Isolierung und intravenöse Injektion von Maus-Knochenmark stammenden Monozyten

Zusammenfassung

Here we present a protocol that generates large amounts of murine monocytes from heterogeneous bone marrow for translational applications. In comparison to others, this new method helps reduce the number of sacrificed animals and lowers costs by avoiding expensive methods such as high gradient magnetic cell separation (MACS).

Zusammenfassung

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of various fields in biomedical science. The method described below is a simple and effective way to isolate murine monocytes from heterogeneous bone marrow.

Bone marrow from the femur and tibia of Balb/c mice is harvested by flushing with phosphate buffered saline (PBS). Cell suspension is supplemented with macrophage-colony stimulating factor (M-CSF) and cultured on ultra-low attachment surfaces to avoid adhesion-triggered differentiation of monocytes. The properties and differentiation of monocytes are characterized at various intervals. Fluorescence activated cell sorting (FACS), with markers like CD11b, CD115, and F4/80, is used for phenotyping. At the end of cultivation, the suspension consists of 45%± 12% monocytes. By removing adhesive macrophages, the purity can be raised up to 86%± 6%. After the isolation, monocytes can be utilized in various ways, and one of the most effective and common methods for in vivo delivery is intravenous tail vein injection.

This technique of isolation and application is important for mouse model studies, especially in the fields of inflammation or immunology. Monocytes can also be used therapeutically in mouse disease models.

Einleitung

The isolation of monocytes is important and critical for many in vitro and in vivo studies. These cells are targets for diseases such as peripheral arterial disease, coronary heart disease, or other ischemic diseases, since collateral vessel growth is strongly driven by local inflammation. Inflammatory responses include endothelial activation and local recruitment of leukocytes, mainly monocytes, which then mature to macrophages and create a highly arteriogenic environment by secreting multiple growth factors to induce the remodeling of an arteriole into a functional collateral artery^1-3. Monocytes also mature to dendritic cells, which are frequently used for immunological studies^4,5 and cancer research^6,7.

Problematic in the approach for monocyte isolation from peripheral blood⁸ is the high number of donor animals needed to produce a sufficient amount of monocytes for most analyses. Former protocols describe methods such as density gradient centrifugation and cell depletion via MACS⁹ when isolating monocytes; however, these techniques can alter the characteristics and functionality of monocytes which can lead to difficulties in interpretation^10,11. Moreover, these methods are difficult and can reduce experimental reproducibility.

Our aim with this protocol is to provide a simple and cost effective method to generate large amounts of bone marrow-derived monocytes. Due to the high cell yield of 11 x 10⁶ ± 3 x 10⁶ cells obtained by this protocol, we can substantially reduce the number of mice required during the isolation of bone marrow-derived monocytes. The procedure can be completed within a minimal amount of time, and without using expensive and complicated techniques as referenced above. Here, we extract monocytes from native bone marrow suspension of donor mice, cultivate the suspension on ultralow attachment plates, and supplement the solution with 20 ng/ml M-CFS. On day 5 of incubation, cells are harvested and characterized to confirm functional and phenotypic properties.

For experiments in the field of arteriogenesis, intravenous transplantation of these bone marrow-derived monocytes into mice is an effective method of systemic drug delivery, which can be combined with femoral artery ligation in common peripheral arterial disease models.

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Protokoll

Diese Studie wurde mit Genehmigung des Landes Sachsen und Sachsen-Anhalt, Regierungspräsidium Dresden / Halle durchgeführt werden, nach § 8 des Gesetzes für den Tierschutz (24D-9168,11-1 / 2008-24).

1 Zellisolation

1.1 Herstellung von Ober- und Unterschenkel

1. Anesthetize der Maus unter Verwendung einer 5% Isofluran Konzentration durch Verdampfen von Isofluran in einem geschlossenen Behälter. Wenn sich die Maus nicht mehr bewegt für 3 Sekunden, führen Sie den Genickbruch.
2. Desinfizieren Sie die Hinterbeine mit Ethanol (96%). Haut und Muskeln entfernen und trennen Sie die Knochen mit einem sterilen Skalpell.
   1. Beginnen Sie mit einem Leistenhautschnitt, und verlängern die Inzision in Richtung der Innenknöchel und die eine Kreis Präparation der Haut um den Unterschenkel. Entfernen Sie die Haut der Beine vollständig durch Abziehen es proximal.
   2. Nehmen Sie den Quadrizeps vom Femur mit einem scharfen Skalpell entfernen sowohl die vorderen peroneusund die Wadenmuskelgruppen und desartikulieren das Bein im Hüftgelenk durch die Anordnung und sezieren die Bänder.
   3. Starten Sie nach vorne und fahren rund um das Gelenk durch vorsichtiges Drehen des Beins und Durchschneiden der Bänder, wodurch der gemeinsame disarticulating.
3. Waschen Femur und Tibia mit 96% Ethanol für ein Minimum von 90 Sekunden auf eine aseptische Zellpräparation zu gewährleisten. Fahren Sie mit der Waschprozess mit sterilem PBS abzuspülen restliche Ethanol.
   Hinweis: Alle nachfolgenden Schritte müssen steril zur Vermeidung von Verunreinigungen sein.

