الإنسان دوبوترين<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; الثقافة لدراسة Myofibroblasts وخارج الخلية مصفوفة التفاعلات

Summary

مرض دوبوترين (DD) هو مرض fibroproliferative من كف اليد. هنا، نقدم بروتوكول لعينات ثقافة الاستئصال الجزئي من DD في ثلاثي الأبعاد (3D) نظام الثقافة. مثل هذا النظام الثقافة على المدى القصير يسمح الحفاظ على هيكل 3D والخصائص الجزيئية للأنسجة متليفة.

Abstract

Organ fibrosis or “scarring” is known to account for a high death toll due to the extensive amount of disorders and organs affected (from cirrhosis to cardiovascular diseases). There is no effective treatment and the in vitro tools available do not mimic the in vivo situation rendering the progress of the out of control wound healing process still enigmatic.

To date, 2D and 3D cultures of fibroblasts derived from DD patients are the main experimental models available. Primary cell cultures have many limitations; the fibroblasts derived from DD are altered by the culture conditions, lack cellular context and interactions, which are crucial for the development of fibrosis and weakly represent the derived tissue. Real-time PCR analysis of fibroblasts derived from control and DD samples show that little difference is detectable. 3D cultures of fibroblasts include addition of extracellular matrix that alters the native conditions of these cells.

As a way to characterize the fibrotic, proliferative properties of these resection specimens we have developed a 3D culture system, using intact human resections of the nodule part of the cord. The system is based on transwell plates with an attached nitrocellulose membrane that allows contact of the tissue with the medium but not with the plastic, thus, preventing the alteration of the tissue. No collagen gel or other extracellular matrix protein substrate is required. The tissue resection specimens maintain their viability and proliferative properties for 7 days. This is the first “organ” culture system that allows human resection specimens from DD patients to be grown ex vivo and functionally tested, recapitulating the in vivo situation.

Introduction

مرض دوبوترين (DD)، وهو مرض يسبب انثناء fibroproliferative حميدة دائمة العضوية في الأصابع بسبب تشكيل عقيدات والحبال في كف اليد. على الرغم من أن انتشار المرض مرتفع بشكل خاص بين القوقازيين من شمال أوروبا، والمسببات الوراثية الكامنة وراء هذا المرض ما زال مجهولا ^1. السمة الرئيسية للDD هو إنتاج فائض من المصفوفة خارج الخلية (ECM) البروتينات (مثل الكولاجين)، والتي تشكل النسيج الليفي الصعبة التي تحتل مساحة بين الأوتار والجلد من كف اليد والأصابع، وتعطيل حركات غرامة بشكل دائم من جهة ^{2، 3،} وتكرار المرض تشير التعديلات الوراثية الكامنة كسبب للتليف ^{1، 4.} علاج فعال يمكن أن يكون لاستهداف مباشرة الآليات تليفي لا يمكن السيطرة عليها على المستوى الخلوي والجزيئي.

وقد أدى عملنا مؤخرا على التليف بنا إلى تطويررواية نظام الثقافة 3D التي تسمح الثقافة على المدى القصير من أنسجة متليفة الإنسان مع إمكانية اختبار المخدرات. وقد ساعد هذا النظام على التغلب على نهج الحد من الثقافات الليفية 2D و تحديد دور لتنظيم أسفل جزئي، من خلال اكسون تخطي يتحقق، تفعيل مسار TGFβ في التوسط التليف ^5.

