ביצוע subretinal זריקות במכרסמים כדי לספק תאי הרשתית פיגמנט האפיתל בהשעיה

Summary

Here we present a community accepted protocol in multimedia format for subretinally injecting a bolus of RPE cells in rats and mice. This approach can be used for determining rescue potentials, safety profiles, and survival capacities of grafted RPE cells upon implantation in animal models of retinal degeneration.

Abstract

המרה של אור לדחפים חשמליים מתרחשת ברשתית החיצונית ומושגת בעיקר על ידי קולטני אור מוט וחרוט ואפיתל הפיגמנט ברשתית תאים (RPE). הרשתית לספק תמיכה קריטית לקולטניים אור ומוות או תפקוד לקוי של תאי הרשתית הוא אופייני של ניוון מקולרים הקשור לגיל (AMD), הגורם העיקרי לאיבוד ראייה קבוע באנשים בגיל 55 ומעלה. אמנם אין תרופה לAMD זוהתה, השתלה של הרשתית בריאה בעיניים חולות עשויה להיות טיפול יעיל, ומספר גדול של תאי הרשתית יכול להיות שנוצר בקלות מתאי גזע pluripotent. כמה שאלות מעניינות בנוגע לבטיחות והיעילות של משלוח תא הרשתית עדיין יכולות להיבחן במודלים של בעלי חיים, ופרוטוקולים מקובלים היטב המשמשים להזרקת הרשתית פותחו. הטכניקה המתוארת כאן נעשתה שימוש על ידי מספר קבוצות במחקרים שונים וכרוכה ביצירת חור בעין עם מחט חדה ראשונה. אז מזרק עם bluמחט NT עמוסה תאים מוכנסת דרך החור ועברה דרך הזגוגית עד שנוגע בעדינות ברשתית. שימוש בשיטת ההזרקה הזה, שהוא פשוט יחסית ודורש ציוד מינימאלי, אנחנו להשיג אינטגרציה של תאי הרשתית המופק מתאי גזע עקבית ויעילה בין הרשתית המארח המונעת כמות משמעותית של ניוון קולטי אור במודלים של בעלי חיים. אמנם לא חלק מהפרוטוקול בפועל, אנחנו גם מתארים כיצד לקבוע את היקף הטראומה הנגרמת על ידי ההזרקה, וכיצד לוודא שהתאים הוזרקו לתוך חלל subretinal באמצעות בשיטות ההדמיה vivo. לבסוף, השימוש בפרוטוקול זה אינו מוגבל לתאי הרשתית; זה יכול לשמש כדי להזריק כל מתחם או תא לחלל subretinal.

Introduction

The sensory retina is organized in functional tiers of neurons, glia, and endothelial cells. Photoreceptors at the back of the retina are activated by light; through phototransduction they convert photons into electrical signals that are refined by interneurons and transmitted to the visual cortex in the brain. Phototransduction cannot occur without the coordinated efforts of Mueller glia and retinal pigment epithelium (RPE) cells. RPE are organized in a monolayer directly behind the photoreceptors and perform multiple and diverse functions integral to photoreceptor function and homeostasis. In fact, RPE and photoreceptors are so co-dependent that they are considered to be one functional unit. Death or dysfunction of RPE results in devastating secondary effects on photoreceptors and is associated with age-related macular degeneration (AMD), the leading cause of blindness in the elderly^1,2.

While no cure has been discovered for AMD, several clinical studies have shown that RPE cell replacement may be a promising therapeutic option^3-13. With the advent of stem cell technology, it is now possible to generate large numbers of RPE cells in vitro from embryonic and induced pluripotent stem cells (hES and hiPS) that strongly resemble their somatic counterparts functionally and anatomically^14-26. Stem cell-derived RPE have also been shown to function in vivo by multiple independent groups, including our own, to significantly slow retinal degeneration in rat and mouse lines with spontaneous retinal degeneration^{16,18,21,22,25,28,29}. This combination of clinical and preclinical supporting evidence is so compelling that several clinical trials to prevent retinal degeneration using stem cell-derived RPE cells are now ongoing^30,31.

