単離とマウス骨髄由来の単球の静脈注射

要約

Here we present a protocol that generates large amounts of murine monocytes from heterogeneous bone marrow for translational applications. In comparison to others, this new method helps reduce the number of sacrificed animals and lowers costs by avoiding expensive methods such as high gradient magnetic cell separation (MACS).

要約

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of various fields in biomedical science. The method described below is a simple and effective way to isolate murine monocytes from heterogeneous bone marrow.

Bone marrow from the femur and tibia of Balb/c mice is harvested by flushing with phosphate buffered saline (PBS). Cell suspension is supplemented with macrophage-colony stimulating factor (M-CSF) and cultured on ultra-low attachment surfaces to avoid adhesion-triggered differentiation of monocytes. The properties and differentiation of monocytes are characterized at various intervals. Fluorescence activated cell sorting (FACS), with markers like CD11b, CD115, and F4/80, is used for phenotyping. At the end of cultivation, the suspension consists of 45%± 12% monocytes. By removing adhesive macrophages, the purity can be raised up to 86%± 6%. After the isolation, monocytes can be utilized in various ways, and one of the most effective and common methods for in vivo delivery is intravenous tail vein injection.

This technique of isolation and application is important for mouse model studies, especially in the fields of inflammation or immunology. Monocytes can also be used therapeutically in mouse disease models.

概要

The isolation of monocytes is important and critical for many in vitro and in vivo studies. These cells are targets for diseases such as peripheral arterial disease, coronary heart disease, or other ischemic diseases, since collateral vessel growth is strongly driven by local inflammation. Inflammatory responses include endothelial activation and local recruitment of leukocytes, mainly monocytes, which then mature to macrophages and create a highly arteriogenic environment by secreting multiple growth factors to induce the remodeling of an arteriole into a functional collateral artery^1-3. Monocytes also mature to dendritic cells, which are frequently used for immunological studies^4,5 and cancer research^6,7.

Problematic in the approach for monocyte isolation from peripheral blood⁸ is the high number of donor animals needed to produce a sufficient amount of monocytes for most analyses. Former protocols describe methods such as density gradient centrifugation and cell depletion via MACS⁹ when isolating monocytes; however, these techniques can alter the characteristics and functionality of monocytes which can lead to difficulties in interpretation^10,11. Moreover, these methods are difficult and can reduce experimental reproducibility.

Our aim with this protocol is to provide a simple and cost effective method to generate large amounts of bone marrow-derived monocytes. Due to the high cell yield of 11 x 10⁶ ± 3 x 10⁶ cells obtained by this protocol, we can substantially reduce the number of mice required during the isolation of bone marrow-derived monocytes. The procedure can be completed within a minimal amount of time, and without using expensive and complicated techniques as referenced above. Here, we extract monocytes from native bone marrow suspension of donor mice, cultivate the suspension on ultralow attachment plates, and supplement the solution with 20 ng/ml M-CFS. On day 5 of incubation, cells are harvested and characterized to confirm functional and phenotypic properties.

For experiments in the field of arteriogenesis, intravenous transplantation of these bone marrow-derived monocytes into mice is an effective method of systemic drug delivery, which can be combined with femoral artery ligation in common peripheral arterial disease models.

プロトコル

この研究は、動物保護（24D-9168.11から1/2008から24）のためのドイツ法第8に従って、ザクセンとザクセン=アンハルト、Regierungspraesidiumドレスデン/ハレの国の許可を得て実施した。