لقد قمنا بتطوير طريقة لثقافة فيفو السابقين العينات استئصال الإنسان من المرضى DD لدراسة التفاعل بين myofibroblasts وECM المحيطة ^{5 و 6.} وتعتمد دراسة DD تليف الأنسجة الضامة وكذلك الأمراض تليفي أخرى على تحليل الأنسجة من رفعه الجراحية العينات وعزل الخلايا الليفية من الأنسجة وإنشاء الثقافات الأولية أو إجراءات خلية الفرز. هذه المناهج هي ثابتة تماما لأنها لا تسمح التلاعب خارجي من خصائص مرض أو التدخل العلاجي من قبل المجرب. وبالإضافة إلى ذلك، CE الأساسيالثقافات ليرة لبنانية تميل إلى التكيف مع الظروف الثقافة والجينات خصائص التعبير عنها تختلف أساسا عن الوضع في الجسم الحي على كل مرور، حتى خلال الممرات الأولى (من بين مرور 3 و 6) ^{7، 8.} لقد نجحنا في الحفاظ على المواد الجراحية النفايات في السابق الظروف الثقافة الجسم الحي لفترة زمنية تسمح دراسة خصائص المريض محددة وفحص المركبات عقار مضاد للمتليفة أو المضادة للالتهابات.

ويستند هذا النظام على غشاء النيتروسليلوز الذي يسمح اتصال من النسيج مع المتوسط ​​ولكن ليس مع البلاستيك، وبالتالي، ومنع تغيير النسيج على المرفق، كما لوحظ سابقا عند زراعة الخلايا الليفية DD وكذلك أنواع الخلايا الأخرى ^9. لا يلزم جل الكولاجين أو غيرها من ECM البروتين الركيزة، منذ الأنسجة DD نفسها تنتج كميات كبيرة من هذه البروتينات. هذا هو مفيد لصيانة المكروية ECM الأم ودوران الخطيئةركائز م المصفوفة هي المنظم المهم العمارة الأنسجة وظيفة ^{10 و 11} على سبيل المثال، والبروتينات ECM مثل فبرونيكتين، laminin والكولاجين، قد تؤثر قطبية الأمامي الخلفي من الخلايا الليفية كما هو موضح بالمثل لقطبية قمية-القاعدية في الخلايا الظهارية ^{12، 13} . خلايا الاستقطاب لها توزيع غير متوازن من جزيئات الخلية والذي يحدد الهجرة الخلية والتعبير الجيني، على سبيل المثال، α1β1 الوصول إنتغرين على الغشاء يؤثر التصاق الخلية إلى النوع الأول من الكولاجين ^14. منذ كان الهدف الأساسي من هذا النموذج 3D للحفاظ على المكروية الأم، تم استخدام أي مصطنعة ECM مصفوفة الركيزة.

في سطور: يتم قطع العينات بتر قدم المساواة في بيئة معقمة ووضعها على الأغشية nitrocellular. إذا كان مطلوبا العلاج تدار عن طريق الحقن يتم حقن الأنسجة بعد أن يكونوا قد وضعت على الغشاء. إذا لا تتطلب العلاج إلى أن تدار عن طريق حقنةection ثم يضاف المركب إلى وسائل الإعلام الثقافة (Dulbecco لتعديل متوسطة النسر (DMEM)، مع 1٪ مصل العجل الجنين (FCS)، 1٪ البنسلين، الستربتومايسين (P / S)). يتم الحفاظ على الثقافات لمدة أقصاها عشرة أيام وبعد ذلك يتم إصلاح الأنسجة في 4٪ بارافورمالدهيد (PFA)، معالجتها من خلال 30٪ من محلول السكروز، جزءا لا يتجزأ في أكتوبر مركب وتخزينها في -80 ° C، كما هو موضح سابقا ^5.

Protocol

هذا البروتوكول يتبع LUMC وAMC المبادئ التوجيهية من الإنسان لجنة أخلاقيات البحث.

1. إجراء العمليات الجراحية والأنسجة مجموعة

ملاحظة: على الرغم من أن تقنيات مختلفة لالاستئصال الجراحي للانكماش دوبوترين موجودة، معيار الذهب الحالي هو استئصال اللفافة الجزئي ^15. يتم التعامل مع معظم المرضى في عيادة جراحة اليوم الواحد.