1.2 Ernte von Knochenmark

1. Schneiden Sie das proximale und distale Ende jedes Knochens mit einer feinen Schere, um den Zugriff auf die Ober- und Unterschenkelwellen zu gewinnen. Seien Sie vorsichtig mit diesem Schritt, da diese Knochen sehr leicht brechen.
2. Spülen die Knochen mit warmem Medium (M199 + 10% fötales Kälberserum (FCS) + 1% Penicillin / Streptomycin). Verwenden Sie eine sterile 28-G-Nadel, eine 1-ml-Spritze und zwischen 10 bis 15 ml Medium proKnochen zum Spülen.
3. Halten Sie die Knochen mit einer feinen Pinzette und spülen Sie eins nach dem anderen, bis sie halbdurchscheinend macht. Druck vorsichtig auf das Ende des Spritzenkolbens anwenden, um die Zellspannung zu minimieren.
4. Filtern Sie das Knochenmark durch einen 70 & mgr; m Nylon-Web und sammeln das Filtrat. Um die maximale Menge an Knochenmarkextrakt wiederholt gründlich von den distalen und proximalen Enden.
5. Spülen Sie das Sieb mit PBS und sammeln das Filtrat. Vorsichtig zu entfernen Schmutz und Zellkonglomerate durch leichtes Rühren und Pipettieren.

1.3 Anbau

1. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 250 · g für 10 min bei RT. Überstand verwerfen und die Zellen resuspendieren mit etwa 25 ml Medium. Wiederholen Sie einmal.
2. Die Zellen in 6 ml Medium nach der zweiten Waschstufe. Mischungs 50 ul der Zell-Lösung mit 50 ul Trypanblau. Zählen Sie die Zellen in einer Zählkammer unter einem Lichtmikroskop. Berechnung der Anzahl von cEllen in der Lösung mit dieser Formel:
   
3. Seed die Zellen auf 6-Well-Ultra-Low-Befestigungsfläche Platten dauerhafte Haftung an der Unterseite der Platte zu verhindern. Verwenden Sie eine Konzentration von 10 ⁶ Zellen pro ml mit bis zu 6 ml pro Vertiefung.
4. Ergänzen Sie die Suspension mit 20 ng / ml M-CSF auf die Zelldifferenzierung fördern.
5. Kultur die Zellen für 5 Tage bei 37 ° C und 5% Kohlendioxid und beobachten täglich.

1.4 Die Ernte der Zellen

Hinweis: Diese Schritte sollten auf Eis durchgeführt werden. Gehen Sie entweder mit 1.4.1 oder 1.4.2 entsprechend.

1. Zu diesem Zeitpunkt ernten die gesamte Kultur, einschließlich differenzierter Makrophagen, die zu den Kulturplatten haftet, auch wenn sie ultra-low-Befestigungsfläche Platten.
   1. Ernte der gesamten Kultur durch vorsichtiges Pipettieren und Abnehmen mit einer Lösung von 4 ° C PBS, 0,5% Rinderserumalbumin (BSA) und 2 mM EDTA. Wiederholen, bis die Platten frei von verbleibenden anhaftenden Zellen - Bestätigung unter dem Mikroskop, wenn nicht sicher.
2. Alternativ verwerfen adhärenten Makrophagen durch Ernte des Überstands mit den Zellen in Suspension, die überwiegend Monozyten enthalten.
   1. Ernte der nicht-adhärenten Zellen mit einer Lösung von EDTA-freies PBS und 0,5% BSA. Sie nicht zu viel Kraft, um zu vermeiden, verdrängen leicht anhaftenden Makrophagen gelten.

1.5 FACS-Analyse (optional)

Anmerkung: Es ist möglich, die Zellsuspension von CD117 ⁺ Stamm- und Vorläuferzellen durch die Verwendung von MACS abzureichern. Verwenden Hersteller Protokolle für dieses Verfahren.

