JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

The goal of this procedure is to demonstrate the reproducibility and adaptability of using a microtiter plate format for microalgal screening. This rapid screen combines WATER-Pulse-Amplitude-Modulated (WATER-PAM) fluorometry to measure photosynthetic yield as an indicator of Photosystem II (PSII) health with small volume bacterial-algal co-cultures.

Abstract

الأساليب التقليدية للتلاعب التجريبية من الطحالب قد استخدمت كميات كبيرة من الثقافة (20 مل إلى 5 L)، بحيث يمكن subsampled الثقافة في كافة مراحل التجربة 1-7. الاختزال كميات كبيرة يمكن أن يكون مشكلة لعدة أسباب: 1) أنه يسبب التغير في إجمالي حجم ومساحة السطح: نسبة حجم من الثقافة خلال التجربة. 2) الزائفة التكرار (أي تكرار عينات من نفس المعاملة قارورة 8) وغالبا ما يعملون بدلا من مكررات الحقيقية (أي أخذ العينات من العلاجات تكرار)؛ 3) مدة التجربة محدودة على مجموع الحجم؛ و4) الثقافات ممحوضة أو الجراثيم البكتيرية المعتادة هي صعبة للحفاظ خلال تجارب طويلة الأمد كما يحدث عادة خلال تلوث الاختزال.

استخدام لوحات عيار مكروي تمكن 1 مجلدات ثقافة مل لاستخدامها في كل تكرار، مع ما يصل إلى 48 العلاجات منفصلة داخلوسم لوحة 12.65 X 8.5 × 2.2، مما يقلل من حجم التجريبية والسماح للنسخ المتماثل واسعة دون الاختزال أي علاج. بالإضافة إلى ذلك، هذه التقنية يمكن تعديلها لتناسب مجموعة متنوعة من الأشكال التجريبية من بينها: البكتيري-الطحالب المشترك الثقافات، والاختبارات الطحالب علم وظائف الأعضاء، والسم فحص 9-11. الآبار الفردية مع طحلب، بكتيريا و / أو زملاء الثقافات يمكن أخذ عينات للعديد من الإجراءات المخبرية بما في ذلك، ولكن ليس على سبيل الحصر: WATER-نبض السعة التضمين (WATER-PAM) التألق، المجهري، مستعمرة بكتيرية تشكيل وحدة (وت) التهم والتدفق الخلوي. مزيج من شكل وحة microtiter وWATER-PAM التألق يسمح للقياسات السريعة متعددة من العائد الضوئي والمعلمات الضوئية الأخرى مع تقلب منخفض بين العينات، استنساخ عالية ويتجنب الكثير من المزالق من الاختزال والدامجانة زجاجة أو قارورة مخروطي الشكل على مدار التجربة .

Introduction

وقد جرت العادة على درس علم وظائف الأعضاء العوالق النباتية في التجارب المتوسط ​​على نطاق واسع من 20 مل في قوارير المخروطية إلى 5 لتر في قوارير 1-7. هذا على نطاق تجريبي يتطلب الاختزال لرصد التجريبي، كما التضحية عينات تكرار لكل نقطة زمنية يخلق الإعداد التجريبية لا يمكن السيطرة عليها.

القدرة على زيادة عدد تجارب مستقلة أثناء استخدام نفس المساحة حاضنة نهاري من قبل التصغير حجم التجريبي للتجارب فسيولوجيا الطحالب سوف تخفيض أو إزالة القيود المفروضة على الاختزال والزائفة النسخ المتماثل من كميات كبيرة. وقد تم تطوير شكل وحة microtiter لاختبارات بيولوجية الطحالب باستخدام حجم 1 مل الثقافة تجريبيا لمعالجة الطحالب في ظروف متغيرة. يسمح هذا الحجم تجريبي صغير لعدد من مكررات إلى أن زيادة، ويزيد من استنساخ التجربة نظرا لتقلب انخفضت بين العينات تكرار والتجارب، ويسمح للنسخ المتماثل صحيح مع الحفاظ على الضوابط التجريبية (أي والثقافات الطحالب ممحوضة) لمدة 140 يوما (الشكل 2) 12.

ويتم تكييف هذا الشكل وحة microtiter بسهولة لمجموعة متنوعة من الأسئلة التجريبية، مثل: هل يمكن لأي بكتيريا يكون التفاعل التكافلية، محايد أو الممرضة مع مضيفه الطحالب؟ هو إضافة لتحفيز مجمع أو سامة إلى طحلب؟ هذه الأسئلة وغيرها لا يمكن معالجتها بطريقة عالية الإنتاجية السريعة باستخدام هذا الشكل الجديد 9-11.