1. إجراء عمليات جراحية تحت التخدير العام أو الإقليمي وفقا لتفضيلات المريض والتخدير وإلى التعاون مرضية المريض. هذه الاعتبارات هي خارج نطاق هذه الورقة. قبل شق، لمس الجلد بآلة حادة للتحقق من التخدير هو مرض. استخدام عاصبة لتسهيل التصور الجراحي في حقل غير دموي.
2. بعد الإستعداد معقمة واللف، علامة من أصل شق المتوقع بالقلم. شق الجلد مع مشرط تحت العدسة التكبير إما طوليا سص باستخدام شقوق متعرجة لمنع التقلصات إضافية وأيضا لإتاحة فرص كافية للظهور.
3. باستخدام مقص تشريح، حرر الجلد وطبقة تحت الجلد من وراء الراحي فآسيا المتعاقد عليها. تحديد وحماية حزمة وعائية عصبية من الاصبع لأن الحبل المريضة يمكن أن تحل في اتجاه خط الوسط. وبمجرد أن الأنسجة تليفي (العقيدات و / أو الحبل) ويرد، استئصال عليه بحدة وإقليميا (المجموع الفرعي) باستخدام مشرط. أداء الإرقاء الدقيق تحت السيطرة وقف النزف في نهاية الإجراء لمنع تشكيل الورم الدموي.
4. لإغلاق الجلد، واستخدام Z-plasties إضافية للحصول على إطالة جزئية من الجلد.
5. لاستخدام هذه الدراسات إلا الجزء العقيدات من الحبل متليفة، والجزء الأكثر نشاطا والخلوية من المرض. هل لديك الجراح أداء تحديد العيانية. العقيدات المعزولة في كف اليد وغالبا ما تكون السلائف أو الحبل ولكنها مقطوعة بالكاد أي وقت مضى، لأنها عادة لا يسبب الأعراض.كانت تلك التي كنا مقطوعة العقيدات التي كانت جزءا من سلك من الاصبع المتعاقد عليها. تحديد هذه العقيدات من قبل جزء سميك من الصعب من الحبال في handpalm (الشكل 1A).
6. مرة واحدة الجراح بإزالة الأنسجة، ونقل على الفور باستخدام ملقط معقم لأنبوب 50 مل تحتوي على DMEM المتوسطة تستكمل مع 10٪ FCS و1٪ (P / S). الحفاظ على الأنسجة لمدة أقصاها 2 ساعة في هذه الوسيلة على مربع من الجليد الرطب (4 ° C) (على سبيل المثال، نقل أنسجة من غرفة العمليات إلى مرفق ثقافة الخلية).
7. الحفاظ على عينات على الجليد الرطب (4 ° C) في حين تستعد للخطوة التالية. إعداد المواد وزراعة الخلايا الغرفة يتطلب 10-20 دقيقة.

2. إعداد الآلات، ثقافة متوسطة والثقافة إدراجات

ملاحظة: يتم تنفيذ كافة الإجراءات في RT ما لم يذكر على وجه التحديد.

1. إعداد 500 مل من DMEM تستكمل مع 10٪ FCS و1٪ (P / S) ومرشح الصورةterilize. Prewarm المتوسط ​​عند 37 درجة مئوية.
2. ملقط الأوتوكلاف، وزوج من مقص مايو المنحنية ريش (150-170 ملم في الطول) وزوج من مقص Metzenbaum وتخزينها في حاوية معقمة.
3. تحت تدفق الصفحي، فتح المعقمة لوحة الثقافة 12 أيضا. مكان واحد إدراج الثقافة (0.45 ميكرون حجم المسام، 12 مم) في كل بئر من لوحة 12-جيدا (1B الشكل، اللوحة السفلى).
4. ملء لوحة 12-جيدا مع 600 ميكرولتر من prewarmed (37 درجة مئوية) وسائل الإعلام الثقافة من قبل pipetting على البئر وليس مباشرة على غشاء إدراج. وضع لوحة في حاضنة (37 ° C، 5٪ CO ₂₎ (1B الشكل، لوحة العليا).
   1. بدلا من ذلك، استخدم 24 لوحة جيدا وإضافة 300 ميكرولتر من المتوسطة لكل بئر. حجم المتوسطة لكل بئر هو الأمثل عندما يتم تشكيل طبقة الغضروف المفصلي بين السائل والجزء السفلي من إدراج الغشاء.
      ملاحظة: المتوسط ​​في أسفل البئر ينشر من خلال membr النيتروسليلوزانو تشكيل طبقة الغضروف المفصلي كما هو مبين في مخططات الشكل 1B (اللوحة السفلى).

