Isolement et injection intraveineuse de moelle osseuse de souris dérivées monocytes

Résumé

Here we present a protocol that generates large amounts of murine monocytes from heterogeneous bone marrow for translational applications. In comparison to others, this new method helps reduce the number of sacrificed animals and lowers costs by avoiding expensive methods such as high gradient magnetic cell separation (MACS).

Résumé

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of various fields in biomedical science. The method described below is a simple and effective way to isolate murine monocytes from heterogeneous bone marrow.

Bone marrow from the femur and tibia of Balb/c mice is harvested by flushing with phosphate buffered saline (PBS). Cell suspension is supplemented with macrophage-colony stimulating factor (M-CSF) and cultured on ultra-low attachment surfaces to avoid adhesion-triggered differentiation of monocytes. The properties and differentiation of monocytes are characterized at various intervals. Fluorescence activated cell sorting (FACS), with markers like CD11b, CD115, and F4/80, is used for phenotyping. At the end of cultivation, the suspension consists of 45%± 12% monocytes. By removing adhesive macrophages, the purity can be raised up to 86%± 6%. After the isolation, monocytes can be utilized in various ways, and one of the most effective and common methods for in vivo delivery is intravenous tail vein injection.

This technique of isolation and application is important for mouse model studies, especially in the fields of inflammation or immunology. Monocytes can also be used therapeutically in mouse disease models.

Introduction

The isolation of monocytes is important and critical for many in vitro and in vivo studies. These cells are targets for diseases such as peripheral arterial disease, coronary heart disease, or other ischemic diseases, since collateral vessel growth is strongly driven by local inflammation. Inflammatory responses include endothelial activation and local recruitment of leukocytes, mainly monocytes, which then mature to macrophages and create a highly arteriogenic environment by secreting multiple growth factors to induce the remodeling of an arteriole into a functional collateral artery^1-3. Monocytes also mature to dendritic cells, which are frequently used for immunological studies^4,5 and cancer research^6,7.

Problematic in the approach for monocyte isolation from peripheral blood⁸ is the high number of donor animals needed to produce a sufficient amount of monocytes for most analyses. Former protocols describe methods such as density gradient centrifugation and cell depletion via MACS⁹ when isolating monocytes; however, these techniques can alter the characteristics and functionality of monocytes which can lead to difficulties in interpretation^10,11. Moreover, these methods are difficult and can reduce experimental reproducibility.

Our aim with this protocol is to provide a simple and cost effective method to generate large amounts of bone marrow-derived monocytes. Due to the high cell yield of 11 x 10⁶ ± 3 x 10⁶ cells obtained by this protocol, we can substantially reduce the number of mice required during the isolation of bone marrow-derived monocytes. The procedure can be completed within a minimal amount of time, and without using expensive and complicated techniques as referenced above. Here, we extract monocytes from native bone marrow suspension of donor mice, cultivate the suspension on ultralow attachment plates, and supplement the solution with 20 ng/ml M-CFS. On day 5 of incubation, cells are harvested and characterized to confirm functional and phenotypic properties.

For experiments in the field of arteriogenesis, intravenous transplantation of these bone marrow-derived monocytes into mice is an effective method of systemic drug delivery, which can be combined with femoral artery ligation in common peripheral arterial disease models.

Protocole

Cette étude a été réalisée avec la permission de l'Etat de Saxe et de Saxe-Anhalt, Regierungspraesidium Dresden / Halle, selon l'article 8 de la loi allemande pour la protection des animaux (24D-9168,11 à 1 / 2008-24).

Une cellule d'isolement

1.1 Préparation du fémur et du tibia

1. Anesthésier la souris en utilisant une concentration d'isoflurane à 5% par vaporisation d'isoflurane dans un bac fermé. Après la souris a cessé de bouger pendant 3 secondes, effectuer la dislocation cervicale.
2. Désinfecter les membres postérieurs avec de l'éthanol (96%). Enlever la peau et les muscles et séparer les os avec un scalpel stérile.
   1. Commencez par une incision inguinale de la peau, et d'étendre l'incision vers la malléole interne et effectuer une dissection circulaire de la peau autour du mollet. Retirez la peau des jambes complètement par éplucher proximale.
   2. Détachez le muscle quadriceps du fémur avec un scalpel, enlever les deux péroné antérieureset les groupes musculaires jumelles et disjoignent la jambe à l'articulation de la hanche en localisant et en disséquant les ligaments.
   3. Commencez en avant et procéder autour de l'articulation en tournant soigneusement la jambe et sectionnant les ligaments, désarticulant ainsi la commune.
3. Laver fémur et le tibia avec 96% d'éthanol pendant au moins 90 secondes pour garantir préparation cellulaire aseptique. Poursuivre le processus de lavage avec du PBS stérile pour rincer éthanol restant.
   Remarque: Toutes les étapes suivantes doivent être stériles pour éviter la contamination.