A 48-جيدا لوحة الثقافة عيار مكروي تتيح لكل 1 مل جيدا ليكون الإعداد التجريبية المستقلة التي تم أخذ عينات في واحدة الوقت نقطة. يمكن أخذ عينات المعلمات المختلفة من هذا المجلد 1 مل بما في ذلك، ولكن لا تقتصر على: مضان الكلوروفيل والمعلمات الضوئية باستخدام WATER-نبض السعة التضمين (WATER-PAM) قياس التألق (انظر المواد والمعدات الجدول) 13. WATER-PAM التألق هو تقنية سريعة وغير الغازية التي يمكن استخدامها لمراقبة التجارب أجريت مع الطحالب 13. وهو يتيح قياس كفاءة التمثيل الضوئي والصحة PSII من حجم صغير الثقافة (150-300 ميكرولتر من ثقافة المخفف في المتوسط ​​إلى 2 - حجم مل 4 لWATER-PAM) 14،15. بالإضافة إلى WATER-PAM التألق، وهذا الإعداد يمكن استخدامها لقياس مجموعة متنوعة من العوامل الأخرى بما في ذلك، ولكن لا تقتصر على: الفحص المجهري لتصور البكتيريا التي تعلق على خلايا الطحالب والتغيرات في مورفولوجيا الخلايا الطحلبية. مستعمرة بكتيرية تشكيل وحدة (وت) التهم الموجهة إليه. والتدفق الخلوي لعدد خلايا الطحالب وتحديد المجموعات السكانية الفرعية.

Protocol

1. الحسابات لإعداد التجريبية

  1. حساب حجم الطحالب و / أو الثقافات البكتيرية اللازمة للضوابط التي ستكون مطلوبة للتجربة برمتها باستخدام المعادلة 1:
    figure-protocol-305
    حيث y يساوي عدد الضوابط المطلوبة يوميا و z يساوي عدد الأيام.
  2. حساب حجم الثقافات الطحالب و / أو البكتيرية أن هناك حاجة للمشاركة في الثقافات للتجربة باستخدام المعادلة 2:
    figure-protocol-610
    ملاحظة: من الممكن أن تحل محل التجارب "شارك في ثقافة" مع أي شاشة المركبة؛ مجرد ضبط المركب النهائي، المذيبات وتركيزات الطحالب لتتناسب مع التصميم التجريبي.
  3. استخدام المعادلات 1 و 2 لحساب الحجم النهائي للثقافة الطحالب في وقت مبكر الأسي (عادة 5 أيام ل~ 10 4 خلية / مل لكن هذا يجب أن يحدده performiنانوغرام منحنى نمو الطحالب) المطلوبة للتجربة (هناك حاجة إلى هذا الحجم لخطوة 2.3) باستخدام المعادلة 3:
    figure-protocol-1152
  4. استخدام المعادلات 1 و 2 لحساب الحجم النهائي من 10 4 وت م / ثقافة البكتيرية مل (أو التلقيح تركيز المطلوب) المطلوبة للتجربة (هناك حاجة إلى هذا الحجم لخطوة 4.2) باستخدام المعادلة 4:
    figure-protocol-1473
    ملاحظة: استخدم 10 مل إضافية في الخطوات 1.3 و 1.4 لحساب pipetting لخطأ وأي الاختبارات التي يتم تنفيذها (على سبيل المثال، WATER-PAM، التدفق الخلوي، المجهري، الخ) على 0 د. زيادة هذا الحجم إذا لزم الأمر لتتناسب مع التصميم التجريبي.
    ملاحظة: للحصول على حساب مثال لتجربة 8 أيام انظر القسم 10. انظر الجدول التكميلي عن وصفات وسائل الإعلام.

2. تزايد خلايا الطحالب لإعداد التجريبية

  1. عزل أو الحصول علىبنشاط متزايد ثقافة الطحالب ممحوضة.
  2. نقل جو معقم و مطهر 10٪ من الحجم النهائي للثقافة الطحالب إلى متوسطة الطحالب معقم (على سبيل المثال، L1 أو ما شابه المتوسطة الطحالب البحرية، انظر المواد والجدول المعدات)، وضمان 1: 9 التخفيف من الثقافة الطحالب في متوسطة جديدة. تنمو الطحالب المخفف في حاضنة نهاري باستخدام ظروف النمو التي سبق تحديدها لتلك السلالة (على سبيل المثال، 18 ° C مع 16: ضوء 8 ساعة: يستخدم دورة الظلام شيوعا).
  3. عندما وصلت الى ثقافة المبكرة الأسي المرحلة، وإعادة ثقافة الطحلب في نفس الطحالب العقيمة المتوسطة (على سبيل المثال، L1 أو ما شابه المتوسطة الطحالب البحرية)، وضمان التركيز النهائي هو 1: 9 تخفيف وأن الحجم النهائي من الطحالب يساوي V A احتساب (الخطوة 1.3).
    ملاحظة: من المهم للتأكد من هذه الثقافات هي ممحوضة. اختبار جميع وسائل الإعلام الطحالب والزجاجات الأسهم الطحالب للتلوث بواسطة الطلاء قسامة 20 ميكرولتر على وسيلة البكتيريا البحرية عام (على سبيل المثال، البحريةمرق 2216 تستكمل مع 1.5٪ أجار أو ما شابه).
  4. تنمو ثقافة الطحالب إلى المرحلة في وقت مبكر الأسي (~ 10 4 خلية / مل).
    ملاحظة: كل سلالة الطحالب يحتوي على منحنى النمو فريدة من نوعها تبعا لظروف زراعة. المرحلة المبكرة الأسي (~ 10 4 خلية / مل) يمكن تحديد عن طريق إجراء منحنى نمو الطحالب على أساس كثافة الخلية (أي باستخدام التدفق الخلوي أو المجهري).