3. الأنسجة الإعداد إعداد وفيفو السابقين نسيج الثقافة

ملاحظة: يتم تنفيذ كافة الإجراءات في RT ما لم يذكر على وجه التحديد.

1. نقل جزء العقيدات من الحبل من أنبوب 50 مل على طبق بيتري 100 ملم وإضافة 10 مل من prewarmed (37 درجة مئوية) متوسطة. تأكد من أن الأنسجة على اتصال مع السائل خلال الإجراء بأكمله.
   1. إزالة طبقة الدهون perinodular باستخدام مقص Metzenbaum. تجاهل الأنسجة الدهنية. مع استخدام ملقط ومقص منحني ريش، وقطع الأنسجة عرضيا إلى قطع أصغر (سمك الحد الأقصى من 200 ميكرون).
2. نقل لوحة 12-جيدا من الحاضنة في غطاء محرك السيارة الصفحي. تأكد من أن غشاء من إدراج تحولت شفافة (الرطب)، وبالتالي هو في اتصال مع وسيط.
3. باستخدام ملقطرفع بعناية جزء الأنسجة عن طريق لمس الطبقة الخارجية (لا تنطبق التوتر على الأنسجة). وضع جزء الأنسجة واحد على الغشاء من إدراج الثقافة الخلية بحيث تبقى الأنسجة في الطور البيني الهواء المتوسط. ثقافة بحد أقصى من جزئين الأنسجة على نفس إدراج / جيد.
4. تأكد من أن الأنسجة يتم وضع مسطح على الغشاء، في اتصال مع الطولي المتوسط ​​مثل أن الأنسجة لا يطفو قبالة غشاء ولا يتم تغطيتها بالكامل من قبل متوسطة. تجنب فقاعات الهواء.
   ملاحظة: في هذه المرحلة، فمن الممكن إضافة عوامل النمو أو مثبطات التي تهم وسائل الإعلام. على سبيل المثال، والمركبات اختبار (A، B، C، D، E) في مكررات و / أو في منحنى التركيز. وتشمل 2 على الأقل التحكم (غير المعالجة) قطعة من الأنسجة تحت ظروف النمو الطبيعي للتأكد من أن تم تعيين التجربة بشكل صحيح. احتضان الأنسجة لمدة 3-7 أيام في حاضنة زراعة الأنسجة.
5. تصيب الأنسجة مع إما بناء lentiviral أو الفيروسة الغدانية إذا overexpression أو هدم البريدxperiments من حاجة الجينات في المصالح التي يتعين القيام بها (الشكل 2). نقل جزء من نسيج لوحة 12-جيدا في طبق 35 مم باستخدام ملقط.
   1. استخدام الحد الأقصى لحجم 10 ميكرولتر من فيروس عيار عالية.
   2. إجراء الحقن تحت المجهر تشريح مع حقنة الأنسولين محملة 50 ميكرولتر PBS تحتوي على 10 ميكرولتر من الفيروس المحدد. وضع الإبرة عمودية على مركز للأنسجة.
   3. حقن ببطء محتوى الحقنة. لا تتراجع الإبرة مباشرة. عندما ثقب الأنسجة، لا تدع الإبرة تذهب من خلال الجانب الآخر ولكن الحفاظ على إبرة داخل الأنسجة نفسها (حول مركز الأنسجة).
   4. نقل الأنسجة مرة أخرى في لوحة 12-جيدا، وإغلاق لوحة الثقافة ووضعه في الحاضنة (37 ° C، 5٪ CO _2).

