عزل وحقن في الوريد من الفئران نخاع العظام المستمدة حيدات

Summary

Here we present a protocol that generates large amounts of murine monocytes from heterogeneous bone marrow for translational applications. In comparison to others, this new method helps reduce the number of sacrificed animals and lowers costs by avoiding expensive methods such as high gradient magnetic cell separation (MACS).

Abstract

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of various fields in biomedical science. The method described below is a simple and effective way to isolate murine monocytes from heterogeneous bone marrow.

Bone marrow from the femur and tibia of Balb/c mice is harvested by flushing with phosphate buffered saline (PBS). Cell suspension is supplemented with macrophage-colony stimulating factor (M-CSF) and cultured on ultra-low attachment surfaces to avoid adhesion-triggered differentiation of monocytes. The properties and differentiation of monocytes are characterized at various intervals. Fluorescence activated cell sorting (FACS), with markers like CD11b, CD115, and F4/80, is used for phenotyping. At the end of cultivation, the suspension consists of 45%± 12% monocytes. By removing adhesive macrophages, the purity can be raised up to 86%± 6%. After the isolation, monocytes can be utilized in various ways, and one of the most effective and common methods for in vivo delivery is intravenous tail vein injection.

This technique of isolation and application is important for mouse model studies, especially in the fields of inflammation or immunology. Monocytes can also be used therapeutically in mouse disease models.

Introduction

The isolation of monocytes is important and critical for many in vitro and in vivo studies. These cells are targets for diseases such as peripheral arterial disease, coronary heart disease, or other ischemic diseases, since collateral vessel growth is strongly driven by local inflammation. Inflammatory responses include endothelial activation and local recruitment of leukocytes, mainly monocytes, which then mature to macrophages and create a highly arteriogenic environment by secreting multiple growth factors to induce the remodeling of an arteriole into a functional collateral artery^1-3. Monocytes also mature to dendritic cells, which are frequently used for immunological studies^4,5 and cancer research^6,7.

Problematic in the approach for monocyte isolation from peripheral blood⁸ is the high number of donor animals needed to produce a sufficient amount of monocytes for most analyses. Former protocols describe methods such as density gradient centrifugation and cell depletion via MACS⁹ when isolating monocytes; however, these techniques can alter the characteristics and functionality of monocytes which can lead to difficulties in interpretation^10,11. Moreover, these methods are difficult and can reduce experimental reproducibility.

Our aim with this protocol is to provide a simple and cost effective method to generate large amounts of bone marrow-derived monocytes. Due to the high cell yield of 11 x 10⁶ ± 3 x 10⁶ cells obtained by this protocol, we can substantially reduce the number of mice required during the isolation of bone marrow-derived monocytes. The procedure can be completed within a minimal amount of time, and without using expensive and complicated techniques as referenced above. Here, we extract monocytes from native bone marrow suspension of donor mice, cultivate the suspension on ultralow attachment plates, and supplement the solution with 20 ng/ml M-CFS. On day 5 of incubation, cells are harvested and characterized to confirm functional and phenotypic properties.

For experiments in the field of arteriogenesis, intravenous transplantation of these bone marrow-derived monocytes into mice is an effective method of systemic drug delivery, which can be combined with femoral artery ligation in common peripheral arterial disease models.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

وقد أجريت هذه الدراسة بإذن من الدولة من ولاية سكسونيا وسكسونيا-أنهالت، Regierungspraesidium درسدن / هال، وفقا للمادة 8 من القانون الألماني لحماية الحيوان (24D-9168،11-1 / 2008-24).

عزل خلية 1

1.1 إعداد عظم الفخذ والساق

1. تخدير الماوس باستخدام تركيز الأيزوفلورين 5٪ بواسطة تبخير الأيزوفلورين في صندوق مغلق. بعد الماوس قد توقفت عن الحركة لمدة 3 ثانية، تنفيذ خلع عنق الرحم.
2. تطهير أطرافه الخلفية مع الإيثانول (96٪). إزالة الجلد والعضلات والعظام فصل مع مشرط معقم.
   1. تبدأ مع شق الجلد الإربي، وتوسيع شق نحو الكعب الإنسي وإجراء تشريح دائرية من الجلد حول انخفاض في ربلة الساق. إزالة الجلد في الساقين بالكامل من قبل تقشير أنه قريب.
   2. فصل عضلة الفخذ من عظم الفخذ مع مشرط حاد، وإزالة كل من الشظوي الأماميوالجماعات عضلة الساق وdisarticulate الساق في مفصل الورك من خلال تحديد موقع وتشريح الأربطة.
   3. بدء الأمامية والمضي قدما حول المفصل عن طريق تناوب بعناية ساقه وtransecting الأربطة، وبالتالي disarticulating المفصل.
3. غسل عظم الفخذ والساق مع 96٪ من الإيثانول لمدة لا تقل عن 90 ثانية لضمان إعداد خلية العقيم. تستمر عملية الغسيل مع برنامج تلفزيوني العقيمة لشطف الإيثانول المتبقية.
   ملاحظة: يجب أن تكون جميع الخطوات اللاحقة معقمة لتجنب التلوث.

