Выделение и внутривенное введение мышиных костного мозга моноцитов

Резюме

Here we present a protocol that generates large amounts of murine monocytes from heterogeneous bone marrow for translational applications. In comparison to others, this new method helps reduce the number of sacrificed animals and lowers costs by avoiding expensive methods such as high gradient magnetic cell separation (MACS).

Аннотация

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of various fields in biomedical science. The method described below is a simple and effective way to isolate murine monocytes from heterogeneous bone marrow.

Bone marrow from the femur and tibia of Balb/c mice is harvested by flushing with phosphate buffered saline (PBS). Cell suspension is supplemented with macrophage-colony stimulating factor (M-CSF) and cultured on ultra-low attachment surfaces to avoid adhesion-triggered differentiation of monocytes. The properties and differentiation of monocytes are characterized at various intervals. Fluorescence activated cell sorting (FACS), with markers like CD11b, CD115, and F4/80, is used for phenotyping. At the end of cultivation, the suspension consists of 45%± 12% monocytes. By removing adhesive macrophages, the purity can be raised up to 86%± 6%. After the isolation, monocytes can be utilized in various ways, and one of the most effective and common methods for in vivo delivery is intravenous tail vein injection.

This technique of isolation and application is important for mouse model studies, especially in the fields of inflammation or immunology. Monocytes can also be used therapeutically in mouse disease models.

Введение

The isolation of monocytes is important and critical for many in vitro and in vivo studies. These cells are targets for diseases such as peripheral arterial disease, coronary heart disease, or other ischemic diseases, since collateral vessel growth is strongly driven by local inflammation. Inflammatory responses include endothelial activation and local recruitment of leukocytes, mainly monocytes, which then mature to macrophages and create a highly arteriogenic environment by secreting multiple growth factors to induce the remodeling of an arteriole into a functional collateral artery^1-3. Monocytes also mature to dendritic cells, which are frequently used for immunological studies^4,5 and cancer research^6,7.

Problematic in the approach for monocyte isolation from peripheral blood⁸ is the high number of donor animals needed to produce a sufficient amount of monocytes for most analyses. Former protocols describe methods such as density gradient centrifugation and cell depletion via MACS⁹ when isolating monocytes; however, these techniques can alter the characteristics and functionality of monocytes which can lead to difficulties in interpretation^10,11. Moreover, these methods are difficult and can reduce experimental reproducibility.

Our aim with this protocol is to provide a simple and cost effective method to generate large amounts of bone marrow-derived monocytes. Due to the high cell yield of 11 x 10⁶ ± 3 x 10⁶ cells obtained by this protocol, we can substantially reduce the number of mice required during the isolation of bone marrow-derived monocytes. The procedure can be completed within a minimal amount of time, and without using expensive and complicated techniques as referenced above. Here, we extract monocytes from native bone marrow suspension of donor mice, cultivate the suspension on ultralow attachment plates, and supplement the solution with 20 ng/ml M-CFS. On day 5 of incubation, cells are harvested and characterized to confirm functional and phenotypic properties.

For experiments in the field of arteriogenesis, intravenous transplantation of these bone marrow-derived monocytes into mice is an effective method of systemic drug delivery, which can be combined with femoral artery ligation in common peripheral arterial disease models.

протокол

Это исследование было выполнено с разрешения Саксонии и Саксонии-Ангальт, Regierungspraesidium Дрездене / Галле, в соответствии с разделом 8 Закона о Германии по защите животных (24D-9168.11-1 / 2008-24).