4. جبل لالجامع المناعي تلطيخ والإعمار 3D

ملاحظة: جميع المواليةيتم تنفيذ cedures في RT ما لم يذكر على وجه التحديد. بروتوكول لكامل المناعية جبل والتصوير هو موضح أدناه هو التكيف من أساليب ذكرت سابقا تستخدم لأنسجة أخرى ^16-19. وصفت مخازن والمواد في الجدول 1 وقائمة المواد.

1. الأنسجة نقل من لوحة الثقافة إلى 2 مل أنابيب microcentrifuge تحتوي على برنامج تلفزيوني. غسل 2X لمدة 5 دقائق في محلول PBS على منصة دوارة. إصلاح الأنسجة في 4٪ مخزنة PFA (1.5 مل من محلول في الأنسجة في 2 مل أنابيب microcentrifuge)، O / N عند 4 درجات مئوية على منصة دوارة.
2. إزالة PFA وتغسل 3X في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق لكل منهما.
3. يذوى الأنسجة عن طريق الغمر في محلول الميثانول بنسبة 25٪ لمدة 2 ساعة على RT على منصة دوارة. زيادة نسبة الميثانول تدريجيا (50٪، 75٪، 100٪) مع الأنسجة مغمورة في كل حل لمدة 2 ساعة في RT على منصة دوارة.
4. الأنسجة نقل في DMSO / حل الميثانول (الخطوة permeabilization) لمدة 3 أسابيع في 4 درجات مئوية،كما هو موضح سابقا ^(18).
   ملاحظة: في هذه المرحلة، والأنسجة ويمكن تخزين على المدى الطويل في الميثانول بنسبة 100٪ في -20 ° C.
5. المضي قدما في تلطيخ الإجراء ^{16، 17؛} ترطيب أنسجة تدريجيا (75٪ -50٪ -25٪ -0٪ سلسلة الميثانول). تنفيذ كل خطوة الإماهة لمدة 2 ساعة على RT أو O / N عند 4 درجات مئوية، في إطار التحريض المستمر.
6. احتضان العينات مع الأجسام المضادة الأولية في برنامج تلفزيوني يحتوي على 1٪ ألبومين المصل البقري (BSA) و 20٪ DMSO O / N عند 4 درجات مئوية. استخدام الأجسام المضادة في النسب التالية باستخدام المخزونات التجارية في برنامج تلفزيوني: مكافحة α الأكتين العضلات الملساء (1: 500، والماوس)، ونوع المضادة للالكولاجين الأول (1: 500، الماعز)، ومكافحة الكولاجين النوع الثالث (1: 500، الماعز).
7. غسل نطاق واسع في برنامج تلفزيوني لمدة 48 ساعة في 4 درجات مئوية (تغيير PBS حل 3 إلى 4 مرات).
8. تمييع الأجسام المضادة الثانوية المناسبة (اليكسا 555 المضادة للماوس، اليكسا 488 المضادة للماعز) في 1: 250 التخفيف في برنامج تلفزيوني يحتوي على 1٪ (BSA) و 20٪ DMSO. احتضان O / N عند 4 درجات مئوية.
9. غسل نطاق واسع في برنامج تلفزيوني لمدة 48 ساعة على 476، C واحتضان مع مباين النووي، TO-PRO-3 المخفف 1: 500 في برنامج تلفزيوني في خطوة الغسيل النهائية.
   ملاحظة: TO-PRO-3 هو بعيدة الحمراء التي تنبعث منها صبغة DNA (مع وني 633 نانومتر خط ليزر) ويتم الجمع بين التصوير في وقت واحد مع القنوات الأخرى؛ في هذا النوع نوع القضية الكولاجين I / الكولاجين الثالث (488 نانومتر)، α الأكتين العضلات الملساء (555 نانومتر)، TO-PRO-3 (647 نانومتر).