3. إعداد الخلايا البكتيرية للتلقيح

  1. قبل تحديد تركيز البكتيريا (وت م / مل)، والكثافة البصرية (OD) من البكتيريا في مرحلة ثابتة عن طريق القيام منحنى النمو في الظروف المتوسطة والنمو البكتيرية المختارة (على سبيل المثال، البحرية مرق 2216 عند 25 ° C و 160 دورة في الدقيقة، أو ما شابه). استخدام هذه المعلومات لزراعة الخلايا (خطوة 3.3) في وقت لاحق لتمييع الخلايا بشكل صحيح في الخطوة 3.7.
  2. جو معقم و مطهر نقل مستعمرة بكتيرية معزولة ونمت حديثا من لوحة أجار 1.5٪ (على سبيل المثال، البحرية مرق 2216 يونةmented مع 1.5٪ أجار أو ما شابه ذلك وسط صلب البكتيريا البحرية) في 5 مل من المتوسط ​​السائل البكتيري (على سبيل المثال، البحرية مرق 2216 أو المتوسطة البكتيريا البحرية مماثل).
  3. تنمو هذه البكتيريا إلى مرحلة ثابتة على طبل أو المتداول شاكر (~ 12-36 ساعة، اعتمادا على بكتيريا). التخطيط للتجربة بحيث يصل بكتيريا مرحلة ثابتة (~ 10 أغسطس - 10 سبتمبر وت م / مل) في نفس الوقت أن خلايا الطحالب قد وصلت إلى مرحلة مبكرة الأسي (~ 10 4 خلية / مل).
  4. باستخدام ماصة، وغسل أسفل أي بيوفيلم تعلق على أنبوب اختبار في المتوسط. ماصة 1 مل من ثقافة البكتيرية جيدة الامتزاج في العقيمة 1.5 مل microtube. الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 14،000 ز س.
  5. إزالة والتخلص من طاف (وسائل الإعلام البكتيري) دون الإخلال بيليه (الخلايا البكتيرية). إضافة 1 مل من وسائل الاعلام عقيمة الطحالب (على سبيل المثال، L1 أو ما شابه ذلك) إلى microtube (مع بيليه). دوامة microtube ل resuspend بيليه في وسائل الإعلام الطحالب.
  6. غسل الثاني:كرر الخطوة 3.5.
    ملاحظة: فمن الأهمية بمكان أن غسل الخلايا البكتيرية مع وسائل الإعلام الطحالب من أجل إزالة شاملة في جميع وسائل الإعلام البكتيرية، ومخلفات الخلايا والبروتينات والجزيئات الصغيرة تفرز من الخلايا قبل بتلقيح الطحالب معهم لأن ذلك قد تغيير التركيبة الغذائية ل وسائل الإعلام الطحالب أو إدخال الجزيئات النشطة بيولوجيا إلى الشاشة.
  7. متسلسل تمييع الخلايا البكتيرية غسلها في وسائل الإعلام الطحالب، إلى تركيز النهائي الذي هو 100 أضعاف أكثر تركيزا من تركيز البكتيريا النهائي المطلوب (وت م / مل). حفظ microtube تحتوي الخلايا التي تم غسلها والمخفف في وسائل الإعلام الطحالب للخطوة 4.2.
    ملاحظة: خطة التجربة على أساس وجود نسبة 1: 1 من الطحالب للبكتيريا على 0 د. للقيام بذلك تركيز البكتيريا الأولي المطلوب للتجربة هو 10 4 وت م / مل، وذلك في خطوة 3.7 الخلايا الأولية يجب أن تضعف بشكل متسلسل إلى 10 6 وت م / مل.

