial for stem cell-derived RPE transplantation³¹. (The reader may also refer to another JoVE article by Eberle et al. for an alternative depiction of subretinal injections in rodents.³⁸)

The technique outlined in this manuscript cannot be visualized and trauma is unavoidable (as with any subretinal injection technique). It is performed by making a hole just under the limbus vessels and inserting a blunt needle along a transscleral route to inject a bolus of cells under the diametrically opposed retina. The person doing the injection will feel resistance as the blunt needle touches the retina. The cells may be directly visualized after the injection, however, and the degree of the induced retinal detachment can be determined by labeling the RPE cells with a transient fluorescent marker and detecting them with a confocal scanning ophthalmoscope (cSLO). An optical coherence tomography (OCT) system can also be used to monitor the trauma and easily identify the injection site.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Все животные были обработаны в соответствии с этическими принципами, установленными в научно-исследовательском институте Скриппса.

1. Подготовка материалов для инъекций (~ 20 мин)

1. Предварительно теплый раствор диссоциации клеток (предпочтительно тот, который инактивируется через разведении, а не с сывороткой), стерильной PBS и культуральные среды (таблица 1).
2. Стерилизацию шприц с тупой иглой путем разборки и кипячения части в воде в течение 15 мин.

2. Подготовка клетки ПЭС для инъекций (~ 30 мин до 1 ч)

1. Отделить ПЭС клеток с использованием предварительно нагретого раствора для диссоциации клеток в течение 5-8 мин при температуре 37 ° С.
2. Очистите клетки осторожно, чтобы освободить тех, которые были до сих пор прилагается.
3. Развести клетки с большим объемом культуральной среды (пополнить 15 мл трубки), чтобы инактивировать диссоциации решение и считать их.
4. Центрифуга при 800 х г в течение 5 мин для осаждения клеток.
5. Ресуспендируют клеток в 200 000 клеток / мкл (для доставки 100 000 клеток в объеме 0,5 мкл) в стерильной подогретого PBS и передавать их в 1,5 мл микроцентрифужных трубки.
6. При желании можно добавить живой клетке переходных флуоресцентный маркер и инкубировать при 37 ° С в течение 30-45 мин.
7. Загрузка шприц с тупой иглой с 0,5 мкл клеток. Вводить клетки как можно скорее.

3. Sub сетчатки инъекции (~ 5 мин на инъекций)

ПРИМЕЧАНИЕ: Если возможно, изучить технику со взрослыми белых крыс с лимба суда значительно легче визуализировать. Вводите Быстрый зеленый раствор при изучении (перед тем, как вводить клетки) до более упростить и ускорить визуализацию в месте инъекции.

1. Обезболить грызуна. Использование внутрибрюшинные инъекции 100 мг / мл кетамина и 10 мг / мл ксилазина (20 мкл / 10 г тела швосемь) изофлураном более ингаляции, поскольку трудно маневрировать грызуна и ввести в глаз с мордой в ингаляторе.
   1. Убедитесь, что животное глубоко под наркозом, зажимая одну из его лап. Если вздрагивает, подождите еще несколько минут и повторите попытку перед началом субретинальной инъекции.
2. Установите грызуна на бок, так что глаз, который будет введен сталкивается с потолка.
3. Под микроскопом рассекает мягко растянуть кожу так, глаз появляется немного вверх из гнезда (временное Экзофтальм) и становится более доступным, удерживая его голову двумя пальцами чуть выше уха и по его челюсти и аккуратно растянуть параллельно кожи на веки так что глаз появляется немного вверх из гнезда (Смотрите рисунок 1С). Не беритесь грызуна слишком близко к горлу.
4. С 30 соль-диез одноразового предварительно стерилизуют иглы, сделать отверстие непосредственно под лимба (если сосуды поражены, кровотечение бэлектронной значительным и это будет трудно найти отверстие позже) и под углом, чтобы не касаться объектива с иглой (рис 1D). Не прикасайтесь к линзам с острым (или тупой) иглой или формирования непосредственной катаракты произойдет.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Инъекции работать с двумя людьми лучше. Таким образом, один человек может пройти шприц с тупой иглой лицу, осуществляющему инъекции после того как они создали первое отверстие с резким одноразовой иглой, чтобы сохранить фокус на котором отверстие.
5. Уберите одноразовые острую иглу из глаз, сохраняя при этом сцепление на голове. Помните, именно там, где отверстие.
6. После завершения работы установки предварительно загруженных шприц с тупой иглой на микроманипулятора или держа его за руку, вставьте кончик шприца с тупой иглой через отверстие, заботясь снова не прикасайтесь к объективу и аккуратно нажмите на него через глаз не очень мягко, пока чувство сопротивления (рис 1D).
7. Кeeping все движения к минимуму, тщательно вводить клетки ПЭС медленно в субретинальной пространстве.
   ПРИМЕЧАНИЕ: НПП / отслойки сетчатки будет наводиться; это неизбежно. Тем не менее, чище впрыска минимизирует отряд и значительно повышает шансы на прикрепления (рис 1E). Любые преувеличенные движения могут переместить иглу обратно в сетчатке, и боковых движений может привести к повреждению сетчатки. Использование топливного насоса не является обязательным, но позволяет очень точной доставки.
8. Уберите шприц медленно. Применить глаз увлажнение падает держать глаз о водой.
9. Продолжайте следить за животное, пока он не восстановит грудины лежачее положение. Не оставляйте животное без присмотра или вернуться в клетку с другими оповещения животных, пока он вновь не грудины лежачее положение.

Результаты

Мы можем доставить суспензии клетках ПЭС в субретинальной пространстве грызунов быстро и последовательно, используя методику, описанную в этой рукописи. Хотя это и не требуется, травмы могут быть значительно минимизированы с помощью установки, показанной с микроманипулятором на ...

Обсуждение

В этой статье мы расскажем относительно простой способ для выполнения субретинальных инъекции ПЭС клеток в суспензии у крыс и мышей. Протокол проста в освоении и более опыт работы с техникой будет переводить в меньшем количестве травм (Рисунок 3, это является одним из лучших и?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoethanol (55 mM)	Gibco	21985-023	50 ml x 1
Cell Scapers	VWR	89260-222	Case x 1
CellTracker Green CMFDA	Molecular Probes	C34552	50 µg x 20
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190-144	500 ml x 1
Fast Green	Sigma-Aldrich	F7258	25 g x 1
Genteal Geldrops Moderate to Severe Lubricant Eye Drops	Walmart	4060941	25 ml x 1
Hamilton Model 62 RN SYR	Hamilton	87942	Syringe x 1
Hamilton Needle 33 G, 0.5", point 3 (304 stainless steel)	Hamilton	7803-05	Needles x 6
Knockout DMEM	Gibco	10829-018	500 ml x 1
KnockOut Serum Replacement	Gibco	10828-028	500 ml x 1
L-Glutamine 200 mM	Gibco	25030-081	100 ml x 1
Magnetic Stand	Leica Biosystems	39430216	Stand x 1
MEM Non-Essential Amino Acids Solution 100X	Gibco	11140-050	100 ml x 1
Micromanipulator	Leica Biosystems	3943001	Manipulator x 1
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)	Gibco	15140-122	100 ml x 1
Slip Tip Syringes without Needles BD  (3 ml)	VWR	BD309656	Pack x 1
Specialty-Use Needles BD  (30 G, 1")	VWR	BD305128	Box x 1
TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red	Gibco	12604013	100 ml x 1