1.2 La récolte de moelle osseuse

1. Couper l'extrémité proximale et distale de chaque os avec une paire de ciseaux fins d'accéder aux arbres fémorale et tibiale. Soyez prudent avec cette étape, puisque ces os se cassent très facilement.
2. Rincer les os avec un milieu chaud (M199 + 10% de sérum de veau foetal (FCS), + 1% de pénicilline / streptomycine). Utiliser une aiguille stérile 28-G, une seringue de 1 ml, et entre 10 à 15 ml par milieuosseuse pour le rinçage.
3. Maintenez l'os avec une pince fine et rincer une par une jusqu'à ce qu'il devienne semi-translucide. Appliquer soigneusement pression à l'extrémité du plongeur de la seringue afin de minimiser le stress cellulaire.
4. Filtrer la moelle osseuse à travers un nylon web 70 um et de recueillir le filtrat. Pour extraire la quantité maximale de la moelle osseuse, rincer de manière répétée à partir des extrémités distale et proximale.
5. Rincez le tamis avec du PBS et recueillir le filtrat. Déloger soigneusement les débris et les conglomérats cellulaires par agitation douce et pipetage.

1.3 Culture

1. Centrifuger la suspension de cellules à 250 xg pendant 10 min à température ambiante. Jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules avec environ 25 ml de milieu. Répéter une fois.
2. Resuspendre les cellules dans 6 ml de milieu après la seconde étape de lavage. Mélanger 50 ul de la solution de cellules avec 50 pi de bleu trypan. Compter les cellules dans une chambre de comptage au microscope optique. Calculer le nombre de caunes dans la solution à l'aide de cette formule:
   
3. Ensemencer les cellules sur des plaques de surface à très faible fixation 6 puits pour empêcher l'adhérence permanente au fond de la plaque. Utiliser une concentration de 10 ⁶ cellules par ml avec jusqu'à 6 ml par puits.
4. Compléter la suspension avec 20 ng / ml de M-CSF pour promouvoir la différenciation cellulaire.
5. Culture des cellules pendant 5 jours à 37 ° C et 5% de dioxyde de carbone et d'observer tous les jours.

1.4 La récolte des cellules

Remarque: ces étapes doivent être effectuées sur la glace. Procéder à 1.4.1 ou 1.4.2 soit en conséquence.

1. À ce stade, récolter toute la culture, y compris les macrophages différenciés qui adhèrent à la culture plaques, même se ils sont des plaques de surface ultra-faible fixation.
   1. Récolter la culture entière par pipetage doux et détacher avec une solution de 4 ° C PBS, 0,5% d'albumine de sérum bovin (BSA) et 2 mM d'EDTA. Répétez jusqu'à ce que les plaques sont clairement de rester cellules adhérentes - confirmer sous un microscope en cas de doute.
2. Sinon, jetez macrophages adhérentes en récoltant le surnageant avec les cellules en suspension, qui contiennent principalement des monocytes.
   1. Récolter les cellules non adhérentes avec une solution de PBS sans EDTA et 0,5% de BSA. Ne pas appliquer trop de force pour ne pas déloger les macrophages légèrement adhérentes.

1,5 FACS-analyse (Facultatif)

Remarque: Il est possible d'épuiser la suspension cellulaire de cellules progénitrices et stem- CD117 ⁺ en utilisant des MACS. Utilisez protocoles du fabricant pour cette procédure.