4. البكتيريا الإعداد لتجربةإعداد آل

  1. إعداد 4 معقمة تعقيمها الزجاج قوارير المخروطية وتسمية لهم: أ) "الطحالب السيطرة قارورة، ب) 'المخفف البكتيرية قارورة الأسهم، ج)" قارورة السيطرة البكتيرية، ود) "قارورة ثقافة مشتركة".
  2. تمييع تعليق البكتيرية من خطوة 3.7 1:99 مع وسائل الإعلام الطحالب العقيمة إلى الحجم النهائي = V B (الخطوة 1.4). جعل التخفيف في قارورة وصفت الأسهم البكتيرية المخفف (الخطوة 4.1).
    ملاحظة: في المثال السابق (الخطوة 4.2)، وهذا يعطي 1:99 تخفيف تركيز النهائي من 10 4 وت م / مل. قارورة دوامة لخلط الخلايا.
  3. ماصة السيطرة V (الخطوة 1.1) من الأسهم البكتيرية المخفف ووضعها في السيطرة القارورة البكتيرية.
  4. السيطرة V ماصة من الطحالب معقمة متوسطة إلى سيطرة القارورة البكتيرية (هذا هو 1: 1 تمييع). قارورة دوامة لخلط الخلايا وتوضع جانبا لخطوة 7.3.
  5. ماصة V شارك في ثقافة من الأسهم البكتيرية المخففقارورة إلى قارورة ثقافة مشتركة، ووضع قارورة جانبا لخطوة 6.1.
    ملاحظة: عند القيام متعددة المشترك الثقافات على نفس الطحالب في وقت واحد (أي ثقافة مشتركة من اثنين من بكتيريا مختلف العزلات مع عنصر تحكم واحد) فمن الضروري إعادة حساب V شارك في ثقافة لكل سلالة على حدة ثم كرر الخطوة 4.5 لكل ثقافة مشتركة على حدة. ومن الضروري أيضا لزيادة V A المحسوبة في الخطوة 1.3 لتشمل كل من شارك في الثقافات هو مبين في المعادلة 5:
    figure-protocol-7988

5. إعداد الطحالب لإعداد التجريبية

  1. بلطف مزيج من الثقافة الطحالب المبكرة الأسي (من الخطوة 2.4) مع ماصة طرف واسعة الفم حتى تظهر خلايا مختلطة أيضا.
  2. السيطرة V ماصة من الزجاجة الأسهم الطحالب لسيطرة قارورة الطحالب. ماصة بلطف باستخدام ماصة 10 مل. ثم العودة زجاجة الأسهم الطحالب في الحاضنة نهاري.
  3. ماصة V تابعرول متوسطة الطحالب معقم للقارورة السيطرة الطحالب (هذا هو 1: 1 تمييع). دوامة لخلط القارورة ووضعه في الحاضنة نهاري، لحين الحاجة إليها للخطوة 7.4.

6. إعداد التجريبية المشارك الثقافة

  1. بلطف ماصة V شارك في ثقافة من الأسهم قارورة الطحالب في قارورة البكتيرية شارك في ثقافة من الخطوة 4.5. العودة شارك في ثقافة القارورة إلى حاضنة نهاري لحين الحاجة إليها للخطوة 7.5.
    ملاحظة: إن تركيز البكتيريا في السيطرة البكتيرية يجب أن يساوي تركيز البكتيريا في تجريبية شارك في الثقافة. وبالمثل، ينبغي تركيز الطحالب في السيطرة الطحالب يساوي تركيز الطحالب في تجريبية شارك في الثقافة. من خلال وجود نفس تركيزات البكتيرية والطحالب الأولية، يمكن مقارنة الكثافة السكانية في كافة مراحل التجربة.

7. إعداد لوحات عيار مكروي

  1. تقسيم معقمة 48-جيدا وحة microtiter حسب الشكل 1.تسمية فوق الآبار الخارجية التي تحتوي إما مخفف معقمة أو غير الضوئي عينات.
    ملاحظة: التوزيع العشوائي للآبار لوحة يمكن القيام به لعينات أخذت في نفس اليوم. على سبيل المثال، سيتم أخذ عينات رباعي 1 في 1 د في التجربة. الآبار التي ينبغي أن العشوائية هي B2 - 4 و C2 - 4. ترك محيط لوحة مليئة محلول معقم كما هو مبين في الشكل (1).

figure-protocol-10205
. الشكل 1. تمثيل تخطيطي لوضع عينة في وحة microtiter 48-جيدا ويلز والمراد شغلها على النحو التالي: الأعمدة 1 و 6 والآبار من A إلى F ( figure-protocol-10435 ) تمتلئ 1 مل 1X PBS (أو غيرها من محلول معقم / وسائل الإعلام). الصفوف ألف وF والآبار 2-8 ( figure-protocol-10589 ) تمتلئ 1 مل السيطرة البكتيرية. ريال عمانيWS B وE الآبار 2-8 ( figure-protocol-10716 ) تمتلئ 1 مل السيطرة الطحالب. الصفوف C و D والآبار 2-8 ( figure-protocol-10837 ) تمتلئ 1 مل ثقافة مشتركة. وينقسم لوحة في 4 الأرباع (A2، A5، D2، وD5) هذه الأرباع هي كل أيام أخذ العينات محددة 1-4، وهذا ينبغي أن العشوائية في جميع أنحاء لوحات وصفت وفقا لذلك. في كل يوم ونحن ننصح العشوائي سيطرة الطحالب ( figure-protocol-11122 ) وشارك في ثقافة ( figure-protocol-11205 ) الآبار باستخدام مولد رقم عشوائي. تسمية غطاء على برنامج تلفزيوني 1X و / أو آبار المراقبة البكتيرية لمنع التظليل الثقافات الطحالب.