1.2 حصاد نخاع العظام

1. قطع نهاية القريبة والبعيدة كل العظم مع زوج من مقص غرامة للوصول إلى مهاوي الفخذ وعظام الساق. كن حذرا مع هذه الخطوة، لأن هذه العظام كسر بسهولة جدا.
2. مسح العظام مع المتوسط ​​الدافئة (M199 + 10٪ مصل العجل الجنين (FCS)، + 1٪ البنسلين / الستربتوميسين). استخدام معقم 28-G إبرة، حقنة 1 مل، وبين 10-15 مل لكل متوسطةالعظام لالشطف.
3. عقد العظام مع ملقط غرامة وشطف واحدا تلو الآخر حتى يتحول شبه شفافة. تطبيق بعناية لضغوط لنهاية المكبس حقنة من أجل تقليل الإجهاد الخلية.
4. تصفية نخاع العظام من خلال 70 ميكرومتر شبكة النايلون وجمع الراشح. لاستخراج الكمية القصوى من نخاع العظام، وشطف مرارا وتكرارا من نهايات القاصي والداني.
5. شطف غربال مع برنامج تلفزيوني وجمع الراشح. طرد بعناية الحطام والتكتلات الخلوية بواسطة التحريك لطيف وpipetting ل.

1.3 زراعة

1. الطرد المركزي تعليق خلية في 250 x ج لمدة 10 دقيقة في RT. تجاهل وطاف resuspend الخلايا مع ما يقرب من 25 مل من المتوسط. أكرر مرة واحدة.
2. resuspend الخلايا في 6 مل من المتوسط ​​بعد خطوة الغسيل الثانية. مزيج 50 ميكرولتر من الحل زنزانة مع 50 ميكرولتر من التريبان الأزرق. عدد الخلايا في غرفة الفرز تحت المجهر الضوئي. احسب عدد جells في الحل باستخدام هذه الصيغة:
   
3. البذور الخلايا على 6 جيدا لوحات سطح مرفق منخفضة للغاية لمنع التصاق دائم في الجزء السفلي من لوحة. استخدام تركيز 10 ⁶ خلايا لكل مل مع ما يصل الى 6 مل لكل بئر.
4. تكملة تعليق مع 20 نانوغرام / مل M-CSF لتعزيز تمايز الخلايا.
5. ثقافة الخلايا لمدة 5 أيام في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون ومراقبة يوميا.

1.4 حصاد الخلايا

ملاحظة: يجب أن يتم تنفيذ هذه الخطوات على الجليد. المضي قدما إما 1.4.1 أو 1.4.2 وفقا لذلك.

1. عند هذه النقطة، حصاد ثقافة بأكملها، بما في ذلك الضامة المتباينة التي ستلتزم الثقافة لوحات، حتى لو كانت لوحات سطح فائقة منخفضة المرفق.
   1. حصاد ثقافة كاملة من قبل pipetting لطيف وفصل بمحلول مكون من 4 ° C PBS، 0.5٪ ألبومين المصل البقري (BSA) و 2 ملي EDTA. كرر حتى لوحات واضحة ما تبقى من الخلايا الملتصقة - تأكيد تحت المجهر إذا لم تكن متأكدا.
2. بدلا من ذلك، تجاهل الضامة ملتصقة عن طريق حصاد طاف مع الخلايا في تعليق، والتي تحتوي في الغالب حيدات.
   1. حصاد الخلايا غير ملتصقة مع حل PBS خالية من EDTA و 0.5٪ BSA. لا تنطبق الكثير من القوة من أجل تجنب طرد الضامة ملتصقة أقل ما يقال.

1.5 FACS-تحليل (اختياري)

ملاحظة: من الممكن أن تستنفد تعليق خلية من خلايا CD117 ⁺ stem- والسلف عن طريق استخدام MACS. استخدام بروتوكولات الشركة المصنعة لهذا الإجراء.