1細胞の単離

1.1大腿骨と脛骨の調製を

1. 閉じたビンにイソフルランを気化させることにより、5％イソフルラン濃度を用いて、マウスを麻酔。マウスは3秒間移動を停止した後、頚椎脱臼を行う。
2. エタノール（96％）で後肢を消毒する。皮膚や筋肉を取り出し、無菌のメスで骨を分離する。
   1. 鼠径皮膚切開を開始し、内果に向かって切開を延長し、下の子牛の周りの皮膚の円形切開を行う。近位にそれを剥離することにより、完全に足の皮膚を削除します。
   2. 鋭いメスで大腿骨から大腿四頭筋を切り離し、前方腓骨の両方を削除と腓腹筋グループと靭帯を探し、解剖によって股関節で足をdisarticulate。
   3. 前方に起動して、慎重に足を回転させ、靭帯を横に切開することにより、関節を中心に進んで、それによってジョイントをdisarticulating。
3. 洗浄大腿無菌細胞調製を保証する90秒以上96％エタノールで脛骨。残りのエタノールを洗い流すために滅菌PBSで洗浄プロセスを続行します。
   注：すべてのその後の工程は、汚染を避けるために無菌でなければならない。

骨髄の1.2収穫

1. 大腿骨と脛骨のシャフトへのアクセスを得るために細かいハサミで各骨の近位端および遠位端をカットします。これらの骨は非常に簡単に壊れているため、このステップには注意してください。
2. 温かい培地で骨をフラッシュする（M199 + 10％ウシ胎児血清（FCS）+ 1％ペニシリン/ストレプトマイシン）。無菌の28-G針、1ミリリットルの注射器、10〜15 mlの培地あたりの間に使用しますすすぎのための骨。
3. 細かい鉗子で骨を持ち、それが半透明に変わるまで一つ一つをすすぐ。注意深く細胞ストレスを最小にするために、シリンジプランジャの端部に圧力を加える。
4. 70μmのナイロンウェブを通じて骨髄を濾過し、ろ液を集める。骨髄の最大量を抽出するために、遠位端と近位端から繰り返しすすぐ。
5. PBSでふるいをすすぎ、ろ液を集める。慎重に穏やかに撹拌し、ピペッティングにより破片や携帯コングロマリットを取り除く。

1.3栽培

1. RTで10分間250×gで細胞懸濁液を遠心します。上清を捨て、約25ミリリットルの培地で細胞を懸濁します。一回繰り返します。
2. 第2洗浄工程の後に培地6mlの中に細胞を再懸濁する。パンブルーの50μlの細胞溶液50μlを混ぜる。光学顕微鏡下で計数チャンバー内の細胞を数える。数cを計算するこの式を使用して、溶液中のエル：
   
3. プレートの底に永久的な付着を防止するために、6ウェルの超低取付面板上に細胞を播種する。ウェルあたり最大6 mlの1mlあたり10 ⁶細胞の濃度を使用してください。
4. 細胞分化を促進するために20ng / mlのM-CSFとの懸濁液を補う。
5. 培養物を37℃で5日間、細胞を、5％の二酸化炭素とを毎日観察する。

細胞の1.4収穫

注：これらの手順は、氷上で行われるべきである。それに応じて1.4.1または1.4.2のどちらかに進みます。

1. この時点で、彼らは、超低取付面板であっても、培養プレートに付着する分化したマクロファージを含む、全体の培養を収穫する。
   1. 穏やかなピペッティングにより全体の文化を収穫し、4℃、PBの溶液で脱着S、0.5％ウシ血清アルブミン（BSA）および2mM EDTA。わからない場合には、顕微鏡下で確認する - プレートが接着細胞を残りの明確になるまで繰り返します。
2. 別の方法として、主に単球が含まれている懸濁液中の細胞と上清を収穫することにより、接着性マクロファージを捨てる。
   1. EDTA非含有PBS溶液と0.5％BSAと非接着細胞を回収。穏やかに付着したマクロファージを追い出し避けるためにあまりにも多くの力を加えないでください。

1.5 FACS-解析（オプション）

注：これは、MACSを用いてCD117 ⁺ステムおよび前駆細胞の細胞懸濁液を枯渇させることが可能である。この手順については、製造元のプロトコルを使用してください。

