המונוציטים בידוד והזרקה תוך ורידית של Murine מח העצם נגזר

Summary

Here we present a protocol that generates large amounts of murine monocytes from heterogeneous bone marrow for translational applications. In comparison to others, this new method helps reduce the number of sacrificed animals and lowers costs by avoiding expensive methods such as high gradient magnetic cell separation (MACS).

Abstract

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of various fields in biomedical science. The method described below is a simple and effective way to isolate murine monocytes from heterogeneous bone marrow.

Bone marrow from the femur and tibia of Balb/c mice is harvested by flushing with phosphate buffered saline (PBS). Cell suspension is supplemented with macrophage-colony stimulating factor (M-CSF) and cultured on ultra-low attachment surfaces to avoid adhesion-triggered differentiation of monocytes. The properties and differentiation of monocytes are characterized at various intervals. Fluorescence activated cell sorting (FACS), with markers like CD11b, CD115, and F4/80, is used for phenotyping. At the end of cultivation, the suspension consists of 45%± 12% monocytes. By removing adhesive macrophages, the purity can be raised up to 86%± 6%. After the isolation, monocytes can be utilized in various ways, and one of the most effective and common methods for in vivo delivery is intravenous tail vein injection.

This technique of isolation and application is important for mouse model studies, especially in the fields of inflammation or immunology. Monocytes can also be used therapeutically in mouse disease models.

Introduction

The isolation of monocytes is important and critical for many in vitro and in vivo studies. These cells are targets for diseases such as peripheral arterial disease, coronary heart disease, or other ischemic diseases, since collateral vessel growth is strongly driven by local inflammation. Inflammatory responses include endothelial activation and local recruitment of leukocytes, mainly monocytes, which then mature to macrophages and create a highly arteriogenic environment by secreting multiple growth factors to induce the remodeling of an arteriole into a functional collateral artery^1-3. Monocytes also mature to dendritic cells, which are frequently used for immunological studies^4,5 and cancer research^6,7.

Problematic in the approach for monocyte isolation from peripheral blood⁸ is the high number of donor animals needed to produce a sufficient amount of monocytes for most analyses. Former protocols describe methods such as density gradient centrifugation and cell depletion via MACS⁹ when isolating monocytes; however, these techniques can alter the characteristics and functionality of monocytes which can lead to difficulties in interpretation^10,11. Moreover, these methods are difficult and can reduce experimental reproducibility.

Our aim with this protocol is to provide a simple and cost effective method to generate large amounts of bone marrow-derived monocytes. Due to the high cell yield of 11 x 10⁶ ± 3 x 10⁶ cells obtained by this protocol, we can substantially reduce the number of mice required during the isolation of bone marrow-derived monocytes. The procedure can be completed within a minimal amount of time, and without using expensive and complicated techniques as referenced above. Here, we extract monocytes from native bone marrow suspension of donor mice, cultivate the suspension on ultralow attachment plates, and supplement the solution with 20 ng/ml M-CFS. On day 5 of incubation, cells are harvested and characterized to confirm functional and phenotypic properties.

For experiments in the field of arteriogenesis, intravenous transplantation of these bone marrow-derived monocytes into mice is an effective method of systemic drug delivery, which can be combined with femoral artery ligation in common peripheral arterial disease models.

Protocol

מחקר זה בוצע באישורה של המדינה סקסוניה וסקסוניה-אנהלט, Regierungspraesidium דרזדן / האלי, על פי סעיף 8 לחוק הגרמני להגנה על בעלי חיים (24D-9,168.11-1 / 2008-24).

בידוד תא 1

1.1 הכנת עצם הירך לבין השוקה

1. להרדים את העכבר באמצעות 5% ריכוז isoflurane על ידי אידוי isoflurane לפח סגור. לאחר העכבר הפסיק לזוז במשך 3 שניות, לבצע הנקע בצוואר הרחם.
2. לחטא את הגפיים האחורי עם אתנול (96%). להסיר את העור ושרירים ולהפריד את העצמות עם אזמל סטרילי.
   1. התחל עם חתך בעור מפשעה, ולהרחיב את החתך לכיוון malleolus המדיאלי ולבצע נתיחה חוזר של העור סביב העגל הנמוך. הסר את העור של הרגליים לחלוטין על ידי לקלף אותה proximally.
   2. לנתק את השריר הארבע ראשי מעצם הירך עם אזמל חד, תסיר את שני peroneus הקדמיוקבוצות השרירים הגסטרוקנמיוס וdisarticulate הרגל במפרק הירך על ידי איתור ולנתח את הרצועות.
   3. התחל anteriorly ולהמשיך סביב המפרק על ידי הסיבוב בזהירות את הרגל וtransecting הרצועות, ובכך disarticulating המשותף.
3. לשטוף עצם ירך ועצם שוק עם 96% אתנול למשך תקופה מינימאלית של 90 שניות כדי להבטיח הכנת תא ספטית. להמשיך את תהליך השטיפה עם PBS סטרילי כדי לשטוף נותר אתנול.
   הערה: כל הצעדים הבאים חייבים להיות סטרילי כדי למנוע זיהום.