  1. ماصة 1 مل 1X الفوسفات عازلة حل (PBS، ودرجة الحموضة 7.4) أو غيرها من محلول معقم في الآبار المناسبة كما هو مبين في الشكل 1. تنفيذ هذا ببطء وبعناية. سوف PBS تشانجنرال الكتريك القوة الأيونية من الطحالب و / أو زملاء مستنبت إذا كان يرش في الآبار الأخرى بحيث يعالج بعناية.
  2. ماصة 1 مل من ثقافة السيطرة البكتيرية في الآبار وصفت السيطرة البكتيرية (الشكل 1). دوامة القارورة البكتيرية قبل pipetting لكل لوحة لتجنب تسوية البكتيرية.
  3. ماصة 1 مل من ثقافة السيطرة الطحالب في الآبار وصفت السيطرة الطحالب باستخدام واسع طرف الفم ماصة (الشكل 1). دوامة القارورة الطحالب بشكل منتظم كما القارورة البكتيرية. إذا كان طحلب يميل إلى تغرق أو تطفو، دوامة بشكل منتظم كما هو مطلوب للحفاظ على ثقافة موحدة بصريا.
  4. باستخدام واسع طرف الفم ماصة، ماصة 1 مل من شارك في الثقافة في الآبار المناسبة (الشكل 1). يحوم القارورة شارك في الثقافة بشكل منتظم كما القارورة الطحالب.
  5. ختم كل لوحة مع parafilm ومكان في حاضنة نهاري في درجة الحرارة المطلوبة ودورة ضوء نهاري (18 ° C مع 16: ضوء 8 ساعة: يستخدم دورة الظلام شيوعا). تركلوحات في الحاضنة نهاري حتى على استعداد لاتخاذ PAM القراءات (القسم 8). موجهة ضمان جميع لوحات في نفس الاتجاه للسماح التعرض للضوء ثابت.
  6. اتخاذ قسامة 20 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني، وسائل الإعلام الطحالب، والأوراق المالية الطحالب والسيطرة الطحالب وإسقاط لوحة على وسيلة غير انتقائي المناسب (على سبيل المثال، البحرية مرق 2216 تستكمل مع 1.5٪ أجار)، واحتضان لوحات في 18 - 25 درجة مئوية لمدة 72 ساعة لاختبار التلوث. إذا ظهر النمو في أي من الحلول التي يجب أن لا يحتوي على بكتيريا، ثم لا ينبغي أن تستخدم هذه البيانات.
  7. أخذ قراءات PAM التألق باستخدام عينة المتبقية من السيطرة وشارك في ثقافة القوارير الطحالب لالتجريبية 0 د PAM التألق القراءة (راجع الخطوة 8.1). وينبغي أيضا أن يؤديها أي غيرها من القياسات 0 د مع سيطرة الطحالب المتبقية، والسيطرة البكتيرية وعينات شارك في الثقافة.

8. أخذ قراءات PAM التألق من العينات المالية

  1. صفر WATER-PAMمع وسائل الإعلام الطحالب العقيمة في كفيت نظيفة قبل اتخاذ القراءات 8.
  2. ماصة 300 ميكرولتر من السيطرة أو شارك في ثقافة القوارير الطحالب في كفيت نظيفة تحتوي على 2.7 مل من نفس المتوسطة الطحالب المستخدمة في التجربة. خلط العينة ومخفف بلطف مع طرف واسعة الفم ماصة.
  3. مسح لمرة وجميع بصمات الأصابع من خارج كفيت بمنديل قبل وضع كفيت في WATER-PAM.
  4. ضع كفيت في WATER-PAM. تغطية العينة مع غطاء والسماح لها إلى dark-التكيف لمدة 3 دقائق. مرة التكيف مع الظلام تختلف تبعا لنوع من الطحالب ويجب أن تحدد للطحلب المحددة المستخدمة في التجربة. تجنب مطولة مرات التكيف مع الظلام (> 20 دقيقة) عن طريق أخذ القراءات WATER-PAM خلال منتصف الدورة المظلمة من حاضنات نهاري الطحالب 16،17.
  5. بعد التكيف الظلام، وأصيب F 0 زر واحدة. إذا قراءات مضان هي فوق 3،900، تمييع عينة 1: 1 في المتوسط ​​الطحالب. الظلام-التكيف لمدة 3 دقائق وتاك إضافيةعصام قراءة جديدة. إذا كان F 0 أو F قراءات م لا تزال أعلى من 3،900، والاستمرار في تمييع عينة 1: 1 في المتوسط ​​الطحالب حتى F 0 و F قراءات م هي أقل من 3،900.
    ملاحظة: تأكد لحساب هذه التخفيفات عند تسجيل مضان النهائي: على سبيل المثال إذا تم المخفف عينة الطحالب 1: 9 خلال فترة الانتقالات الأولي من البئر إلى أنبوب التخفيف، ثم يجب أن تتضاعف القراءة الطحالب مضان من 500 من قبل معكوس عامل تخفيف (في هذه الحالة 10) ومضان الفعلي للأنبوب هو ثم 5،000.
  6. بعد وضع F 0، واتخاذ نبض تشبع (SAT-نبض) قراءة كل 90 ثانية عن طريق ضرب زر SAT لاتخاذ F قراءات م. الفاصل الزمني بين القراءات ويمكن تعديل اعتمادا على سلالة الطحالب. عينة تجاهل.
  7. كرر الخطوات من 8،1-8،6 لعينات المتبقية.

