Isolamento e iniezione endovenosa di Murine derivate dal midollo osseo monociti

Riepilogo

Here we present a protocol that generates large amounts of murine monocytes from heterogeneous bone marrow for translational applications. In comparison to others, this new method helps reduce the number of sacrificed animals and lowers costs by avoiding expensive methods such as high gradient magnetic cell separation (MACS).

Abstract

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of various fields in biomedical science. The method described below is a simple and effective way to isolate murine monocytes from heterogeneous bone marrow.

Bone marrow from the femur and tibia of Balb/c mice is harvested by flushing with phosphate buffered saline (PBS). Cell suspension is supplemented with macrophage-colony stimulating factor (M-CSF) and cultured on ultra-low attachment surfaces to avoid adhesion-triggered differentiation of monocytes. The properties and differentiation of monocytes are characterized at various intervals. Fluorescence activated cell sorting (FACS), with markers like CD11b, CD115, and F4/80, is used for phenotyping. At the end of cultivation, the suspension consists of 45%± 12% monocytes. By removing adhesive macrophages, the purity can be raised up to 86%± 6%. After the isolation, monocytes can be utilized in various ways, and one of the most effective and common methods for in vivo delivery is intravenous tail vein injection.

This technique of isolation and application is important for mouse model studies, especially in the fields of inflammation or immunology. Monocytes can also be used therapeutically in mouse disease models.

Introduzione

The isolation of monocytes is important and critical for many in vitro and in vivo studies. These cells are targets for diseases such as peripheral arterial disease, coronary heart disease, or other ischemic diseases, since collateral vessel growth is strongly driven by local inflammation. Inflammatory responses include endothelial activation and local recruitment of leukocytes, mainly monocytes, which then mature to macrophages and create a highly arteriogenic environment by secreting multiple growth factors to induce the remodeling of an arteriole into a functional collateral artery^1-3. Monocytes also mature to dendritic cells, which are frequently used for immunological studies^4,5 and cancer research^6,7.

Problematic in the approach for monocyte isolation from peripheral blood⁸ is the high number of donor animals needed to produce a sufficient amount of monocytes for most analyses. Former protocols describe methods such as density gradient centrifugation and cell depletion via MACS⁹ when isolating monocytes; however, these techniques can alter the characteristics and functionality of monocytes which can lead to difficulties in interpretation^10,11. Moreover, these methods are difficult and can reduce experimental reproducibility.

Our aim with this protocol is to provide a simple and cost effective method to generate large amounts of bone marrow-derived monocytes. Due to the high cell yield of 11 x 10⁶ ± 3 x 10⁶ cells obtained by this protocol, we can substantially reduce the number of mice required during the isolation of bone marrow-derived monocytes. The procedure can be completed within a minimal amount of time, and without using expensive and complicated techniques as referenced above. Here, we extract monocytes from native bone marrow suspension of donor mice, cultivate the suspension on ultralow attachment plates, and supplement the solution with 20 ng/ml M-CFS. On day 5 of incubation, cells are harvested and characterized to confirm functional and phenotypic properties.

For experiments in the field of arteriogenesis, intravenous transplantation of these bone marrow-derived monocytes into mice is an effective method of systemic drug delivery, which can be combined with femoral artery ligation in common peripheral arterial disease models.

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Protocollo

Questo studio è stato condotto con il permesso dello Stato della Sassonia e della Sassonia-Anhalt, Regierungspraesidium Dresden / Halle, secondo la sezione 8 della legge tedesca per la protezione degli animali (24D-9168,11-1 / 2008-24).

Isolation 1 Cella

1.1 Preparazione di femore e tibia

1. Anestetizzare il mouse utilizzando una concentrazione di isoflurano 5% vaporizzando isoflurano in un contenitore chiuso. Dopo che il mouse ha smesso di muoversi per 3 secondi, eseguire la dislocazione cervicale.
2. Disinfettare arti posteriori con etanolo (96%). Togliere la pelle e muscoli e separare le ossa con un bisturi sterile.
   1. Inizia con una incisione cutanea inguinale, ed estendere l'incisione verso il malleolo mediale ed eseguire una dissezione circolare della pelle intorno al polpaccio inferiore. Togliere la pelle delle gambe completamente peeling prossimale.
   2. Staccare il muscolo quadricipite dal femore con un bisturi affilato, rimuovere entrambi i peroneo anterioreei gruppi muscolo gastrocnemio e disarticolare la gamba alla articolazione dell'anca individuando e dissezione dei legamenti.
   3. Inizia anteriormente e procedere intorno all'articolazione ruotando con cura la gamba e sezionare i legamenti, disarticolare quindi l'articolazione.
3. Lavare femore e tibia con etanolo al 96% per un minimo di 90 sec per garantire preparazione cellulare asettica. Continua il processo di lavaggio con PBS sterile per risciacquare l'etanolo residuo.
   Nota: Tutti i passi successivi devono essere sterile per evitare contaminazioni.