RPE can be readily derived from hES and/or hiPS and implanted in the subretinal space of rodents using various derivation and injection techniques^32,33. (See Westenskow et al. for a methods paper in multimedia format demonstrating the directed differentiation protocol we employ)³⁴. There are critical remaining questions regarding the safety, survival, and functional capacity of exogenously delivered RPE cells upon implantation, therefore the ability to perform subretinal injections in rodents is a critical skill^{16,18,21,29,36,37}. The delivery of RPE is not trivial, and the field is divided on the most effective injection technique. The protocol we describe here is a simple and effective way to deliver of bolus of RPE cells subretinally, and was used in the first clinical trial for stem cell-derived RPE transplantation³¹. (The reader may also refer to another JoVE article by Eberle et al. for an alternative depiction of subretinal injections in rodents.³⁸)

The technique outlined in this manuscript cannot be visualized and trauma is unavoidable (as with any subretinal injection technique). It is performed by making a hole just under the limbus vessels and inserting a blunt needle along a transscleral route to inject a bolus of cells under the diametrically opposed retina. The person doing the injection will feel resistance as the blunt needle touches the retina. The cells may be directly visualized after the injection, however, and the degree of the induced retinal detachment can be determined by labeling the RPE cells with a transient fluorescent marker and detecting them with a confocal scanning ophthalmoscope (cSLO). An optical coherence tomography (OCT) system can also be used to monitor the trauma and easily identify the injection site.

Protocol

הערה: טופלו כל בעלי החיים בהתאם לקווים המנחים האתיים שנקבעו על ידי מכון מחקר Scripps.

1. הכנת חומרים להזרקה (~ 20 דקות)

1. פתרון טרום חם תא דיסוציאציה (רצוי אחד שהוא מובטל באמצעות דילול, לא עם סרום), PBS סטרילי, ותקשורת ותרבות (טבלה 1).
2. לעקר את המזרק עם מחט בוטה על ידי הפירוק ורותח החלקים במים במשך 15 דקות.

2. הכנת תאי RPE להזרקה (~ 30 דקות עד 1 שעה)

1. לנתק את תאי RPE באמצעות פתרון תא דיסוציאציה מראש התחמם במשך 5-8 דקות על 37 מעלות צלזיוס.
2. לגרד את התאים בעדינות כדי לשחרר את כל שעדיין מחוברים.
3. לדלל את התאים עם נפח גדול של תקשורת והתרבות (למלא את צינור 15 מיליליטר) כדי להשבית את פתרון הניתוק ולספור אותם.
4. צנטריפוגה ב 800 XG במשך 5 דקות עד גלולה התאים.
5. Resuspend התאים ב 200,000 תאים / μl (כדי לספק 100,000 תאים בנפח 0.5 μl) בPBS מראש חימם סטרילי ולהעביר אותם לתוך צינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge.
6. לחלופין, להוסיף סמן ניאון חולף תא חי ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 30-45 דקות.
7. טען את המזרק עם מחט קהה עם 0.5 μl של תאים. להזריק את התאים בהקדם האפשרי.

3. הזרקה תת-רשתית (~ 5 דקות לכל הזרקה)

הערה: אם אפשר ללמוד, הטכניקה עם חולדות לבקן מבוגרות מאז כלי ימבוס הם הרבה יותר קלים לדמיין. הזרק פתרון ירוק מהיר כאשר למידה (לפני שתנסה להזריק תאים) כדי להקל על הדמיה של הזריקה בקלות רבה יותר.