1.2 קצירה של מח העצם

1. חותך את הקצה הפרוקסימלי והדיסטלי של כל עצם עם זוג מספריים קנס כדי לקבל גישה לפירי הירך ושוקה. תיזהר עם צעד זה, שכן העצמות האלה לשבור בקלות רבה.
2. לשטוף את העצמות עם מדיום חם (M199 10% בסרום + עגל עוברי (FCS), + 1% פניצילין / סטרפטומיצין). השתמש במחט סטרילית 28-G, מזרק 1 מיליליטר, ובין 10-15 מיליליטר בינונייםעצם לשטיפה.
3. החזק את העצם עם מלקחיים עדינים ולשטוף אחד אחד עד שהוא הופך שקוף למחצה. זהירות להחיל לחץ בסופו של בוכנת המזרק על מנת למזער מתח תא.
4. סנן את מח העצם באמצעות אינטרנט ניילון 70 מיקרומטר ולאסוף התסנין. כדי לחלץ את הכמות המרבית של מח עצם, לשטוף שוב ושוב מהקצוות דיסטלי ופרוקסימלי.
5. יש לשטוף את המסננת עם PBS ולאסוף התסנין. לסלק פסולת בזהירות וקונגלומרטים סלולריים על ידי ערבוב וpipetting עדינים.

1.3 טיפוח

1. צנטריפוגה ההשעיה התא ב 250 XG במשך 10 דקות ב RT. בטל supernatant ו resuspend התאים עם כ 25 מיליליטר של מדיום. חזור פעם אחת.
2. Resuspend תאי 6 מיליליטר של מדיום לאחר שלב הכביסה השני. מערבבים 50 μl של פתרון התא עם 50 μl של trypan כחול. ספירת התאים בתא ספירה תחת מיקרוסקופ אור. לחשב את מספר גאמות בפתרון באמצעות נוסחה זו:
   
3. זרעי התאים על צלחות משטח נמוך במיוחד מצורף 6-גם למניעת הדבקה קבועה לתחתית הצלחת. השתמש בריכוז של 10 ⁶ תאים למ"ל עם עד 6 מיליליטר לכל טוב.
4. להשלים את ההשעיה עם M-CSF מיליליטר / 20 ng לקדם התמיינות תאים.
5. תרבות התאים במשך 5 ימים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני ולבחון מדי יום.

1.4 קצירה של תאים

הערה: עליך לבצע פעולות אלה על קרח. המשך עם או 1.4.1 או 1.4.2 בהתאם.

1. בשלב זה, לקצור את התרבות כולה, כולל מקרופאגים המובחנים שידבקו לתרבות-הצלחות, גם אם הם צלחות משטח נמוך במיוחד קובץ מצורף.
   1. לקצור את כל התרבות על ידי pipetting העדין וניתוק עם פתרון של 4 מעלות צלזיוס PBS, 0.5% אלבומין בסרום שור (BSA) ו- 2 mM EDTA. חזור על פעולה עד הצלחות ברורות של שנותר תאים חסיד - לאשר תחת מיקרוסקופ אם אינך בטוח.
2. לחלופין, לבטל מקרופאגים חסיד על ידי איסוף supernatant עם התאים בתרחיף, שבעיקר מכילים מונוציטים.
   1. קציר התאים שאינם חסיד עם פתרון של PBS ללא EDTA וBSA 0.5%. אין ליישם בכוח רב מדי על מנת להימנע מפירוק מקרופאגים המעטה חסיד.

1.5 FACS-ניתוח (אופציונאלי)

הערה: ניתן לרוקן את ההשעיה התא של תאי stem- ואב CD117 ⁺ על ידי השימוש בMACS. להשתמש בפרוטוקולי יצרן להליך זה.