1 Выделение клеток

1.1 Подготовка бедра и голени

1. Обезболить мыши, используя 5% изофлуран концентрации путем испарения изофлуран в закрытой емкости. После мыши перестал двигаться в течение 3 секунд, выполните шейки дислокации.
2. Дезинфекцию задних конечностей с этанолом (96%). Удалить кожу и мышцы и отделить кости с помощью стерильного скальпеля.
   1. Начнем с паховой разрез кожи и продлить разрез по направлению к медиальной лодыжки и выполнять круговое рассечение кожи вокруг нижней теленка. Снимите кожу ног полностью очищая это проксимально.
   2. Снять четырехглавой мышцы от бедра с острым скальпелем, удалить оба передних малоберцовойи группы икроножных мышц и разъединять ногу в тазобедренном суставе, обнаруживая и рассечения связки.
   3. Начните вперед и приступить вокруг сустава, тщательно поворачивая ногу и пересекающих связки, тем самым disarticulating сустав.
3. Промыть бедра и голени с 96% -ным этанолом в течение как минимум 90 секунд, чтобы гарантировать асептические клеточный препарат. Продолжить процесс стирки стерильной PBS, чтобы смыть оставшийся этанол.
   Примечание: Все последующие шаги должны быть стерильными, чтобы избежать загрязнения.

1.2 Сбор костного мозга

1. Вырезать проксимальный и дистальный конец каждой кости с парой тонких ножниц, чтобы получить доступ к бедренной и большеберцовой кости валов. Будьте осторожны с этим шагом, так как эти кости сломать очень легко.
2. Флеш кости с теплой средой (M199 + 10% фетальной телячьей сыворотки (FCS), + 1% пенициллина / стрептомицина). Использование стерильного 28-G иглу, 1 мл шприц, а также между 10-15 мл среды накости для полоскания.
3. Держите кости с тонким пинцетом и промыть один за другим, пока она не станет полупрозрачный. Осторожно давить на конце поршень шприца, чтобы минимизировать нагрузку клеток.
4. Фильтр костный мозг через нейлоновую сети 70 мкм и собрать фильтрат. Чтобы извлечь максимальное количество костного мозга, промыть несколько раз в дистальных и проксимальных концах.
5. Промойте сито с PBS и собрать фильтрат. Осторожно выбить мусора и клеточных конгломератов осторожном перемешивании пипеткой.

1.3 Выращивание

1. Центрифуга клеточной суспензии при 250 х г в течение 10 мин при комнатной температуре. Жидкость над осадком сливают и клетки вновь суспендируют в приблизительно 25 мл среды. Повторить один раз.
2. Ресуспендируют клеток в 6 мл среды после второй стадии промывки. Смешайте 50 мкл раствора клеток с 50 мкл трипанового синего. Граф клеток в счетной камере под световым микроскопом. Подсчитать количество Cлоктей в растворе, используя эту формулу:
   
3. Семенной клеток на 6-луночных поверхности сверхнизким крепления пластин, чтобы предотвратить постоянное сцепление с нижней части пластины. Использование концентрации 10 ⁶ клеток на мл до 6 мл на лунку.
4. Дополнение суспензии с 20 нг / мл M-CSF, чтобы способствовать клеточной дифференциации.
5. Культуры клеток в течение 5 дней при 37 ° С и 5% диоксида углерода и наблюдать ежедневно.

1.4 Сбор клеток

Примечание: Эти шаги должны быть выполнены на льду. Продолжайте либо 1.4.1 или 1.4.2 соответственно.

1. На данный момент, урожай всю культуру, в том числе дифференцированных макрофагов, которые присоединятся к культуре пластин, даже если они ультра-низким крепления на поверхности пластины.
   1. Заготавливают всю культуру, осторожно пипеткой и снятие с раствором 4 ° C PBS, 0,5% бычьего сывороточного альбумина (БСА) и 2 мМ ЭДТА. Повторяйте, пока плиты не ясны оставшихся прилипшие клетки - подтвердить под микроскопом, если не уверены.
2. С другой стороны, отбросить прилипшие макрофаги, собирая супернатант с клетками в суспензии, которые содержат преимущественно моноциты.
   1. Урожай неадгезированных клетки с раствором ЭДТА бесплатно PBS и 0,5% БСА. Не наносите слишком много сил для того, чтобы избежать выбивании мягко прикрепленных макрофаги.

1,5 FACS-анализа (Необязательно)

Примечание: Можно разрушают клеточную суспензию CD117 ⁺ stem- и клеток-предшественников с использованием MACS. Используйте протоколы производителя для этой процедуры.