1. حصاد الخلايا وفقا لخطوات إما 1.4.1 أو 1.4.2.
2. أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 250 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية، وتكرار هذه الخطوة مرة أخرى.
3. في resuspend 250،000 على الأقل الخلايا في 300 ميكرولتر من FACS بuffer في التحقيق.
4. نقل الحل خلية على 96-جيدا لوحة (30 ميكرولتر لكل بئر).
5. الطرد المركزي تعليق خلية في 250 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
6. إزالة طاف وإضافة 25 ميكرولتر من الأجسام المضادة إلى كل بئر (استخدام مصنع تمييع).
7. وصمة عار على الخلايا مع الأجسام المضادة (بعد بروتوكولات المصنعة للحصول على phenotyping الخلية بعد خطوات 1.5.1-1.5.6. وتشمل علامات يشيع استخدامها لتحديد الوحيدات / بلعم CD11b، F4 / 80 (الشكل 3)، CD115 (الشكل 2)، وGr- 1.
   ملاحظة: للحصول على وصف مزيد من الحلول المحمولة، ويوصى باستخدام علامات مثل CD4، CD8a، CD11c و، CD25، CD45، CD45R، CD62L، CD80، CD86، CD145، CD117، MHCⅡ، Ly6C، Ly6G، وCD192. تم الخصائص الخلوية ووصف سابقا ^12.
8. احتضان تحقيقات لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية.
9. الطرد المركزي تحقيقات في 250 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية و resuspend مع 200 ميكرولتر من العازلة FACS. تكرار عشرهو خطوة مرتين.
10. نقل تحقيقات في أنابيب FACS وإجراء تحليل FACS ^12.
11. لتحليل FACS ¹² يوم 0 و 3 و 5 لتحليل تمايز الخلايا.

2. الذيل الوريد حقن

2.1 إعداد

1. تدفئة الحيوانات على لوحة التدفئة على 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. مراقبة الحيوانات في حين أن ارتفاع درجات الحرارة إلى التعرف على علامات الانهاك.
2. Resuspend وحيدات، معزولة في الخطوات 1.1- 1.4، في 150 ميكرولتر من كلوريد الصوديوم، وتحميل الخلايا في حقنة 1 مل الأنسولين بإبرة 30G. دوامة بخفة الحل قبل تحميل حقنة لضمان يتم حقن كل حيدات. التعامل دائما الخلايا على الجليد لتجنب التعلق بوساطة الحرارة وتفعيل حيدات.

2.2 الزجرية

1. تجنب إزعاج الفئران الأخرى في القفص عند اختيار الماوس للحقن في الوريد.
2. ضع الماوس في رادع. تجنب الكثير من العلاقات العامةessure ويكون حذرا مع الأطراف الخلفية. (الشكل 4)
   ملاحظة: بدلا من ذلك، استخدم التخدير العام لضمان معالجة الإجهاد خالية من الحيوانات.
3. تأكد من أن الفأر لديه مساحة للتنفس قبل أن يغلق رادع.

2.3 حقن

1. تطهير مكان الحقن مع وكيل التطهير. رش على ذيل الماوس واسمحوا الوقوف لمدة 1 دقيقة على الأقل.
2. وقف تدفق الدم الوريدي من الذيل من خلال تطبيق ضغط لطيف على الجانب الذيل الأفقي فوق موقع الحقن، لتحسين الرؤية من الأوردة.
3. تحويل الذيل 90 درجة، قبل الحقن. (الشكل 5)
4. حقن في زاوية 45 درجة. حقن ببطء وليس أكثر من 5 غ لكل ميكرولتر لتجنب إيذاء الحيوانات.
5. إذا كان هناك نفطة، وهو علامة على وجود حقن فشلت، والتوقف فورا عن تكرار الحقن أكثر قريب.
6. وقف النزيف في الجانب حقن عن طريق تطبيق ع لطيفressure لمدة 1 دقيقة.
7. في نهاية هذا الإجراء، فتح ضام ووضع الماوس في قفصه.
8. مراقبة الماوس لمدة 20 دقيقة لضمان أن الحيوان لم تتضرر من الحقن ويتم الحفاظ الاستلقاء القصية. تمديد وقت الرصد حتى يستعيد وعيه الماوس كافية. العودة الماوس للشركة من الحيوانات الأخرى إلا بعد أن تعافى تماما.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