1. קציר התאים על פי שני שלבים 1.4.1 או 1.4.2.
2. צנטריפוגה התאים ב 250 XG במשך 10 דקות ב 4 ° C ולחזור על פעולה זו שוב.
3. Resuspend לפחות 250,000 תאים ב300 μl של FACS בuffer לבדיקה.
4. העבר את פתרון תא על 96-היטב צלחת (30 μl לכל היטב).
5. צנטריפוגה ההשעיה התא ב 250 XG במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
6. הסר את supernatant ולהוסיף 25 μl של נוגדן לכל טוב (דילול יצרן שימוש).
7. כתם התאים עם נוגדנים (להלן פרוטוקולי יצרן לתא phenotyping לאחר צעדי 1.5.1-1.5.6. סמנים בשימוש נפוץ לזיהוי מונוציטים / מקרופאג כוללים CD11b, F4 / 80 (איור 3), CD115 (איור 2), וGr- 1.
   הערה: לתיאור נוסף של פתרונות סלולריים, השימוש בסמנים כמו CD4, CD8a, CD11c, CD25, CD45, CD45R, CD62L, CD80, CD86, CD145, CD117, MHCⅡ, Ly6C, Ly6G, וCD192 מומלץ. מאפיינים סלולריים תוארו בעבר ^12.
8. דגירה הבדיקות במשך 20 דקות על 4 מעלות צלזיוס.
9. צנטריפוגה הבדיקות ב 250 XG במשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס וגלולה עם 200 μl של חיץ FACS. ה חזורהוא צעד פעמיים.
10. העבר את הבדיקות לתוך צינורות FACS ולבצע ניתוח FACS ^12.
11. ביצוע ניתוח FACS ¹² ביום 0, 3 ו -5 לנתח התמיינות תאים.

הזרקה לוריד 2. זנב

2.1 הכנה

1. לחמם את בעלי החיים על צלחת חימום על 37 מעלות צלזיוס למשך כ -10 דקות. שים לב לבעלי החיים בזמן ההתחממות לזהות סימנים של התחממות יתר.
2. Resuspend מונוציטים, מבודדים בצעדי 1.1- 1.4, ב -150 μl של NaCl, ולטעון את התאים לתוך מזרק אינסולין 1 מיליליטר עם מחט 30G. קל מערבולת הפתרון לפני טעינת המזרק על מנת להבטיח את כל מונוציטים מוזרקים. תמיד להתמודד עם תאים על קרח, כדי למנוע עיקול בתיווך חום והפעלה של מונוציטים.

2.2 הרחקה

1. הימנע מלהפריע עכברים אחרים בכלוב בעת בחירת עכבר להזרקה תוך ורידית.
2. מניחים את העכבר לעוצר. הימנע יותר מדי יחסי ציבורחסימת חצוצרות ולהיות זהירות עם הגפיים האחורי. (איור 4)
   הערה: לחלופין, להשתמש בהרדמה כללית כדי להבטיח טיפול ללא מתח של בעלי החיים.
3. ודא שיש לו את העכבר מרחב לנשימה לפני סגירת העוצר.

2.3 הזרקה

1. לחטא את אזור ההזרקה עם סוכן חיטוי. תרסיס על הזנב של העכבר ולתת לעמוד במשך דקות לפחות 1.
2. לעצור את זרימת דם ורידית של הזנב על ידי הפעלת לחץ עדין לצד זנב לרוחב מעל אתר ההזרקה, ראות טובה יותר של הוורידים.
3. הפעל את הזנב 90 מעלות, לפני ההזרקה. (איור 5)
4. להזריק בזווית של 45 מעלות. להזריק לאט ולא יותר מ 5 μl לז, כדי למנוע פגיעה בבעלי חיים.
5. אם יש שלפוחית, וזה סימן של הזרקה נכשלה, להפסיק מייד ולחזור על ההזרקה יותר proximally.
6. לעצור את הדימום בצד ההזרקה על ידי יישום p העדיןressure כ 1 דק '.
7. בסופו של ההליך, לפתוח את מפשק ומניח את העכבר בכלוב שלה.
8. שים לב לעכבר במשך 20 דקות על מנת להבטיח כי בעל החיים לא נפגעו על ידי ההזרקה ומתוחזק כיבה sternal. הארך את הזמן של התבוננות עד העכבר להכרה מספקת. החזר את העכבר לחברה של בעלי חיים אחרים רק לאחר שהתאושש באופן מלא.