1. どちらかが1.4.1または1.4.2の手順に従って、細胞を採取する。
2. 4℃で10分間250×gで細胞を遠心して、もう一度この手順を繰り返します。
3. FACS bの300μlの中に再懸濁し、少なくとも250,000細胞プローブあたりuffer。
4. 96ウェルプレート（ウェルあたり30μL）の上に細胞溶液を転送します。
5. 4℃で5分間250×gで細胞懸濁液を遠心します。
6. 上清を除去し、各ウェル（使用メーカー希釈）に対する抗体の25μlを添加する。
7. 抗体と細胞（1.5.1-1.5.6ステップ後の細胞表現型のために製造業者のプロトコルを以下のように染色。単球/マクロファージの同定のために一般に使用されるマーカーは、CD11bの、F4 / 80（ 図3）、CD115（図2）、およびGR-を含む1。
   注：セル·ソリューションのさらなる説明については、CD4、CD8a、のCD11c、CD25、CD45、CD45R、CD62L、CD80、CD86、CD145、CD117、MHCⅡ、Ly6C、Ly6G、およびCD192のようなマーカーの使用が推奨されます。細胞の特徴は、以前に^12を説明した。
8. 4℃で20分間、プローブをインキュベートする。
9. 遠心機で4℃で5分間250×gでプローブし、FACS緩衝液200μlに再懸濁とは目を繰り返しますステップの2倍である。
10. FACSチューブにプローブを転送し、FACS分析^12を行う。
11. 細胞分化を分析するために、0日目、3及び5にFACS分析^12を実行する。

2.尾静脈注射

2.1準備

1. 約10分間37℃で加熱板上で動物を暖める。過熱の兆候を認識するために温めながら、動物を観察します。
2. NaClを150μlの中で、ステップ1.1〜1.4で孤立し、単球を再懸濁し、30Gの針を1ミリリットルのインスリン注射器に細胞をロードします。軽くすべての球が注入されるように、注射器をロードする前に解決策をボルテックス。常に熱媒介アタッチメントと単球の活性化を避けるために、氷上で細胞を処理します。

2.2保全処分

1. 静脈内注射のためのマウスを選択する際にケージ内の他のマウスを乱すことは避けてください。
2. 制止にマウスを置きます。あまりにも多くのPRを避けるessureと後肢に注意してください。 （ 図4）
   注：または、動物のストレスのないハンドリングを保証するために全身麻酔を使用しています。
3. マウスが制止を閉じる前に、呼吸のためのスペースがあることを確認してください。

2.3インジェクション

1. 消毒剤と、注射部位を消毒する。マウスの尾にスプレーし、少なくとも1分間放置。
2. 静脈の視認性のために、注射部位の上に外側尾側に緩やかな圧力を加えることにより、尾の静脈血の流れを止める。
3. 注射の前に、尾を90度回します。 （ 図5）
4. 45度の角度で注入する。動物に害を避けるために、ゆっくりと何グラムあたり5μL以上の注入ません。
5. 失敗した注射のサインですブリスターがある場合は、すぐに中止し、より近位に注射を繰り返します。
6. 穏やかなページを適用することにより、射出側の出血を止める約1分間の案内圧力スイッチ。
7. 手順の最後に、リトラクターを開き、そのケージにマウスを置く。
8. 動物が注射によって害されませんでしたし、胸骨の横臥が維持されることを保証するために20分間、マウスを観察します。マウスが十分な意識を取り戻すまで、観測の時間を延長します。それは完全に回復した後にのみ、他の動物の会社にマウスを返します。

結果

マウス骨髄から抽出された細胞溶液は、様々な細胞型から成る。主要な細胞型は、リンパ球、顆粒球及び単球である。細胞型は、分化の5日後に採取し、ネイティブ懸濁液および細胞については、図1に示されているサイズおよび粒度によって推定することができる。培養中のシフト細胞組成に注意してください。しかし、集団の正確な分類は、細胞マーカーの特徴的な表現に依存...