1. Récolter les cellules selon l'une des étapes 1.4.1 ou 1.4.2.
2. Centrifuger les cellules à 250 g pendant 10 min à 4 ° C et répéter cette étape.
3. Remettre en suspension au moins 250 000 cellules dans 300 pi de FACS buffer par sonde.
4. Transfert solution de cellules sur un 96-bien-plaque (30 pi par puits).
5. Centrifuger la suspension de cellules à 250 xg pendant 5 min à 4 ° C.
6. Retirer le surnageant et ajouter 25 ul d'anticorps à chaque puits (utilisation constructeur dilution).
7. Colorer les cellules avec des anticorps (suivant les protocoles du fabricant pour le phénotypage cellulaire après les étapes 1.5.1-1.5.6. Marqueurs couramment utilisés pour l'identification des monocytes / macrophages comprennent CD11b, F4 / 80 (Figure 3), CD115 (Figure 2), et Gr- 1.
   Remarque: Pour une description plus détaillée des solutions cellulaires, l'utilisation de marqueurs comme CD4, CD8a, CD11c, CD25, CD45, CD45R, CD62L, CD80, CD86, CD145, CD117, MHCⅡ, Ly6C, Ly6G et CD192 est recommandé. Caractéristiques cellulaires ont été précédemment décrites ^12.
8. Incuber les sondes pendant 20 min à 4 ° C.
9. Centrifuger les sondes à 250 xg pendant 5 min à 4 ° C et remettre en suspension avec 200 ul de tampon FACS. Répétez eest l'étape deux fois.
10. Transférez les sondes dans des tubes FACS et effectuer l'analyse FACS ^12.
11. Effectuer l'analyse FACS ¹² au jour 0, 3 et 5 pour analyser la différenciation cellulaire.

2. Injection veine caudale

Préparation 2.1

1. Réchauffez les animaux sur une plaque chauffante à 37 ° C pendant environ 10 min. Observer les animaux tout en chauffant à reconnaître les signes de surchauffe.
2. Resuspendre les monocytes isolés dans les étapes, 1.1- 1.4, dans 150 ul de NaCl, et de charger les cellules dans une seringue de 1 ml à l'insuline avec une aiguille de 30G. Légèrement vortex la solution avant de charger la seringue pour se assurer que tous les monocytes sont injectés. Toujours manipuler les cellules sur de la glace pour éviter l'attachement de chaleur médiation et l'activation des monocytes.

2.2 Retenir

1. Éviter de déranger les autres souris dans la cage lors du choix d'une souris pour l'injection intraveineuse.
2. Passer la souris dans le dispositif de retenue. Eviter trop de prEssure et être prudent avec les membres postérieurs. (Figure 4)
   Remarque: Vous pouvez également utiliser l'anesthésie générale pour garantir sans stress manipulation des animaux.
3. Assurez-vous que la souris possède un espace pour respirer avant la fermeture du dispositif de retenue.

2.3 Injection

1. Désinfecter le site d'injection avec un agent de désinfection. Vaporiser sur la queue de la souris et laisser reposer pendant au moins 1 min.
2. Arrêtez veineuse flux sanguin de la queue en appliquant une légère pression sur le côté latéral de la queue au-dessus du site d'injection, pour une meilleure visibilité des veines.
3. Mettez la queue de 90 degrés, avant l'injection. (Figure 5)
4. Injecter à un angle de 45 degrés. Injecter lentement et pas plus de 5 pi par g pour éviter de nuire animaux.
5. Se il ya un blister, qui est un signe d'une injection échoué, cesser immédiatement et répéter l'injection plus proximale.
6. Arrêter l'hémorragie sur le côté d'injection en appliquant douce pression pendant environ 1 min.
7. A la fin de la procédure, le rétracteur ouvrir et placer la souris dans une cage.
8. Observez la souris pendant 20 min pour se assurer que l'animal n'a pas été blessé par l'injection et décubitus sternal est maintenue. Prolonger le délai d'observation jusqu'à ce que la souris reprend conscience suffisante. Retour la souris vers la compagnie d'autres animaux seulement après qu'il a complètement récupéré.

Résultats

La solution d'extrait cellulaire de la moelle osseuse murine est constituée de divers types de cellules. Les principaux types de cellules sont des lymphocytes, les granulocytes et les monocytes. Les types de cellules peuvent être estimées par la taille et la granularité, qui est représentée sur la figure 1 pour les deux suspensions indigènes et les cellules récoltées après 5 jours de différenciation. Notez la composition cellulaire pendant la culture itinérante. Cependant, la classificat...