1. Ernte der Zellen gemäß einem der Schritte 1.4.1 oder 1.4.2.
2. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 250 × g für 10 Minuten bei 4 ° C und wiederholen Sie diesen Schritt wieder.
3. Resuspendieren mindestens 250.000 Zellen in 300 ul FACS buffer pro Sonde.
4. Übertragungszelle Lösung auf eine 96-well-Platte (30 & mgr; l pro Vertiefung).
5. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 250 xg für 5 Minuten bei 4 ° C.
6. Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie 25 ul Antikörper in jede Vertiefung (Verwendung Hersteller Verdünnung).
7. Färben die Zellen mit Antikörpern (nach Herstellerprotokollen für Zell Phänotypisierung nach den Schritten 1.5.1-1.5.6. Üblicherweise verwendete Marker für Monozyten / Makrophagen zur Identität CD11b, F4 / 80 (Figur 3), CD115 (Abbildung 2), Gr- 1.
   Anmerkung: Für eine weitere Beschreibung von Zell Lösungen ist die Verwendung von Markern, wie CD4, CD8a, CD11c, CD25, CD45, CD45R, CD62L, CD80, CD86, CD145, CD117, MHCⅡ, Ly6C, Ly6G und CD192 empfohlen. Cellular Eigenschaften wurden zuvor beschrieben ^12.
8. Die Sonden für 20 min Inkubation bei 4 ° C.
9. Zentrifuge die Sonden bei 250 × g für 5 min bei 4 ° C und Resuspension mit 200 ul FACS-Puffer. Wiederholen thist Schritt zweimal.
10. Übertragen Sie die Sonden in FACS-Röhrchen und führen Sie die FACS-Analyse ^12.
11. Führen FACS-Analyse ¹² am Tag 0, 3 und 5, um die Zelldifferenzierung zu analysieren.

2. Injektion in die Schwanzvene

2.1 Vorbereitung

1. Erwärmen die Tiere auf einer Heizplatte bei 37 ° C für ca. 10 min. Beachten Sie die Tiere unter Erwärmung auf Anzeichen einer Überhitzung zu erkennen.
2. Resuspendieren der Monozyten, isoliert in Schritten 1.1- 1.4, in 150 ul NaCl, und laden Sie die Zellen in eine 1 ml Insulinspritze mit einer 30G Nadel. Die Lösung leicht vortexen vor dem Laden der Spritze, um sicherzustellen, dass alle Monozyten injiziert werden. Immer Griff Zellen auf Eis, Wärme-vermittelte Bindung und Aktivierung von Monozyten zu vermeiden.

2.2 Einstweilige

1. Vermeiden Sie andere Mäuse stören im Käfig bei der Auswahl einer Maus zur intravenösen Injektion.
2. Platzieren Sie die Maus in die Restrainer. Vermeiden Sie zu viel prEssure und seien Sie vorsichtig mit den Hinterbeinen. (Figur 4)
   Hinweis: Alternativ können Sie auch eine Vollnarkose zu stressfreien Umgang mit den Tieren zu gewährleisten.
3. Stellen Sie sicher, dass die Maus bietet Platz zum Atmen vor dem Schließen der Verzögerer.

2.3 Injection

1. Desinfizieren Sie die Injektionsstelle mit Desinfektionsmittel. Spray auf dem Schwanz der Maus und lassen Sie stehen für mindestens 1 min.
2. Stoppen Venenblutdurchfluß des Schwanzes durch sanften Druck auf die seitlichen Heckseite oberhalb der Injektionsstelle, für eine bessere Sichtbarkeit der Venen.
3. Drehen Sie den Schwanz 90 Grad, vor der Injektion. (Figur 5)
4. Injizieren bei einem Winkel von 45 Grad. Injizieren Sie langsam und nicht mehr als 5 & mgr; l pro g zu schaden Tiere zu vermeiden.
5. Wenn es eine Blase, die ein Zeichen für eine fehlgeschlagene Einspritzung ist, ab sofort nicht und wiederholen Sie die Injektion weiter proximal.
6. Stoppen Sie die Blutungen an der Injektionsseite durch leichten pressure für etwa 1 min.
7. Am Ende des Verfahrens, öffnen Sie die Rückziehvorrichtung und die Maus in seinem Käfig.
8. Beachten Sie die Maus für 20 Minuten, um sicherzustellen, dass das Tier nicht von der Injektions geschädigt und Brustlage beibehalten wird. Verlängern Sie die Zeit der Beobachtung, bis die Maus gewinnt ausreichend Bewusstsein. Bringen Sie die Maus, um das Unternehmen von anderen Tieren nur nachdem sie vollständig erholt hat.

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Ergebnisse

Das aus dem Knochenmark der Maus extrahiert Zelllösung besteht aus verschiedenen Zelltypen. Die wichtigsten Zelltypen sind Lymphozyten, Granulozyten und Monozyten. Zelltypen können durch Grße und Granularität, die in Abbildung 1 für native Suspensionen und Zellen nach 5 Tagen der Differenzierung geerntet gezeigt wird geschätzt werden. Beachten Sie die Verschiebung zelluläre Zusammensetzung während der Kultivierung. Jedoch muss eine genaue Klassifizierung der Bevölkerung auf die markante Express...