1. Сбора клеток по любому шаги 1.4.1 или 1.4.2.
2. Центрифуга клетки при 250 х г в течение 10 мин при 4 ° С и повторить этот шаг снова.
3. Ресуспендируют, по меньшей мере 250000 клеток в 300 мкл FACS бuffer за зондом.
4. Передача раствора клеток на 96-луночного планшета (30 мкл на лунку).
5. Центрифуга клеточной суспензии при 250 х г в течение 5 мин при 4 ° С.
6. Удалить супернатант и добавить 25 мкл антитела в каждую лунку (использование изготовлением разбавления).
7. Пятно клеток с антителами (следующих протоколов производителя для сотового фенотипирования после стадий 1.5.1-1.5.6. Часто используемые маркеры для идентификации моноцитов / макрофагов включают CD11b, F4 / 80 (рис 3), CD115 (Рисунок 2), и Gr- 1.
   Примечание: Для дальнейшего описания сотовых решений, использование маркеров, таких как CD4, CD8a, CD11c, CD25, CD45, CD45R, CD62L, CD80, CD86, CD145, CD117, MHCⅡ, Ly6C, Ly6G и CD192 рекомендуется. Сотовые характеристики были описаны ранее ^12.
8. Инкубируйте зондов в течение 20 мин при 4 ° С.
9. Центрифуга зонды на 250 мкг в течение 5 мин при 4 ° С и ресуспендируют в 200 мкл FACS буфера. Повторите йэто шаг в два раза.
10. Передача зонды в FACS труб и выполнить анализ FACS ^12.
11. Выполнение анализа FACS ¹² в день 0, 3 и 5 для анализа клеточной дифференциации.

2. Хвост вену

2.1 Подготовка

1. Теплый животных на нагревательной плитке при 37 ° С в течение примерно 10 мин. Соблюдайте животных при нагревании распознавать признаки перегрева.
2. Ресуспендируют моноциты, выделенные с шагом 1.1- 1,4, в 150 мкл NaCl, и загрузить клеток в 1 мл инсулиновый шприц с иглой в 30G. Слегка вихрь решение перед загрузкой в ​​шприц, чтобы обеспечить все моноциты вводили. Всегда обрабатывать клетки на льду, чтобы избежать приложение тепла и опосредованной активации моноцитов.

2.2 Удерживающие

1. Не беспокоить других мышей в клетке при выборе мыши для внутривенной инъекции.
2. Наведите в фиксатор. Избегайте слишком много прEssure и будьте осторожны с задних конечностей. (Рисунок 4)
   Примечание: В качестве альтернативы, использовать общую анестезию, чтобы гарантировать стресс свободное обращение с животными.
3. Убедитесь, что мышь имеет пространство для дыхания перед закрытием фиксатор.

2.3 Injection

1. Лечить инъекции с дезинфицирующего средства. Спрей на хвосте мыши и дать постоять по крайней мере, 1 мин.
2. Остановка венозного кровотока хвоста, слегка надавливая на боковую хвостовую части выше места инъекции, для лучшей видимости вен.
3. Включить задние 90 градусов, перед инъекцией. (Рисунок 5)
4. Вводите под углом 45 градусов. Вводите медленно и не более 5 мкл на грамм не допустить причинения вреда животным.
5. Если есть волдырь, который является признаком неудачной инъекции, немедленно прекратить и повторить инъекцию проксимальнее.
6. Остановить кровотечение на стороне впрыска путем легкого рия около 1 мин.
7. В конце процедуры, открыть втягивающим и поместить курсор в клетке.
8. Обратите внимание на мышь в течение 20 мин, чтобы гарантировать, что животное не страдают от инъекции и грудины лежачее положение сохраняется. Увеличьте время наблюдения до мыши не восстановит достаточное сознание. Вернуться мышь, чтобы компании других животных только после того, как он полностью выздоровел.

Результаты

Раствор экстрагировали клеток из мышиного костного мозга состоит из различных типов клеток. Основные типы клеток являются лимфоциты, гранулоциты и моноциты. Типы клеток можно оценить по размеру и степени детализации, который показан на фиг.1 как для нативных суспензий и клето...