حل الخلية المستخرجة من نخاع عظام الفئران يتكون من أنواع الخلايا المختلفة. أنواع الخلايا الرئيسية هي اللمفاويات، وحيدات والمحببة. ويمكن تقدير أنواع الخلايا حسب الحجم وتحبب، والذي يظهر في الشكل رقم 1 لكلا تعليق الأم والخلايا تحصد بعد 5 أيام من التمايز. ملاحظة ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

نحن تصف طريقة بسيطة وفعالة من حيث التكلفة لعزل كميات كبيرة من وحيدات الفئران من نخاع العظام. بالمقارنة مع غيرها من البروتوكولات باستخدام الدم المحيطي، التي تحصل على عائدات الوحيدات ⁵ من 1.4 X10 ^6، ونحن قادرون على الحصول على عائدات أعلى من 11 × 10 ⁶ ± 3 × 10

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well-ultra-low-attachment plate	Corning Incorporated, NY, USA		6-well-ultra-low-attachment plate, with cap, sterile
8- 12 week old, male, balb/c mice	Charles River, Sulzfeld, Germany
96-well-plate	Greiner bio one GmbH, Frickenhausen, Germany
Blue dead cell stain	Life technologies GmbH, Darmstadt, Germany
Bovine serum albumine	GE Healthcare, Freiburg, Germany		Fraction V, pH 7.0
Canules	B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany		28G, 30G
CD115	eBioscience, San Diego, USA	12-1152
CD11b	eBioscience, San Diego, USA	53-0112
Cell culture dish	Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany		With cap, steril
Centrifuge	Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Germany		Allegra® X-15R centrifuge
Depilatory cream	Veet, Mannheim, Germany
Disinfection agent	Schülke&Mayr GmbH, Norderstedt, Germany		Kodan Tinktur forte
Disposable scalpel No.10	Feather safety razor Co.Ltd, Osaka, Japan
EDTA	Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Ethanol 96%	Otto Fischar GmbH und Co KG, Saarbrücken, Germany
Extraction unit Pipetus	Hirschmann Laborgeräte GmbH & Co.KG, Eberstadt, Germany
F4/80	AbD Serotec, Düsseldorf, Germany	MCA497APC
FACS buffer	Manufactured by our group with single components		PBS, 0.5% BSA, 0.1% NaN3
FACS device	Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA		BD FACS Canto II
FACS tubes	Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA
Falcon® pipette	Becton Dickenson Labware, NY, USA
Fetal calf serum	Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Fine forceps	Rubis, Stabio, Switzerland
Gloves	Rösner-Matby Meditrade GmbH, Kiefersfelden, Germany
Gr1	eBioscience, San Diego, USA	53-5931
Heating plate	Labotect GmbH, Göttingen, Germany		Hot Plate 062
Incubator	Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Germany		Incu safe
Isofluran	Baxter Deutschland GmbH, Unterschleißheim, Germany
Light microscope	Carl Zeiss SMT GmbH, Oberkochen, Germany		Axiovert 40 °C
Macrophage-Colony Stimulating Factor	Sigma Aldrich, Hamburg, Germany	SRP3110
Mechanical shaker	IKA, Staufen, Germany		ms2 minishaker
Medium 199	PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria		Warm in 37 °C water bath before use
Micro test tubes	Eppendorf AG, Hamburg, Germany
Microbiological work bench	Thermo Electron, LED GmbH, Langenselbold, Germany		Hera safe
Monocyte wash buffer	Manufactured by our group with single components		PBS, 0.5% BSA, 2 mM EDTA
Mouse restrainer	Various
NaCl	Berlin Chemie AG, Berlin, Germany
NaN3 (sodium acide)	Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Neubauer counting chamber	Paul Marienfeld GmbH und Co.KG, Lauda-Königshofen, Germany
Nylon cellsieve	Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA		Cell strainer, 70 µm mesh size
Penicillin/Streptomycin	Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Phosphate buffered saline	Life technologies GmbH, Darmstadt, Germany		pH 7.4, sterile
Pipettes	Eppendorf AG, Hamburg, Germany		10µl/100µl/200µl/1,000µl
Pipetting heads	Eppendorf AG, Hamburg, Germany
Serological pipette	Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany		Cellstar 5 ml, 10 ml
Suction unit	Integra bioscience, Fernwald, Germany		Vacusafe comfort
Surgical scissors	Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA
Syringe	B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany		1 ml Omnifix® -F insuline syringe
Tubes with cap	Greiner bio one GmbH, Frickenhausen, Germany		15 ml/50 ml Cellstar tubes
Warm water bath	Julabo Labortechnik GmbH, Seelbach, Germany		Julabo SW22