1.2 La raccolta di midollo osseo

1. Tagliare l'estremità prossimale e distale di ciascun osso con un paio di forbici sottili per accedere agli alberi femorale e tibiale. Fate attenzione con questo passo, dal momento che queste ossa si rompono molto facilmente.
2. Lavare le ossa con supporto caldo (M199 + 10% di siero fetale bovino (FCS), + 1% penicillina / streptomicina). Utilizzare un ago sterile 28-G, una siringa da 1 ml, e tra 10-15 ml di mezzo perosso per il risciacquo.
3. Tenere l'osso con una pinza sottile e risciacquare uno per uno fino a quando non diventa semi-trasparente. Applicare con attenzione la pressione all'estremità dello stantuffo della siringa in modo da minimizzare lo stress cellulare.
4. Filtrare il midollo osseo attraverso un 70 micron nylon web e raccogliere il filtrato. Per estrarre la quantità massima di midollo osseo, lavare ripetutamente dalle estremità distali e prossimali.
5. Sciacquare il setaccio con PBS e raccogliere il filtrato. Rimuovere con cautela i detriti e conglomerati cellulari di blanda agitazione e pipettaggio.

1.3 Coltivazione

1. Centrifugare la sospensione cellulare a 250 xg per 10 min a RT. Eliminare il surnatante e risospendere le cellule con circa 25 ml di terreno. Ripetere una volta.
2. Risospendere le cellule in 6 ml di terreno dopo la seconda fase di lavaggio. Mescolare 50 ml di soluzione di cellule con 50 ml di trypan blu. Contare le cellule in una camera di conteggio al microscopio ottico. Calcolare il numero di cells nella soluzione con questa formula:
   
3. Seme le cellule su piastre di superficie ultra-bassa fissaggio 6 pozzetti per prevenire l'adesione permanente al fondo della piastra. Utilizzare una concentrazione di 10 ⁶ cellule per ml con fino a 6 ml per pozzetto.
4. Supplemento la sospensione con 20 ng / ml M-CSF per promuovere la differenziazione delle cellule.
5. Coltivare le cellule per 5 giorni a 37 ° C e 5% di anidride carbonica e di osservare tutti i giorni.

1.4 La raccolta di cellule

Nota: Queste procedure devono essere eseguite su ghiaccio. Procedere con o 1.4.1 o 1.4.2 di conseguenza.

1. A questo punto, raccogliere tutta la cultura, tra cui i macrofagi differenziati che aderiranno alla cultura-piastre, anche se sono lastre di superficie ultra-low-attaccamento.
   1. Raccolto l'intera cultura delicatamente pipettando e staccare con una soluzione di 4 ° C PBS, 0,5% di albumina sierica bovina (BSA) e 2 mM EDTA. Ripetere fino a quando le piastre sono chiare di rimanere cellule aderenti - confermano al microscopio in caso di incertezza.
2. In alternativa, scartare macrofagi aderenti raccogliendo il surnatante con le cellule in sospensione, che contengono prevalentemente monociti.
   1. Raccogliere le cellule non aderenti con una soluzione di PBS senza EDTA e 0,5% BSA. Non applicare troppa forza per evitare di spostare leggermente macrofagi aderenti.

1.5 FACS-Analysis (Opzionale)

Nota: È possibile esaurire la sospensione cellulare di cellule progenitrici essendo soggetti a regimi e CD117 ⁺ dall'uso di MACS. Utilizzare protocolli produttore per questa procedura.