Обсуждение

Мы опишем простой и экономичный способ, чтобы изолировать большое количество крысиных моноцитов из костного мозга. По сравнению с другими протоколов, использующих периферической крови, которые получают моноцитов урожайности ⁵ 1,4 x10 ^6, мы можем получить более высокие урожаи ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well-ultra-low-attachment plate	Corning Incorporated, NY, USA		6-well-ultra-low-attachment plate, with cap, sterile
8- 12 week old, male, balb/c mice	Charles River, Sulzfeld, Germany
96-well-plate	Greiner bio one GmbH, Frickenhausen, Germany
Blue dead cell stain	Life technologies GmbH, Darmstadt, Germany
Bovine serum albumine	GE Healthcare, Freiburg, Germany		Fraction V, pH 7.0
Canules	B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany		28G, 30G
CD115	eBioscience, San Diego, USA	12-1152
CD11b	eBioscience, San Diego, USA	53-0112
Cell culture dish	Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany		With cap, steril
Centrifuge	Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Germany		Allegra® X-15R centrifuge
Depilatory cream	Veet, Mannheim, Germany
Disinfection agent	Schülke&Mayr GmbH, Norderstedt, Germany		Kodan Tinktur forte
Disposable scalpel No.10	Feather safety razor Co.Ltd, Osaka, Japan
EDTA	Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Ethanol 96%	Otto Fischar GmbH und Co KG, Saarbrücken, Germany
Extraction unit Pipetus	Hirschmann Laborgeräte GmbH & Co.KG, Eberstadt, Germany
F4/80	AbD Serotec, Düsseldorf, Germany	MCA497APC
FACS buffer	Manufactured by our group with single components		PBS, 0.5% BSA, 0.1% NaN3
FACS device	Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA		BD FACS Canto II
FACS tubes	Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA
Falcon® pipette	Becton Dickenson Labware, NY, USA
Fetal calf serum	Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Fine forceps	Rubis, Stabio, Switzerland
Gloves	Rösner-Matby Meditrade GmbH, Kiefersfelden, Germany
Gr1	eBioscience, San Diego, USA	53-5931
Heating plate	Labotect GmbH, Göttingen, Germany		Hot Plate 062
Incubator	Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Germany		Incu safe
Isofluran	Baxter Deutschland GmbH, Unterschleißheim, Germany
Light microscope	Carl Zeiss SMT GmbH, Oberkochen, Germany		Axiovert 40 °C
Macrophage-Colony Stimulating Factor	Sigma Aldrich, Hamburg, Germany	SRP3110
Mechanical shaker	IKA, Staufen, Germany		ms2 minishaker
Medium 199	PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria		Warm in 37 °C water bath before use
Micro test tubes	Eppendorf AG, Hamburg, Germany
Microbiological work bench	Thermo Electron, LED GmbH, Langenselbold, Germany		Hera safe
Monocyte wash buffer	Manufactured by our group with single components		PBS, 0.5% BSA, 2 mM EDTA
Mouse restrainer	Various
NaCl	Berlin Chemie AG, Berlin, Germany
NaN3 (sodium acide)	Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Neubauer counting chamber	Paul Marienfeld GmbH und Co.KG, Lauda-Königshofen, Germany
Nylon cellsieve	Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA		Cell strainer, 70 µm mesh size
Penicillin/Streptomycin	Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Phosphate buffered saline	Life technologies GmbH, Darmstadt, Germany		pH 7.4, sterile
Pipettes	Eppendorf AG, Hamburg, Germany		10µl/100µl/200µl/1,000µl
Pipetting heads	Eppendorf AG, Hamburg, Germany
Serological pipette	Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany		Cellstar 5 ml, 10 ml
Suction unit	Integra bioscience, Fernwald, Germany		Vacusafe comfort
Surgical scissors	Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA
Syringe	B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany		1 ml Omnifix® -F insuline syringe
Tubes with cap	Greiner bio one GmbH, Frickenhausen, Germany		15 ml/50 ml Cellstar tubes
Warm water bath	Julabo Labortechnik GmbH, Seelbach, Germany		Julabo SW22