9. أخذ قراءات PAM التألق من لوحات عيار مكروي

  1. ملصق6 أنابيب العينات المعقمة لل> 3 حجم مل للآبار B2 - 4 من أجل السيطرة والآبار وC2 الطحالب - 4 لصالح البكتيرية شارك في ثقافة (انظر تخطيط لوحة في الشكل 1).
  2. قسامة 2.7 مل من معقم المتوسطة الطحالب في كل أنبوب.
  3. وضع الأنابيب في حاضنة نهاري والسماح لهم يتأقلم مع درجة الحرارة كانت تزرع الطحالب في مدة 30 دقيقة.
  4. قبل إزالة لوحة microtiter من الحاضنة ضمان اختراق الضوء إلى الظلام تأقلم الآبار محدودة من خلال تغطية لوحة بورق الألمنيوم (أو ما شابه)، فقط إزالة احباط أثناء نقل بنشاط الثقافة من الآبار للأنابيب التخفيف (الخطوات 9.5 - 9.7).
  5. جو معقم و مطهر مزيج لوحة microtiter الأولى بشكل جيد (وأيضا B2) مع واسعة الفم ماصة غيض من قبل pipetting ببطء صعودا وهبوطا.
  6. الحصول على أنابيب التخفيف من الحاضنة وجو معقم و مطهر نقل 300 ميكرولتر من B2 جيدا (الشكل 1) إلى المقابلة أنبوب عينة مع طرف ماصة الفم واسعة (هذا هو 1: 9 التخفيف من العينة في وسط الطحالب).
  7. كرر الخطوات من 9،5-9،6 لآبار المتبقية (B3،4 وC2 - 4).
  8. تغطية أنابيب العينات مع رقائق الألومنيوم وإعادتها إلى حاضنة نهاري لتصبح جاهزة للWATER-PAM.
  9. أداء قراءات WATER-PAM كما هو موضح في الخطوات 8،1-8،7. ختم لوحة microtiter مع parafilm قبل إعادته إلى الحاضنة.
  10. كرر قراءات في فترات زمنية المخططة للفترة التجربة. وينبغي التخطيط تردد وطول أخذ العينات في بداية التجربة.

10. عينة التجربة

التجربة العينة هي 10 يوم شارك في ثقافة من نوع من البكتيريا (Phaeobacter gallaeciensis BS107) وmicroalga (سلالة Emiliania huxleyi (CCMP3266)). ويشمل عنصر تحكم الطحالب، والسيطرة البكتيرية، والبكتيريا، الطحالب التجريبية شارك في الثقافة.

  1. حساب كميات الأسهم البكتيرية والطحالب المطلوبة (الخطوات 1.1-1،4)
    figure-protocol-18152
  2. إعداد الأسهم الطحالب، وV ألف من 40 مل، من خلال تطعيم 4 مل من الطحالب في 36 مل المتوسطة وحضنت حتى يتحقق النمو المبكر الأسي مع كثافة خلية من ~ 10 4 خلية / مل (الخطوات 2،1-2،4).
  3. إعداد الأسهم قارورة البكتيرية عن طريق تمييع 400 ميكرولتر من 10 6 وت م / مل البكتيريا التي تم الحصول عليها في القسم 3 إلى V B من 40 مل مع وسائل الإعلام الطحالب (تركيز النهائي من البكتيريا سوف يكون 10 4 وت م / مل).
  4. نقل نصف (20 مل) من الأسهم البكتيرية للسيطرة على القارورة البكتيرية وإضافة 20 مل من وسائل الإعلام الطحالب لجعل عنصر التحكم البكتيرية. نقل نصف (20 مل) من الأسهم الطحالب لسيطرة قارورة الطحالب وإضافة 20 مل من وسائل الإعلام الطحالب لتعويض السيطرة الطحالب (القسم 5). نقل 20 مل المتبقية من الأسهم البكتيرية إلى قارورة شارك في ثقافة وتخلط مع 20 مل المتبقية من الأسهم الطحالب لتأسيس الثقافة المشتركة (القسم6).
  5. ماصة 1X PBS (درجة الحموضة 7.4)، والضوابط، وشارك في الثقافة في اثنين من لوحات وصفت ما قبل عيار مكروي (الشكل 1)، 1 مل لكل بئر. استخدام 3 مل من الضوابط المتبقية وشارك في الثقافات لجعل قياسات 0 د (التهم كفو، WATER-PAM (القسم 8)، والمراقبة المجهرية من مورفولوجيا الخلايا الطحالب، وتثبيت خلية الطحالب لالتدفق الخلوي).
  6. أخذ قراءات WATER-PAM لمراقبة الطحالب وشارك في ثقافة واحدة في اليوم لمدة 10 د، ودائما في نفس الوقت الذي تم نقل 0 د القياسات (القسم 8).