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Diskussion

Wir beschreiben ein einfaches und kostengünstiges Verfahren, um große Mengen an murine Monozyten aus Knochenmark zu isolieren. Im Vergleich zu anderen Protokollen mit dem peripheren Blut, die Monozyten Ausbeuten ⁵ von 1,4 x10 ⁶ zu erhalten, werden wir in der Lage, höhere Ausbeuten an 11 x 10 ⁶ ± 3 x 10 ⁶ Monozyten aus einer Spendermaus erhalten.

Wenn angesichts Herausforderungen mit diesem Verfahren ist es wichtig, die Möglichkeit einer Verunr...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well-ultra-low-attachment plate	Corning Incorporated, NY, USA		6-well-ultra-low-attachment plate, with cap, sterile
8- 12 week old, male, balb/c mice	Charles River, Sulzfeld, Germany
96-well-plate	Greiner bio one GmbH, Frickenhausen, Germany
Blue dead cell stain	Life technologies GmbH, Darmstadt, Germany
Bovine serum albumine	GE Healthcare, Freiburg, Germany		Fraction V, pH 7.0
Canules	B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany		28G, 30G
CD115	eBioscience, San Diego, USA	12-1152
CD11b	eBioscience, San Diego, USA	53-0112
Cell culture dish	Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany		With cap, steril
Centrifuge	Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Germany		Allegra® X-15R centrifuge
Depilatory cream	Veet, Mannheim, Germany
Disinfection agent	Schülke&Mayr GmbH, Norderstedt, Germany		Kodan Tinktur forte
Disposable scalpel No.10	Feather safety razor Co.Ltd, Osaka, Japan
EDTA	Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Ethanol 96%	Otto Fischar GmbH und Co KG, Saarbrücken, Germany
Extraction unit Pipetus	Hirschmann Laborgeräte GmbH & Co.KG, Eberstadt, Germany
F4/80	AbD Serotec, Düsseldorf, Germany	MCA497APC
FACS buffer	Manufactured by our group with single components		PBS, 0.5% BSA, 0.1% NaN3
FACS device	Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA		BD FACS Canto II
FACS tubes	Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA
Falcon® pipette	Becton Dickenson Labware, NY, USA
Fetal calf serum	Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Fine forceps	Rubis, Stabio, Switzerland
Gloves	Rösner-Matby Meditrade GmbH, Kiefersfelden, Germany
Gr1	eBioscience, San Diego, USA	53-5931
Heating plate	Labotect GmbH, Göttingen, Germany		Hot Plate 062
Incubator	Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Germany		Incu safe
Isofluran	Baxter Deutschland GmbH, Unterschleißheim, Germany
Light microscope	Carl Zeiss SMT GmbH, Oberkochen, Germany		Axiovert 40 °C
Macrophage-Colony Stimulating Factor	Sigma Aldrich, Hamburg, Germany	SRP3110
Mechanical shaker	IKA, Staufen, Germany		ms2 minishaker
Medium 199	PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria		Warm in 37 °C water bath before use
Micro test tubes	Eppendorf AG, Hamburg, Germany
Microbiological work bench	Thermo Electron, LED GmbH, Langenselbold, Germany		Hera safe
Monocyte wash buffer	Manufactured by our group with single components		PBS, 0.5% BSA, 2 mM EDTA
Mouse restrainer	Various
NaCl	Berlin Chemie AG, Berlin, Germany
NaN3 (sodium acide)	Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Neubauer counting chamber	Paul Marienfeld GmbH und Co.KG, Lauda-Königshofen, Germany
Nylon cellsieve	Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA		Cell strainer, 70 µm mesh size
Penicillin/Streptomycin	Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Phosphate buffered saline	Life technologies GmbH, Darmstadt, Germany		pH 7.4, sterile
Pipettes	Eppendorf AG, Hamburg, Germany		10µl/100µl/200µl/1,000µl
Pipetting heads	Eppendorf AG, Hamburg, Germany
Serological pipette	Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany		Cellstar 5 ml, 10 ml
Suction unit	Integra bioscience, Fernwald, Germany		Vacusafe comfort
Surgical scissors	Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA
Syringe	B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany		1 ml Omnifix® -F insuline syringe
Tubes with cap	Greiner bio one GmbH, Frickenhausen, Germany		15 ml/50 ml Cellstar tubes
Warm water bath	Julabo Labortechnik GmbH, Seelbach, Germany		Julabo SW22