10. نقل الأنسجة إلى سلسلة الميثانول (25٪ -50٪ -75٪) ليذوى ببطء الأنسجة. تنفيذ كل خطوة الجفاف لمدة 2 ساعة على RT أو O / N عند 4 ° C في إطار التحريض المستمر.
    1. الأنسجة نقل في أنابيب البولي بروبلين. الأنسجة واضحة في methylsalicylate (مقبض تحت غطاء الكيميائية) ¹⁸ أو بوصفه استخدام بديل BABB حل ^19. في احتضان RT في إطار التحريض المستمر حتى تصبح الأنسجة شفافة. جبل بين شريحة وساترة مختومة مع مجموعة من الصعب متوسطة تركيب (الشكل 1C، لوحة العليا).
11. عينات الصورة على الصغير متحد البؤر مقلوبنطاق مجهزة عالية NA 63X و / أو 100X أهداف الغمر النفط (الشكل 1C).
    1. تنظيف العدسة بمحلول التنظيف المقدمة من قبل الشركة المصنعة المجهر.
    2. تطبيق قطرة واحدة من الزيت على عدسة موضوعية. ضع الشريحة مع العينة على المسرح المجهر والتركيز على العينة.
12. تعيين تكوينات على المجهر للتصوير في وقت واحد من ثلاث قنوات مضان مع خطوط الليزر 488 نانومتر، 514 نانومتر و 633 نانومتر.
13. الحصول على صور XY واحد أو عدة صور تنسيق الطائرة (Z كومة) (الشكل 3A). استخدام زيادة العرض من Z المكدس للحصول على أداء 3D إعادة الإعمار. للحصول على صورة عالية الدقة تستخدم انخفاض سرعة المسح الضوئي، وعدد من متوسط ​​بالاشعة (≥ 3) والحصول على صور 16 بت القرار 1،024 س 1،024 بكسل.
14. تحليل الصور Z كومة المكتسبة: إعادة تسمية أولا وحفظ ملف الصورة (XYZ). باستخدام برنامج حاسوبي من المجهر متحد البؤر، تكوين الحد الأقصى لكثافة PROJEction من الصور Z كومة إلى 3D بناؤها الصورة.
    1. حدد الملف XYZ، في "أدوات عملية"، انقر فوق تحت عنوان "التخيل" و "الإسقاط 3D". دخول "الأقصى" في طريقة العرض (أو "متوسط" إذا تم المشبعة إشارة الفلورسنت). الإسقاط واحد لا يتغير X، Y، Z والطائرات، وتطبيق أداة الإسقاط (الشكل 3B، R1).
15. استخدام الصور Z كومة لإنشاء الإسقاط 3D مع الرسوم المتحركة (برنامج متحد البؤر) لأغراض العرض. حدد الملف XYZ، في أدوات عملية، انقر فوق تحت عنوان "التخيل" و "الإسقاط 3D".
    1. انقر على "إنشاء الفيلم". أدخل زاوية بدء دوران في درجة (على سبيل المثال، 0 ° كنقطة انطلاق للفيلم، محور Y) وانقر على "بدء تعيين". أدخل زاوية دوران النهاية في درجة (المحور Y) كنقطة نهاية الفيلم (على سبيل المثال، 180 درجة أو 3606؛ لدوران الكامل) وانقر على "نهاية تعيين".
    2. حدد "الحد الأقصى" كوسيلة من وسائل الإسقاط (أو "متوسط" إذا تم المشبعة إشارة الفلورسنت). دخول "عدد الإطارات" للدوران إعادة الإعمار 3D (على سبيل المثال، 20 التناوب أو أعلى للحد من سرعة دوران). انقر على "تطبيق". تصدير الفيلم كملف البصرية (على سبيل المثال، "وافي") (فيلم التكميلي 1) أو تصدير بأنها "شجار" ملف الذي يخلق ملف صورة لكل زاوية دوران (الشكل 3B، تناوب R4، R10، R18).