1. Raccogliere le cellule in base a uno i punti 1.4.1 e 1.4.2.
2. Centrifugare le cellule a 250 xg per 10 min a 4 ° C e ripetere questo passo.
3. Risospendere almeno 250.000 cellule in 300 ml di FACS bUffer per sonda.
4. Trasferire la soluzione di cellule su un 96-pozzetti-(30 microlitri per pozzetto).
5. Centrifugare la sospensione cellulare a 250 xg per 5 minuti a 4 ° C.
6. Rimuovere il surnatante e aggiungere 25 ml di anticorpi ad ogni pozzetto (diluizione usare produttore).
7. Colorare le cellule con anticorpi (seguenti protocolli produttore per fenotipizzazione cellulare dopo passaggi 1.5.1-1.5.6. Marker comunemente usati per l'identificazione dei monociti / macrofagi includono CD11b, F4 / 80 (figura 3), CD115 (figura 2), e Gr- 1.
   Nota: Per una descrizione più dettagliata delle soluzioni cellulari, si consiglia l'uso di marcatori come CD4, CD8a, CD11c, CD25, CD45, CD45R, CD62L, CD80, CD86, CD145, CD117, MHCⅡ, Ly6C, Ly6G, e CD192. Caratteristiche cellulari sono stati precedentemente descritti ^12.
8. Incubare le sonde per 20 min a 4 ° C.
9. Centrifugare le sonde a 250 xg per 5 minuti a 4 ° C e risospendere con 200 microlitri di tampone FACS. Ripetere thè un passo due volte.
10. Trasferire le sonde in tubi FACS ed eseguire l'analisi FACS ^12.
11. Eseguire analisi FACS ¹² al giorno 0, 3 e 5 per analizzare la differenziazione cellulare.

2. Tail Vein Injection

2.1 Preparazione

1. Riscaldare gli animali su una piastra riscaldante a 37 ° C per circa 10 min. Osservare gli animali, mentre il riscaldamento a riconoscere i segni di surriscaldamento.
2. Risospendere i monociti, isolati in passaggi 1.1- 1.4, in 150 ml di NaCl, e caricare le cellule in una siringa da 1 ml di insulina con un ago 30G. Leggermente agitare la soluzione prima di caricare la siringa per assicurare tutti i monociti vengono iniettati. Maneggiare sempre le cellule in ghiaccio per evitare l'attaccamento calore mediata e l'attivazione dei monociti.

2.2 Trattenere

1. Evitare di disturbare gli altri topi in gabbia quando si sceglie un mouse per iniezione endovenosa.
2. Posizionare il mouse il limitatore. Evitare troppo prEssure e stare attenti con gli arti posteriori. (Figura 4)
   Nota: In alternativa, utilizzare l'anestesia generale per garantire stress accudimento degli animali.
3. Assicurarsi che il mouse ha spazio per respirare prima di chiudere il limitatore.

2.3 Iniezione

1. Disinfettare il sito di iniezione con disinfettante. Spruzzare sulla coda del mouse e lasciate riposare per almeno 1 min.
2. Interrompere il flusso di sangue venoso della coda, applicando una leggera pressione sul lato coda laterale sopra il sito di iniezione, per una migliore visibilità delle vene.
3. Girare la coda di 90 gradi, prima dell'iniezione. (Figura 5)
4. Iniettare un angolo di 45 gradi. Iniettare lentamente e non più di 5 ml per g di evitare gli animali danneggiare.
5. Se c'è una bolla, che è un segno di una iniezione fallito, interrompere immediatamente e ripetere l'iniezione più prossimale.
6. Fermare l'emorragia sul lato iniezione applicando dolce pressione per circa 1 min.
7. Al termine della procedura, aprire riavvolgitore e posizionare il mouse nella gabbia.
8. Osservare il mouse per 20 minuti al fine di garantire che l'animale non è stato danneggiato da iniezione e decubito sternale è mantenuta. Estendere il tempo di osservazione fino a quando il mouse riprende conoscenza sufficiente. Ritorna il mouse per la compagnia di altri animali solo dopo che ha pienamente recuperato.

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Risultati

La soluzione di cellule estratte dal midollo osseo murino costituito da vari tipi di cellule. I principali tipi di cellule sono linfociti, granulociti e monociti. Le cellule possono essere stimati in base alle dimensioni e granularità, che è mostrato in Figura 1 per entrambe le sospensioni nativi e cellule raccolte dopo 5 giorni di differenziazione. Si noti la composizione cellulare spostamento durante la coltivazione. Tuttavia, la classificazione accurata delle popolazioni deve poter contare su espre...