11. معلمات الأخرى ذات الاهتمام

  1. تحديد تركيز البكتيريا كفو: إجراء تخفيف التسلسلي للسيطرة البكتيرية وشارك في ثقافة في 1X العقيمة PBS (أو ما شابه ذلك)، ثم إسقاط لوحة على البحرية مرق 2216 تستكمل مع 1.5٪ أجار (أو ما شابه) ومراقبة عدد من وت التي تنمو لتحديد البكتيريا كفو / مل لكل بئر 18.
  2. لتقييم تركيز خلية الطحالب: إصلاح تحكم الطحالب والمشاركالثقافة مع تركيز النهائي 0.15٪ من غلوتارالدهيد. احتضان لمدة 10 دقيقة في الظلام، ثم تجميد فلاش في النيتروجين السائل، وتخزينها في -80 ° C. عملية جميع العينات على تدفق عداد الكريات (FACS بنات كوول أو ما شابه) لحساب خلايا الطحالب.
  3. مراقبة الطحالب مورفولوجيا الخلايا: الثقافات الطحالب والبكتيريا، الطحالب شارك في الثقافة باستخدام المجهر (أي المجهر الضوئي، epifluorescence، أو ما شابه ذلك).

النتائج

قراءات قياس التألق WATER-PAM.

WATER-نبض السعة التضمين (PAM) التألق هو طريقة سريعة وفعالة لتحديد مضان (وكيل للمحتوى الكلوروفيل) والعائد الضوئي (الصحة PSII) من الثقافات الطحالب. البرنامج PAM WinControl يولد جدول لقيم البيانات الخام ل(فيما يلي المعايير...

Discussion

نمو الطحالب في شكل المنمنمة.

التصغير من الثقافات الطحالب إلى وحدة تخزين الثقافة 1 مل في وحة microtiter يسمح لتكرار ضمن تجربة لتكون زيادة. من المهم لضمان طحلب هو صحي طوال تجربة. إجراء منحنى النمو (الشكل 2)، وذلك باستخدام صيغة وحة mi...

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (grant 402105), Canadian Foundation for Innovation (grant 129087) and Alberta Education and Training (grant AAETRCP-12-026-SEG) to RJC.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
10 cu. ft. Diurnal incubator (6012-1)Caron Corporate112310-6012-1-11www.caronproducts.com
Nunc EasYFlask 25 cm2, Vent/Close Cap, 7 ml working volume, 200/csThermo Fisher ScientificN156340www.fishersci.ca
Multiwell TC Plates – 48-wellBD Biosciences Discovery Labware353078www.bdbiosciences.com
P1000 Gilson The Pipetting Standard—Gilson's PipetmanMandel Scientific Company Inc.GF-F123602www.mandel.ca
P10mL Gilson The Pipetting Standard—Gilson's PipetmanMandel Scientific Company Inc.GF-F161201www.mandel.ca
Wide Orifice Tips nonsterile [100–1,250 µl]VWR International89079-468www.ca.vwr.com
Ultrafine Tips nonsterile [100–1,250 µl]VWR International89079-470www.ca.vwr.com
Finntip 10 ml [Vol: 1 - 10 ml]Thermo Fisher Scientific9402151www.fishersci.ca
WATER-Pulse Amplitude Modulation (Water-ED)Heinz Walz GmbH, Effeltrich, GermanyEDEE0232www.walz.com
15 mm diameter quartz glass cuvette (WATER-K)Caron Corporatewww.caronproducts.com
Sodium chloride (crystalline/certified ACS), Fisher ChemicalThermo Fisher ScientificThermo Fisher Scientificwww.fishersci.ca
BD Difco Marine Broth 2216BD Biosciences Discovery LabwareBD Biosciences Discovery Labwarewww.bdbiosciences.com
BD Bacto AgarBD Biosciences Discovery LabwareBD Biosciences Discovery Labwarewww.bdbiosciences.com
L1 Medium Kit, 50 LNCMA [National Center for Marine Algae and MicrobiotaNCMA [National Center for Marine Algae and Microbiotawww.ncma.bigelow.org