Discussion

Nous décrivons une méthode simple et rentable pour isoler de grandes quantités de monocytes murins de la moelle osseuse. En comparaison à d'autres protocoles utilisant le sang périphérique, qui obtiennent des rendements de monocytes ⁵ 1.4 x10 ^6, nous sommes en mesure d'obtenir des rendements plus élevés de 11 x 10 ⁶ ± 3 x 10 ⁶ monocytes d'une souris donateur.

Lors de l'examen des défis avec cette méthode, il est important...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well-ultra-low-attachment plate	Corning Incorporated, NY, USA		6-well-ultra-low-attachment plate, with cap, sterile
8- 12 week old, male, balb/c mice	Charles River, Sulzfeld, Germany
96-well-plate	Greiner bio one GmbH, Frickenhausen, Germany
Blue dead cell stain	Life technologies GmbH, Darmstadt, Germany
Bovine serum albumine	GE Healthcare, Freiburg, Germany		Fraction V, pH 7.0
Canules	B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany		28G, 30G
CD115	eBioscience, San Diego, USA	12-1152
CD11b	eBioscience, San Diego, USA	53-0112
Cell culture dish	Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany		With cap, steril
Centrifuge	Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Germany		Allegra® X-15R centrifuge
Depilatory cream	Veet, Mannheim, Germany
Disinfection agent	Schülke&Mayr GmbH, Norderstedt, Germany		Kodan Tinktur forte
Disposable scalpel No.10	Feather safety razor Co.Ltd, Osaka, Japan
EDTA	Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Ethanol 96%	Otto Fischar GmbH und Co KG, Saarbrücken, Germany
Extraction unit Pipetus	Hirschmann Laborgeräte GmbH & Co.KG, Eberstadt, Germany
F4/80	AbD Serotec, Düsseldorf, Germany	MCA497APC
FACS buffer	Manufactured by our group with single components		PBS, 0.5% BSA, 0.1% NaN3
FACS device	Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA		BD FACS Canto II
FACS tubes	Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA
Falcon® pipette	Becton Dickenson Labware, NY, USA
Fetal calf serum	Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Fine forceps	Rubis, Stabio, Switzerland
Gloves	Rösner-Matby Meditrade GmbH, Kiefersfelden, Germany
Gr1	eBioscience, San Diego, USA	53-5931
Heating plate	Labotect GmbH, Göttingen, Germany		Hot Plate 062
Incubator	Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Germany		Incu safe
Isofluran	Baxter Deutschland GmbH, Unterschleißheim, Germany
Light microscope	Carl Zeiss SMT GmbH, Oberkochen, Germany		Axiovert 40 °C
Macrophage-Colony Stimulating Factor	Sigma Aldrich, Hamburg, Germany	SRP3110
Mechanical shaker	IKA, Staufen, Germany		ms2 minishaker
Medium 199	PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria		Warm in 37 °C water bath before use
Micro test tubes	Eppendorf AG, Hamburg, Germany
Microbiological work bench	Thermo Electron, LED GmbH, Langenselbold, Germany		Hera safe
Monocyte wash buffer	Manufactured by our group with single components		PBS, 0.5% BSA, 2 mM EDTA
Mouse restrainer	Various
NaCl	Berlin Chemie AG, Berlin, Germany
NaN3 (sodium acide)	Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Neubauer counting chamber	Paul Marienfeld GmbH und Co.KG, Lauda-Königshofen, Germany
Nylon cellsieve	Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA		Cell strainer, 70 µm mesh size
Penicillin/Streptomycin	Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Phosphate buffered saline	Life technologies GmbH, Darmstadt, Germany		pH 7.4, sterile
Pipettes	Eppendorf AG, Hamburg, Germany		10µl/100µl/200µl/1,000µl
Pipetting heads	Eppendorf AG, Hamburg, Germany
Serological pipette	Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany		Cellstar 5 ml, 10 ml
Suction unit	Integra bioscience, Fernwald, Germany		Vacusafe comfort
Surgical scissors	Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA
Syringe	B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany		1 ml Omnifix® -F insuline syringe
Tubes with cap	Greiner bio one GmbH, Frickenhausen, Germany		15 ml/50 ml Cellstar tubes
Warm water bath	Julabo Labortechnik GmbH, Seelbach, Germany		Julabo SW22