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Discussione

Descriviamo un metodo semplice e conveniente per isolare grandi quantità di monociti murini da midollo osseo. In confronto ad altri protocolli che utilizzano sangue periferico, che ottengono rendimenti monociti ⁵ su 1.4 x10 ^6, siamo in grado di ottenere rendimenti più elevati di 11 x 10 ⁶ ± 3 x 10 ⁶ monociti da un singolo mouse donatore.

Quando si considera sfide con questo metodo, è importante ricordare la possibilità di contaminazione quando...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well-ultra-low-attachment plate	Corning Incorporated, NY, USA		6-well-ultra-low-attachment plate, with cap, sterile
8- 12 week old, male, balb/c mice	Charles River, Sulzfeld, Germany
96-well-plate	Greiner bio one GmbH, Frickenhausen, Germany
Blue dead cell stain	Life technologies GmbH, Darmstadt, Germany
Bovine serum albumine	GE Healthcare, Freiburg, Germany		Fraction V, pH 7.0
Canules	B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany		28G, 30G
CD115	eBioscience, San Diego, USA	12-1152
CD11b	eBioscience, San Diego, USA	53-0112
Cell culture dish	Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany		With cap, steril
Centrifuge	Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Germany		Allegra® X-15R centrifuge
Depilatory cream	Veet, Mannheim, Germany
Disinfection agent	Schülke&Mayr GmbH, Norderstedt, Germany		Kodan Tinktur forte
Disposable scalpel No.10	Feather safety razor Co.Ltd, Osaka, Japan
EDTA	Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Ethanol 96%	Otto Fischar GmbH und Co KG, Saarbrücken, Germany
Extraction unit Pipetus	Hirschmann Laborgeräte GmbH & Co.KG, Eberstadt, Germany
F4/80	AbD Serotec, Düsseldorf, Germany	MCA497APC
FACS buffer	Manufactured by our group with single components		PBS, 0.5% BSA, 0.1% NaN3
FACS device	Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA		BD FACS Canto II
FACS tubes	Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA
Falcon® pipette	Becton Dickenson Labware, NY, USA
Fetal calf serum	Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Fine forceps	Rubis, Stabio, Switzerland
Gloves	Rösner-Matby Meditrade GmbH, Kiefersfelden, Germany
Gr1	eBioscience, San Diego, USA	53-5931
Heating plate	Labotect GmbH, Göttingen, Germany		Hot Plate 062
Incubator	Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Germany		Incu safe
Isofluran	Baxter Deutschland GmbH, Unterschleißheim, Germany
Light microscope	Carl Zeiss SMT GmbH, Oberkochen, Germany		Axiovert 40 °C
Macrophage-Colony Stimulating Factor	Sigma Aldrich, Hamburg, Germany	SRP3110
Mechanical shaker	IKA, Staufen, Germany		ms2 minishaker
Medium 199	PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria		Warm in 37 °C water bath before use
Micro test tubes	Eppendorf AG, Hamburg, Germany
Microbiological work bench	Thermo Electron, LED GmbH, Langenselbold, Germany		Hera safe
Monocyte wash buffer	Manufactured by our group with single components		PBS, 0.5% BSA, 2 mM EDTA
Mouse restrainer	Various
NaCl	Berlin Chemie AG, Berlin, Germany
NaN3 (sodium acide)	Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Neubauer counting chamber	Paul Marienfeld GmbH und Co.KG, Lauda-Königshofen, Germany
Nylon cellsieve	Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA		Cell strainer, 70 µm mesh size
Penicillin/Streptomycin	Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Phosphate buffered saline	Life technologies GmbH, Darmstadt, Germany		pH 7.4, sterile
Pipettes	Eppendorf AG, Hamburg, Germany		10µl/100µl/200µl/1,000µl
Pipetting heads	Eppendorf AG, Hamburg, Germany
Serological pipette	Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany		Cellstar 5 ml, 10 ml
Suction unit	Integra bioscience, Fernwald, Germany		Vacusafe comfort
Surgical scissors	Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA
Syringe	B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany		1 ml Omnifix® -F insuline syringe
Tubes with cap	Greiner bio one GmbH, Frickenhausen, Germany		15 ml/50 ml Cellstar tubes
Warm water bath	Julabo Labortechnik GmbH, Seelbach, Germany		Julabo SW22