ディスカッション

我々は、骨髄由来のマウスの単球を大量に単離するための単純で費用効果的な方法を記載する。 1.4×10 ⁶の単球収率^5を得た末梢血を使用して、他のプロトコルと比較して、我々は、単一のドナーマウスから11×10 ^{6±3×10 6}単球のより高い収率を得ることができる。

この方法の課題を考慮した場合、非無菌条件下で作業する場合には、汚染の可能性を?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well-ultra-low-attachment plate	Corning Incorporated, NY, USA		6-well-ultra-low-attachment plate, with cap, sterile
8- 12 week old, male, balb/c mice	Charles River, Sulzfeld, Germany
96-well-plate	Greiner bio one GmbH, Frickenhausen, Germany
Blue dead cell stain	Life technologies GmbH, Darmstadt, Germany
Bovine serum albumine	GE Healthcare, Freiburg, Germany		Fraction V, pH 7.0
Canules	B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany		28G, 30G
CD115	eBioscience, San Diego, USA	12-1152
CD11b	eBioscience, San Diego, USA	53-0112
Cell culture dish	Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany		With cap, steril
Centrifuge	Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Germany		Allegra® X-15R centrifuge
Depilatory cream	Veet, Mannheim, Germany
Disinfection agent	Schülke&Mayr GmbH, Norderstedt, Germany		Kodan Tinktur forte
Disposable scalpel No.10	Feather safety razor Co.Ltd, Osaka, Japan
EDTA	Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Ethanol 96%	Otto Fischar GmbH und Co KG, Saarbrücken, Germany
Extraction unit Pipetus	Hirschmann Laborgeräte GmbH & Co.KG, Eberstadt, Germany
F4/80	AbD Serotec, Düsseldorf, Germany	MCA497APC
FACS buffer	Manufactured by our group with single components		PBS, 0.5% BSA, 0.1% NaN3
FACS device	Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA		BD FACS Canto II
FACS tubes	Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA
Falcon® pipette	Becton Dickenson Labware, NY, USA
Fetal calf serum	Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Fine forceps	Rubis, Stabio, Switzerland
Gloves	Rösner-Matby Meditrade GmbH, Kiefersfelden, Germany
Gr1	eBioscience, San Diego, USA	53-5931
Heating plate	Labotect GmbH, Göttingen, Germany		Hot Plate 062
Incubator	Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Germany		Incu safe
Isofluran	Baxter Deutschland GmbH, Unterschleißheim, Germany
Light microscope	Carl Zeiss SMT GmbH, Oberkochen, Germany		Axiovert 40 °C
Macrophage-Colony Stimulating Factor	Sigma Aldrich, Hamburg, Germany	SRP3110
Mechanical shaker	IKA, Staufen, Germany		ms2 minishaker
Medium 199	PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria		Warm in 37 °C water bath before use
Micro test tubes	Eppendorf AG, Hamburg, Germany
Microbiological work bench	Thermo Electron, LED GmbH, Langenselbold, Germany		Hera safe
Monocyte wash buffer	Manufactured by our group with single components		PBS, 0.5% BSA, 2 mM EDTA
Mouse restrainer	Various
NaCl	Berlin Chemie AG, Berlin, Germany
NaN3 (sodium acide)	Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Neubauer counting chamber	Paul Marienfeld GmbH und Co.KG, Lauda-Königshofen, Germany
Nylon cellsieve	Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA		Cell strainer, 70 µm mesh size
Penicillin/Streptomycin	Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Phosphate buffered saline	Life technologies GmbH, Darmstadt, Germany		pH 7.4, sterile
Pipettes	Eppendorf AG, Hamburg, Germany		10µl/100µl/200µl/1,000µl
Pipetting heads	Eppendorf AG, Hamburg, Germany
Serological pipette	Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany		Cellstar 5 ml, 10 ml
Suction unit	Integra bioscience, Fernwald, Germany		Vacusafe comfort
Surgical scissors	Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA
Syringe	B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany		1 ml Omnifix® -F insuline syringe
Tubes with cap	Greiner bio one GmbH, Frickenhausen, Germany		15 ml/50 ml Cellstar tubes
Warm water bath	Julabo Labortechnik GmbH, Seelbach, Germany		Julabo SW22