1. להרדים את המכרסמים. השתמש בזריקות intraperitoneal של 100 מ"ג / מיליליטר קטמין ו -10 מ"ג / מיליליטר xylazine (20 μl / גוף g 10 wשמונה) על שאיפת isofluorane מכיוון שקשה לתמרן המכרסמים ולהזריק לתוך העין עם החוטם במשאף.
   1. ודא כי בעל החיים הוא בהרדמה עמוקה על ידי צובט אחת מכפותיו. אם זה נרתע, לחכות עוד כמה דקות ונסה שוב לפני תחילת הזרקת subretinal.
2. מקם את המכרסם על הצד שלה, כך שהעין שיהיה להזריק פונה לתקרה.
3. תחת מיקרוסקופ לנתח בעדינות למתוח את העור כל כך את העין קופצת מעט למעלה מהשקע (proptosis הזמני) והופכת לנגישים יותר במחזיק את הראש שלה עם שתי אצבעות מעל האוזן ועל ידי הלסת שלה ובעדינות למתוח את העור במקביל לעפעפיים כך שהעין קופצת מעט למעלה מהשקע (ראה איור 1 ג). לא לתפוס את המכרסם קרוב מדי לגרון.
4. עם מחט חד פעמי חד של 30 G-מעוקר מראש, לעשות חור מייד מתחת לימבוס (אם כלי פגעו, דימום יהיה בדואר משמעותי וזה יהיה קשה למצוא את החור בהמשך) ובזווית כדי להימנע מלגעת בעדשה עם המחט (1D איור). הימנע מלגעת בעדשה עם המחט החדה (או בוטה) או היווצרות קטרקט מיידית תתרחש.
   הערה: זריקות לעבוד טוב יותר עם שני אנשים. בדרך זו אדם אחד יכול לעבור את המזרק עם המחט הבוטה לאדם שבצע את הזריקה לאחר שיצר את החור הראשון עם מחט חד פעמי החד לשמור על מיקוד על שם החור הוא.
5. לחזור בו את המחט החדה פעמית מהעין, תוך שמירה על האחיזה בראש. זוכר בדיוק איפה החור הוא.
6. לאחר שתי הרכבה המזרק הטעון מראש עם מחט בוטה על micromanipulator או מחזיק אותו ביד, הכנס את הקצה של המזרק עם המחט הבוטה דרך החור, טיפול שוב לא לגעת בעדשה ובעדינות לדחוף אותו דרך העין מאוד בעדינות עד שההתנגדות מרגישה (1D איור).
7. Keeping כל התנועות למינימום, להזריק בזהירות את תאי RPE לאט אל תוך חלל subretinal.
   הערה: ניתוק הרשתית / רשתית יהיה המושרה; זה בלתי נמנע. עם זאת, הזרקת חומר ניקוי ממזערת את הניתוק ומשפרת באופן משמעותי את הסיכוי לחיבור מחדש (איור 1E). כל תנועות מוגזמות עלולות להזיז את המחט חזרה לתוך הרשתית, ותנועות לצדדים עלולות לגרום נזק לרשתית. השימוש במשאבת הזרקה הוא אופציונלית, אך מאפשר למסירה מדויקת מאוד.
8. לחזור בו מהמזרק באיטיות. החל לחות טיפות עיניים כדי לשמור על עין התייבשות.
9. תמשיך לעקוב אחר בעלי החיים עד שחוזר כיבה sternal. אל תשאיר חיה ללא השגחה או לחזור לכלוב עם בעלי חיים ערניים אחרים עד שחוזר כיבה sternal.

תוצאות

אנחנו יכולים לספק השעיה של תאי RPE לחלל subretinal של מכרסמים במהירות ובאופן עקבי באמצעות הטכניקה שתוארה בכתב היד הזה. אמנם לא נדרש, טראומות ניתן למזער באופן משמעותי באמצעות ההתקנה מוצגת עם micromanipulator באיור 1 א & B. החזק את המכרסם, כפי שמוצג באיור 1C לproptosis זמ...

Discussion

במאמר זה אנו מתארים שיטה פשוטה יחסית לביצוע זריקות subretinal של תאי הרשתית בהשעיה בחולדות ועכברים. הפרוטוקול הוא קל ללימוד וניסיון רב יותר עם ​​הטכניקה תהיה לתרגם בפחות טראומות (איור 3, ומייצג את אחת מהזריקות טובות יותר), במיוחד אם micromanipulator משמש (איור 1 א).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoethanol (55 mM)	Gibco	21985-023	50 ml x 1
Cell Scapers	VWR	89260-222	Case x 1
CellTracker Green CMFDA	Molecular Probes	C34552	50 µg x 20
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190-144	500 ml x 1
Fast Green	Sigma-Aldrich	F7258	25 g x 1
Genteal Geldrops Moderate to Severe Lubricant Eye Drops	Walmart	4060941	25 ml x 1
Hamilton Model 62 RN SYR	Hamilton	87942	Syringe x 1
Hamilton Needle 33 G, 0.5", point 3 (304 stainless steel)	Hamilton	7803-05	Needles x 6
Knockout DMEM	Gibco	10829-018	500 ml x 1
KnockOut Serum Replacement	Gibco	10828-028	500 ml x 1
L-Glutamine 200 mM	Gibco	25030-081	100 ml x 1
Magnetic Stand	Leica Biosystems	39430216	Stand x 1
MEM Non-Essential Amino Acids Solution 100X	Gibco	11140-050	100 ml x 1
Micromanipulator	Leica Biosystems	3943001	Manipulator x 1
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)	Gibco	15140-122	100 ml x 1
Slip Tip Syringes without Needles BD  (3 ml)	VWR	BD309656	Pack x 1
Specialty-Use Needles BD  (30 G, 1")	VWR	BD305128	Box x 1
TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red	Gibco	12604013	100 ml x 1