5. المشتركة الجيل الثاني متناسق (الكولاجين) وثنائي الفوتون مضان متحمس (الإيلاستين) التصوير في فيفو السابقين الأنسجة أثناء الثقافة

ملاحظة: يتم تنفيذ كافة الإجراءات في RT ما لم يذكر على وجه التحديد.

1. إزالة لوحات transwell من الحاضنة ومكان واحد (غير المثبتة) منظمة الشفافية الدوليةجزء ssue في 35 ملم لوحة ثقافة الخلية تحتوي على 500 ميكرولتر من المتوسط.
2. ضع الأنسجة بحيث محور طويل مسطح على لوحة. إبقاء الأنسجة الرطب في جميع الأوقات ولكن، لا العائمة.
3. وضع الهدف، مغمورة بالمياه المجهر multiphoton على اتصال مباشر مع الأنسجة (الشكل 1C).
4. الحصول على صور ذات الطول الموجي الإثارة من 800 نانومتر، وجمع الضوء المنبعث بين 371-425 نانومتر (SHG، والكولاجين) و474-532 نانومتر (تألق ذاتي، الإيلاستين) (الشكل 3C). أداء ثنائي الفوتون المجهري في مجهر متحد البؤر تستقيم مجهزة ليزر الفيمتو ثانية باستخدام الهدف الماء الغمر 20X / 1.0 NA. متحد البؤر عملية مداخن مع برنامج الشركة المصنعة.
   ملاحظة: الإثارة مع ليزر الأشعة تحت الحمراء القريب من جزيئات الكولاجين يخلق التصوير التباين العالي هياكل الكولاجين الأم في أعماق مختلفة.

النتائج

طريقة فيفو السابقين، والثقافة 3D من النسيج الضام هو انشاء نظام سهل وقوي لفهم العلاقة بين ECM ومكونات الخلايا الأخرى المكونة للنسيج DD وأنواع أخرى من المحتمل أن التليف كذلك. وعلاوة على ذلك يسمح هذا النظام طريقة موثوقة لاختبار آثار المركبات على أنواع مختلفة من الخلا?...

Discussion

الخطوات الأكثر أهمية من زراعة الأنسجة الضامة الإنسان خارج الحي هي استخدام الفوري من الأنسجة بعد الاستئصال الجراحي لضمان جدوى. ينبغي أن يظل النسيج في محلول ملحي أو متوسطة في جميع الأوقات؛ الحفاظ على الثقافة العقيمة. يجب المقاطع العرضية من الأنسجة يكون الحد الأق?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium	Invitrogen	11965-084
fetal calf serum (FCS)	Gibco		high glucose, heat inactivated
penicillin-streptomycin	Invitrogen	15070-063
Cell culture inserts	Millicell	PIHA01250	0.45 μm pore size, 12 mm diameter
anti-collagen type I	Southern Biotech	1310-08
anti-α smooth muscle actin	Sigma	A2547
anti-collagen type III	Southern Biotech	1330-01
Alexa Fluor555 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)	Invitrogen	A-31570
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody	Invitrogen	A-11055
TOPRO-3	Invitrogen	T3605
methylsalicylate	Sigma	M6752
paraformaldehyde	Sigma	P6148
Tissue Tek OCT	Sakura	25608-930
Microsccope glass coverslips	Menzel-Glaser	BB024060A1	24 x 60 mm
Microscope SuperFrost slides	Menzel-Glaser	AA00000102E	76 x 26 mm
VECTASHIELD HardSet Mounting Medium	Vector laboratories	H-1400
Leica TCS SP5 II confocal microscope	Leica Microsystems		Argon-488, 514 nm and HeNe-633 nm laser lines
Zeiss 710 NLO upright confocal microscope	Jena, Germany		Equipped with femtosecond Spectra - Physics Deep See MP laser (Santa Clara, United States) using a Plan-Apochromat 20X/1.0 NA water-immersion objective.