תוצאות

פתרון התא מופק ממוח העצם העכברי מורכב מסוגי תאים שונים. הסוגים העיקריים של התאים לימפוציטים הם, גרנולוציטים ומונוציטים. ניתן להעריך סוגי תאים על ידי גודל וגרעיניות, המוצג באיור 1 עבור שתי השעיות היליד והתאים שנקטפו לאחר 5 ימים של בידול. שים לב להרכב הסלולרי ה?...

Discussion

אנו מתארים שיטה פשוטה וחסכונית לבודד את הכמויות גדולות של מונוציטים עכבריים ממח עצם. בהשוואה לפרוטוקולים אחרים באמצעות דם היקפי, הלהשיג תשואות מונוציטים ⁵ של 1.4 x10 ^6, אנו מסוגלים להשיג תשואות גבוהות יותר של 11 x 10 ⁶ ± 3 x 10 ⁶ מונוציטים מעכבר תורם יחיד...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well-ultra-low-attachment plate	Corning Incorporated, NY, USA		6-well-ultra-low-attachment plate, with cap, sterile
8- 12 week old, male, balb/c mice	Charles River, Sulzfeld, Germany
96-well-plate	Greiner bio one GmbH, Frickenhausen, Germany
Blue dead cell stain	Life technologies GmbH, Darmstadt, Germany
Bovine serum albumine	GE Healthcare, Freiburg, Germany		Fraction V, pH 7.0
Canules	B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany		28G, 30G
CD115	eBioscience, San Diego, USA	12-1152
CD11b	eBioscience, San Diego, USA	53-0112
Cell culture dish	Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany		With cap, steril
Centrifuge	Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Germany		Allegra® X-15R centrifuge
Depilatory cream	Veet, Mannheim, Germany
Disinfection agent	Schülke&Mayr GmbH, Norderstedt, Germany		Kodan Tinktur forte
Disposable scalpel No.10	Feather safety razor Co.Ltd, Osaka, Japan
EDTA	Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Ethanol 96%	Otto Fischar GmbH und Co KG, Saarbrücken, Germany
Extraction unit Pipetus	Hirschmann Laborgeräte GmbH & Co.KG, Eberstadt, Germany
F4/80	AbD Serotec, Düsseldorf, Germany	MCA497APC
FACS buffer	Manufactured by our group with single components		PBS, 0.5% BSA, 0.1% NaN3
FACS device	Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA		BD FACS Canto II
FACS tubes	Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA
Falcon® pipette	Becton Dickenson Labware, NY, USA
Fetal calf serum	Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Fine forceps	Rubis, Stabio, Switzerland
Gloves	Rösner-Matby Meditrade GmbH, Kiefersfelden, Germany
Gr1	eBioscience, San Diego, USA	53-5931
Heating plate	Labotect GmbH, Göttingen, Germany		Hot Plate 062
Incubator	Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Germany		Incu safe
Isofluran	Baxter Deutschland GmbH, Unterschleißheim, Germany
Light microscope	Carl Zeiss SMT GmbH, Oberkochen, Germany		Axiovert 40 °C
Macrophage-Colony Stimulating Factor	Sigma Aldrich, Hamburg, Germany	SRP3110
Mechanical shaker	IKA, Staufen, Germany		ms2 minishaker
Medium 199	PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria		Warm in 37 °C water bath before use
Micro test tubes	Eppendorf AG, Hamburg, Germany
Microbiological work bench	Thermo Electron, LED GmbH, Langenselbold, Germany		Hera safe
Monocyte wash buffer	Manufactured by our group with single components		PBS, 0.5% BSA, 2 mM EDTA
Mouse restrainer	Various
NaCl	Berlin Chemie AG, Berlin, Germany
NaN3 (sodium acide)	Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Neubauer counting chamber	Paul Marienfeld GmbH und Co.KG, Lauda-Königshofen, Germany
Nylon cellsieve	Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA		Cell strainer, 70 µm mesh size
Penicillin/Streptomycin	Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Phosphate buffered saline	Life technologies GmbH, Darmstadt, Germany		pH 7.4, sterile
Pipettes	Eppendorf AG, Hamburg, Germany		10µl/100µl/200µl/1,000µl
Pipetting heads	Eppendorf AG, Hamburg, Germany
Serological pipette	Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany		Cellstar 5 ml, 10 ml
Suction unit	Integra bioscience, Fernwald, Germany		Vacusafe comfort
Surgical scissors	Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA
Syringe	B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany		1 ml Omnifix® -F insuline syringe
Tubes with cap	Greiner bio one GmbH, Frickenhausen, Germany		15 ml/50 ml Cellstar tubes
Warm water bath	Julabo Labortechnik GmbH, Seelbach, Germany		Julabo SW22