References

  1. Scarratt, M. G., Marchetti, A. Assessing microbial responses to iron enrichment in the Subarctic Northeast Pacific: Do microcosms reproduce the in situ condition?. Deep Sea Res Part II Top. Stud. Oceanogr. 53 (20-22), 2182-2200 (2006).
  2. Bidle, K. D., Haramaty, L., Barcelos E Ramos, J., Falkowski, P. Viral activation and recruitment of metacaspases in the unicellular coccolithophore, Emiliania huxleyi. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104 (14), 6049-6054 (2007).
  3. Moore, L. R., Goericke, R., Chisholm, S. W. Comparative physiology of Synechococcus and Prochlorococcus: influence of light and temperature on growth, pigments, fluorescence and absorptive. Mar. Ecol. Prog. Ser. 116, (1995).
  4. Iglesias-Rodriguez, M. D., Halloran, P. R. Phytoplankton calcification in a high-CO2 world. Science. 320 (5874), 336-340 (2008).
  5. Chen, M., Tang, H., Ma, H., Holland, T. C., Ng, K. Y. S., Salley, S. O. Effect of nutrients on growth and lipid accumulation in the green algae Dunaliella tertiolecta. Bioresour. Technol. 102 (2), 1649-1655 (2011).
  6. Lv, J. -. M., Cheng, L. -. H., Xu, X. -. H., Zhang, L., Chen, H. -. L. Enhanced lipid production of Chlorella vulgaris by adjustment of cultivation conditions. Bioresour. Technol. 101 (17), 6797-6804 (2010).
  7. Geider, R., Graziano, L., McKay, R. M. Responses of the photosynthetic apparatus of Dunaliella tertiolecta (Chlorophyceae) to nitrogen and phosphorus limitation. Eur. J. Phycol. 33 (4), 315-332 (1998).
  8. MacIntyre, H. L., Cullen, J. J. Using Cultures to Investigate the Physiological Ecology of Microalgae. Algal Cult. Tech. , 287-326 (2005).
  9. Blaise, C., Vasseur, P. Algal microplate toxicity test. Small-scale Freshw. Toxic. Investig. Vol. 1 Toxic. Test Methods. , 137-179 (2005).
  10. Skjelbred, B., Edvardsen, B., Andersen, T. A high-throughput method for measuring growth and loss rates in microalgal cultures. J. Appl. Phycol. 24, 1589-1599 (2012).
  11. Nagai, T., Taya, K., Annoh, H., Ishihara, S. Application of a fluorometric microplate algal toxicity assay for riverine periphytic algal species. Ecotoxicol. Environ. Saf. 94, 37-44 (2013).
  12. Seyedsayamdost, M. R., Case, R. J., Kolter, R., Clardy, J. The Jekyll-and-Hyde chemistry of Phaeobacter gallaeciensis. Nat. Chem. 3 (4), 331-335 (2011).
  13. Schreiber, U., Schliwa, U., Bilger, W. Continuous recording of photochemical and non-photochemical chlorophyll fluorescence quenching with a new type of modulation fluorometer. Photosynth. Res. 10 (1-2), 51-62 (1986).
  14. Jones, R. J., Ward, S., Amri, A. Y., Hoegh-Guldber, O. Changes in quantum efficiency of photosystem II of symbiotic dinoflagellates of corals after heat stress, and of bleached corals sampled after the 1998 Great Barrier Reef mass bleaching event. Mar. Freshw. Res. 51 (345), 659-668 (1998).
  15. Beer, S., Larsson, C., Poryan, O., Axelsson, L. Photosynthetic rates of Ulva (Chlorophyta) measured by pulse amplitude modulated fluorometry. Eur. J. Phycol. 35 (1), 69-74 (2000).
  16. . . WATER-PAM Chlorophyll Fluorometer. Instrument Description and Information for Users. , (2013).
  17. Maxwell, K., Johnson, G. M., Heers, J. Chlorophyll fluorescence--a practical guide. J. Exp. Bot. 51 (345), 659-668 (2000).
  18. Herigstad, B., Hamilton, M., Heersink, J. How to optimize the drop plate method for enumerating bacteria. J. Microbiol. Methods. 44 (2), 121-129 (2001).
  19. Kooten, O., Snel, J. The use of chlorophyll fluorescence nomenclature in plant stress physiology. Photosynth. Res. 25 (3), 147-150 (1990).
  20. Maxwell, K., Johnson, G. N. Chlorophyll fluorescence--a practical guide. J. Exp. Bot. 51 (345), 659-668 (2000).
  21. Schreiber, U. Pulse-Amplitude-Modulation (PAM) Fluorometry and Saturation Pulse Method: An Overview. Chlorophyll a Fluoresc. A Signat. Photosynth. , 279-319 (2004).
  22. Roháček, K., Barták, M. Technique of the modulated chlorophyll fluorescence: basic concepts, useful parameters, and some applications. Photosynthetica. 37 (3), 339-363 (1999).
  23. Da Silva, J. M., da Silva, A. B., Pádua, M. Modulated chlorophyll a fluorescence: a tool for teaching photosynthesis. J. Biol. Educ. 41 (4), 178-183 (2007).
  24. Vieira, S., Ribeiro, L., Jesus, B., Cartaxana, P., da Silva, J. M. Photosynthesis assessment in microphytobenthos using conventional and imaging pulse amplitude modulation fluorometry. Photochem. Photobiol. 89 (1), 97-102 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

97 WATER PAM

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved