인간의 Dupuytren의<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 근섬유 아세포의 연구와 세포 외 기질 상호 작용에 대한 문화

요약

Dupuytren의 질병 (DD)는 손바닥의 fibroproliferative 질환이다. 여기서는 3 차원 (3D) 배양 계에서 배양 DD로부터 표본을 절제 프로토콜을 제시한다. 이러한 단기 배양 시스템은 3 차원 구조의 보존과 섬유 성 조직의 분자 특성을 허용한다.

초록

Organ fibrosis or “scarring” is known to account for a high death toll due to the extensive amount of disorders and organs affected (from cirrhosis to cardiovascular diseases). There is no effective treatment and the in vitro tools available do not mimic the in vivo situation rendering the progress of the out of control wound healing process still enigmatic.

To date, 2D and 3D cultures of fibroblasts derived from DD patients are the main experimental models available. Primary cell cultures have many limitations; the fibroblasts derived from DD are altered by the culture conditions, lack cellular context and interactions, which are crucial for the development of fibrosis and weakly represent the derived tissue. Real-time PCR analysis of fibroblasts derived from control and DD samples show that little difference is detectable. 3D cultures of fibroblasts include addition of extracellular matrix that alters the native conditions of these cells.

As a way to characterize the fibrotic, proliferative properties of these resection specimens we have developed a 3D culture system, using intact human resections of the nodule part of the cord. The system is based on transwell plates with an attached nitrocellulose membrane that allows contact of the tissue with the medium but not with the plastic, thus, preventing the alteration of the tissue. No collagen gel or other extracellular matrix protein substrate is required. The tissue resection specimens maintain their viability and proliferative properties for 7 days. This is the first “organ” culture system that allows human resection specimens from DD patients to be grown ex vivo and functionally tested, recapitulating the in vivo situation.

서문

Dupuytren의 질병 (DD)는 양성 fibroproliferative 질병으로 인해 손의 손바닥에 결절 및 코드의 형성에 손가락의 영구 굴곡이 발생합니다. 질병 확산 북유럽 백인 중에서도 특히 높지만 질환의 근본적인 유전 적 원인은 알려지지 않았다 ^하나. DD의 주된 특징은, 힘줄 및 손과 손가락의 손바닥의 피부 사이의 공간을 점유 거친 섬유 조직 형성 세포 외 기질 (ECM) 단백질 (예를 들면, 콜라겐)의 과잉 생산, 영구적 미세한 움직임을 방해 한편 ^{(2)의 세.} 질병의 재발 ^{한 섬유증, (4)의} 기본 원인으로 유전 적 변형을 의미한다. 치료 효과적인 직접 세포 및 분자 수준에서 제어 할 수없는 섬유 성 메커니즘을 타겟팅 할 수 있었다.

섬유증에 우리의 최근 작품은의 발전에 우리를 주도하고있다약물 테스트의 전위와 인간 섬유 성 조직의 단기 배양을 허용 신규 한 3 차원 배양 시스템. 이 시스템은 2D 섬유 아세포 배양 제한하는 접근 방식을 극복하고 섬유증 ^(5)을 매개로 TGFβ 통로 활성화의 엑손 스키핑에 의해 달성되는 부분 아래로 규제의 역할을 정의하는 데 도움이되었습니다.

우리는 DD 환자의 생체 인간의 절제 표본은 근섬유 사이의 상호 작용과 주변 ECM ^{(5), (6)을} 연구하는 문화 방법을 개발했다. DD 결합 조직 섬유화의 연구뿐만 아니라 다른 섬유 성 질환 수술 절제의 조직 병리학 적 분석에 의존 표본, 조직 및 차 문화 또는 셀 정렬 절차의 설립에서 섬유 아 세포의 분리. 그들은 실험에 의한 질병의 특성 또는 치료 개입의 외생 적 조작을 허용하지 않기 때문에 이러한 접근은 매우 정적입니다. 또한, 일차 CELL 문화는 배양 조건에 적응과 유전자 발현 특성도 초기 구절 동안 모든 통로에 본질적으로 생체 내 상황에서 다른 경향 (통로 (3) 사이에 6) ^{7, 8. 우리는에} 폐기물 수술 재료를 유지 관리해야 특정 환자의 특성 연구 및 항 섬유 성 또는 항 염증성 약물 화합물의 스크리닝을 가능 기간에 대한 생체 외 배양 조건.

시스템은 DD 섬유 모세포뿐만 아니라 다른 세포 유형 ^(9)를 배양 할 때 이전에 관찰 된 바와 같이, 장착시에 조직의 변질을 방지하므로, 매질과 아닌 플라스틱과 조직의 접촉을 허용 니트로 셀룰로오스 막에 기초한다. DD 조직 자체가 단백질의 대량 생산 No를 콜라겐 겔 또는 다른 ECM 단백질 기판은 필요하지 않다. 이 기본 ECM 미세 환경 및 회전율 죄의 유지에 유리하다CE 매트릭스 기판은 조직 구조 및 기능 ^{(10), (11)의} 중요한 조절이다. 예를 들어, 피브로넥틴, 라미닌 및 콜라겐과 같은 ECM 단백질, 마찬가지로 상피 세포 ^(12)에 정점 - 기저 극성 도시 섬유 아세포의 전후 ^{극성, (13)에 영향을} 미칠 수있다 . 편광 세포는 세포의 이동 및 유전자 발현, 예를 들어, 막에 α1β1 인테그린 접근성 내가 ¹⁴ 콜라겐 입력 세포 접착에 영향을 미치는 결정 세포 분자의 비대칭 분포를 가지고있다. 이 3D 모델의 주요 목표는 기본 미세을 보존 이었기 때문에, 인공 ECM 매트릭스 기판이 사용되지 않았다.

간단히 : 절제 표본 동등하게 무균 환경에서 절단 및 nitrocellular 세포막에 위치. 주사 투여를 통해 치료가 필요한 경우에 그들이 막 상에 배치 된 후에 조직을 주입된다. 치료는 INJ를 통해 투여 될 필요하지 않은 경우다음의 ection 화합물 (1 % 소 태아 혈청 (FCS), 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 (P / S)와 함께, 둘 베코 변형 이글 배지 (DMEM)) 배양 배지에 첨가한다. 이전 ⁵ 바와 같이 배양, 30 % 수크로오스 용액을 통해 처리 된 티슈는 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)에 고정 된 이후 최대 10 일간,의 OCT 화합물에 매립하고 -80 ℃에서 보관 유지된다.

프로토콜

이 프로토콜은 인간의 연구 윤리위원회의 LUMC 및 AMC 지침을 따른다.

1. 수술 및 조직 컬렉션

참고 : Dupuytren의 구축의 수술 적 절제를위한 다양한 기술이 존재하지만, 현재의 황금 표준이 부분 fasciectomy ^15입니다. 대부분의 환자는 하루 수술 클리닉에서 처리됩니다.

1. 환자 및 마취의 기본 설정에 환자의 동반 질환에 따라 일반 또는 지역 마취하에 수술을 수행합니다. 이러한 고려 사항은이 문서의 범위를 벗어납니다. 이전은 마취가 만족 확인하기 위해 날카로운 물건으로 피부를 터치 절개합니다. 무혈 필드에 수술 시각화를 용이하게하기 위해 지혈대를 사용합니다.
2. 멸균 준비하고 및 입체 재단 한 후, 펜으로 예상 절개를 표시합니다. 어느 길이 방향으로 오 확대경 배율에서 메스로 피부를 절개R 추가 경축을 방지하기 위해 지그재그로 절개를 사용하여도 충분한 노출을 허용 할 수 있습니다.
3. 가위 해부를 사용하여 기본 계약 근막 palmaris에서 피부와 피하 층을 확보. 확인하고 질병 코드가 중앙선쪽으로 대체 할 수 있기 때문에 손가락의 신경 혈관을 보호합니다. 섬유 성 조직 (결절 및 / 또는 코드) 요약하면, 메스를 사용하여 급격히 및 지역 (소계)를 절제. 혈종이 형성되지 않도록 절차의 끝에서 지혈대 제어하에 세심한 지혈을 수행한다.
4. 피부를 닫으려면, 피부의 부분적인 연장을 얻기 위해 추가 Z-plasties를 사용합니다.
5. 이 연구는 섬유 성 코드, 질병의 가장 활성 및 세포 부분 만 결절 부분을 사용하십시오. 외과 의사가 육안 식별을 수행하게한다. 손의 손바닥에 고립 된 결절은 종종 전구체 또는 코드하지만 그들은 일반적으로 증상을 일으키지 않는 한 좀처럼, 절제되어있다.우리가 절제 사람들은 계약 손가락의 코드의 일부 결절이었다. handpalm (그림 1A)에서 코드의 하드 두꺼운 부분 이러한 결절을 확인합니다.
6. 외과 의사가 조직을 제거하면, 즉시 10 % FCS 및 1 % (P / S)이 보충 된 DMEM 배지를 함유하는 50 ㎖ 튜브에 무균 핀셋을 사용하여 전송. 얼음물 (39 °의 C)의 상자에이 배지에서 2 시간의 최대 유지 조직 (예를 들면, 세포 배양 시설에 수술실에서 조직의 수송).
7. 다음 단계에 대한 준비하는 동안 젖은 얼음 (4 ° C에서)에 샘플을 보관하십시오. 재료 및 세포 배양 챔버의 준비는 10 ~ 20 분을 필요로한다.

악기, 문화 매체와 문화 삽입 2. 준비

참고 : 특별히 언급하지 않는 한 모든 절차는 RT에서 수행됩니다.

1. DMEM의 조제 500 ㎖의 10 % FCS 및 1 % (P / S) 및 필터 (S)이 보충terilize. 37 ℃에서 매체 Prewarm.
2. 오토 클레이브 집게, 곡선 엽 메이요 가위 (길이 150~170mm) 및 멸균 용기에 Metzenbaum 가위 한 쌍의 저장.
3. 층류에서 멸균 12 웰 배양 플레이트를 연다. 12 웰 플레이트 (그림 1B, 낮은 패널)의 각 웰에 하나의 문화 삽입 (0.45 μm의 기공 크기, 12mm 직경)을 놓습니다.
4. 삽입물의 막에 직접 600도에 피펫 팅에 의해 데워진 (37 ° C) 문화 미디어 ㎕의하지와 함께 12 웰 플레이트를 입력합니다. 인큐베이터 (37 ° C, 5 % CO ₂₎ (그림 1B, 상단 패널)에 접시를 놓습니다.
   1. 또한, 24 웰 플레이트를 사용하여 매체의 300 μl를 추가 당 잘. 메 니스 커스 층은 액체 및 멤브레인 인서트의 하부 부분 사이에 형성 될 때 웰당 배지의 부피는 최적이다.
      참고 : 우물의 맨 아래에있는 매체가 니트로 셀룰로오스 membr를 통해 확산도 1b (하판)의 구조에서 도시 된 바와 같이 메 니스 커스가 메탄 층을 형성한다.

3. 조직 준비 및 생체 외 조직 배양 설치

참고 : 특별히 언급하지 않는 한 모든 절차는 RT에서 수행됩니다.

1. 100mm 페트리 접시에 50 ML 튜브에서 코드의 결절 부분을 전송하고 데워진 (37 ° C) 10 ml의 배지를 추가합니다. 조직 전체 절차를 수행하는 동안 액체와 접촉에 있는지 확인합니다.
   1. Metzenbaum 가위를 사용하여 perinodular 지방층을 제거합니다. 지방 조직을 폐기하십시오. 집게와 가위 만곡 블레이드를 이용하여, 횡 방향으로 작은 조각으로 조직 (200 ㎛, 최대 두께)을 절단.
2. 층류 후드로 인큐베이터에서 12 웰 플레이트를 전송합니다. 삽입물의 막 (습식) 투명 설정 때문에 매체와 접촉하는 것을 확인합니다.
3. 집게를 사용하여주의 (조직에 긴장을 적용하지 않음) 외부 층을 터치하여 조직 부분을 들어 올립니다. 조직은 공기 매체 계면에서 유지되도록 세포 배양 인서트의 막 상에 하나의 조직 일부를 놓는다. 문화 같은 삽입에 두 조직 부품의 최대 / 웰.
4. 조직이 이러한 조직하는 매체 종 접촉, 막 평면에 배치하지 어느 쪽도 막을 수레도 완전히 매체에 의해 덮여 있는지 확인합니다. 공기 방울을 피하십시오.
   주의 :이 단계는 성장 인자 또는 매체에 대한 관심의 억제제를 추가하는 것이 가능하다; 예를 들어, 반복 실험 및 / 또는 농도 곡선에 시험 화합물 (A, B, C, D, E). 실험이 제대로 설정되었는지 확인하기 위해 정상적인 성장 조건 하에서 조직의 최소 2 제어 (치료) 조각을 포함합니다. 조직 문화 인큐베이터를 3-7 일 동안 조직을 품어.
5. 과발현 경우 렌티 바이러스 나 아데노 바이러스 구조 중 하나와 조직을 감염 또는 전자를 노크유전자의 관심 필요 xperiments (그림 2)를 수행한다. 집게를 사용 35mm 접시에 12- 웰 플레이트로부터의 조직 일부를 전송합니다.
   1. 높은 역가 바이러스의 10 μL의 최대 볼륨을 사용합니다.
   2. PBS 50 μL가 선택된 바이러스의 10 μl를 함유 로케이션 인슐린 주사기와 해부 현미경으로 주사를 수행한다. 조직의 중심에 수직으로 바늘을 놓습니다.
   3. 천천히 주사기의 내용을 주입. 직접 바늘을 철회하지 마십시오. 조직을 천공 할 때, 바늘이 다른 쪽을 통과하지만 (조직의 중앙 부근) 조직 자체 내 바늘을 유지시키지 않는다.
   4. , 12 웰 플레이트에 다시 조직을 전송 문화 판을 닫고 인큐베이터에 배치 (37 ° C, 5 % CO _2).

4. 전체 마운트 면역 형광 염색 및 3D 재건

참고 : 모든 프로특별히 언급하지 않는 한 cedures 실온에서 수행됩니다. 아래에 설명 된 전체 마운트 면역 염색 및 이미징을위한 프로토콜은 다른 조직 ^16-19에 사용 이전에보고 된 방법에서 적응이다. 버퍼 및 재료는 표 1 및 재료 목록에 설명되어 있습니다.

1. PBS를 포함하는 2 ml의 마이크로 원심 튜브에 문화 판에서 전송 조직. 회전 플랫폼에서 PBS 용액에 5 분간 세척 배. 회전 플랫폼에서 4 ° C에서 4 %에 버퍼링 PFA (2 ml의 마이크로 원심 튜브에 조직 당 1.5 ml의 용액), O / N을 조직을 수정합니다.
2. PFA를 제거하고 5 분마다 PBS에서 배를 씻는다.
3. 회전대에 RT에서 2 시간 동안 25 % 메탄올 수용액 침지에 의한 조직 탈수. 회전대에 RT에서 2 시간 동안 각각의 용액에 침지 조직과 점차로 메탄올 백분율 (50 %, 75 %, 100 %)을 길게한다.
4. 4 ° C에서 DMSO 삼주에 대한 / 메탄올 용액 (투과성으로 단계)에 전송 조직,로 이전 ¹⁸ 설명했다.
   주의 :이 단계에서는 조직을 -20 ° C에서 100 % 메탄올 장기간 저장 될 수있다.
5. 절차 ^{(16), (17)} 염색을 진행합니다; 서서히 조직 (75 % -50 % -25 % -0 % 메탄올 시리즈) 재수. 일정한 교반하면서, 4 ° C에서 RT 또는 O / N에서 2 시간 동안 각 수분 보충 단계를 수행합니다.
6. 4 ℃에서 1 % 우 혈청 알부민 (BSA)과 20 % DMSO O / N를 함유하는 PBS에 일차 항체와 샘플을 인큐베이션. 안티 α 평활근 액틴 : PBS의 상업 주식을 사용하여 다음과 같은 비율로 항체를 사용하여, (1 500, 마우스) 항 콜라겐 유형 I (1 : 500, 염소), 유형 III (1 항 콜라겐 : 500, 염소).
7. 4 ° C (변경 PBS 용액 3 ~ 4 회)에서 48 시간 동안 PBS에서 광범위하게 씻으십시오.
8. 1 적절한 보조 항체 (알렉사 555 항 - 마우스, 알렉사 488 안티 - 염소를) 희석 : PBS 1 % (BSA)과 20 % DMSO를 포함 250 희석. 4 ° C에서 O / N을 품어.
9. 4에서 48 시간 동안 PBS에서 광범위하게 세척76, C 및 핵 Counterstain과 함께 배양-PRO-3 1 희석 : 최종 세척 단계에서 PBS에서 500.
   참고 : TO-PRO-3 (그는-네 633 nm의 레이저 라인) 원적외선 방출 DNA 염료이고 다른 채널 동시 이미징 결합; 이 경우, 콜라겐 타입 I / 콜라겐 형 III (488 ㎚), α 평활근 액틴 (555 ㎚)에있어서, TO-PRO-3 (647 ㎚).
10. 메탄올 시리즈 (25 % -50 % -75 %)을 천천히 조직을 탈수로 조직을 전송; 일정한 교반하면서 4 ° C에서 RT 또는 O / N에서 2 시간 동안 각 탈수 단계를 수행합니다.
    1. 폴리 프로필렌 튜브에 전송 조직. 클리어 methylsalicylate의 조직 (화학 후드 핸들) ⁽¹⁸⁾ 또는 대체 사용 BABB 솔루션 ^(19). 조직이 투명하게 될 때까지 일정하게 교반하면서 실온에서 품어. 마운트 슬라이드 및 하드 세트 설치 매체 (그림 1C, 상단 패널)로 밀봉 커버 슬립 사이.
11. 반전 공 초점 마이크로에 이미지 샘플높은 NA 63X 및 / 또는 100X 오일 침지 목표 (그림 1C)가 장착 범위.
    1. 현미경 제조업체에서 제공하는 세제로 렌즈를 청소합니다.
    2. 대물 렌즈에 오일 한 방울을 적용합니다. 시료의 현미경 무대와 초점에 표본과 슬라이드를 놓습니다.
12. 레이저 라인 488 nm의, 514 nm에서 633 nm의 세 채널 형광의 동시 이미징을위한 현미경의 구성을 설정합니다.
13. 하나의 XY 이미지 또는 다중 초점 평면 이미지 (Z 스택) (그림 3A)를 취득. 3D 재구성을 수행하는 Z 스택의 증가 폭을 사용합니다. 고해상도 이미지가 낮은 주사 속도, 평균 스캔 (≥ 3)의 번호를 사용하고, 024 X 1024 픽셀 해상도의 16 비트 이미지를 수집 얻었다.
14. Z 스택 획득 한 이미지를 분석 : 첫 번째 이름을 변경하고 이미지 파일 (XYZ)을 저장합니다. 공 초점 현미경의 소프트웨어 프로그램을 사용하여, 최대 강도를 구성 proje3D로 Z 스택 이미지의 ction의 이미지를 재구성.
    1. "시각화"과 "3D 프로젝션"에 클릭, "프로세스 도구"에서, XYZ 파일을 선택합니다. 돌기 (또는 형광 신호가 포화되는 경우 "보통")의 방법에서 "최대"를 입력한다. 단일 투영이 X, Y 및 Z 평면을 변경하고, 상기 투영 수단 (도 3b, R1)을 위해 적용되지 않는다.
15. 목적을보기 위해 애니메이션 (공 초점 소프트웨어)와 3D 프로젝션을 만들 수 Z 스택 이미지를 사용합니다. XYZ 파일을 선택, 프로세스 도구에서 "시각화"과 "3D 프로젝션"에 클릭합니다.
    1. "영화 만들기"를 클릭합니다. 도에 시작 회전 각도를 입력 (예를 들어, 영화, Y 축의 시작점으로 0 °) 및 "설정 시작"을 클릭합니다. 최종 영화의 점 (예를 들어, 180도 또는 360도까지의 최종 회전 각도 (Y 축)를 입력6; 과) 완전한 회전 "을 설정 끝"을 클릭합니다.
    2. 투사 (또는 형광 신호가 포화되는 경우 "평균")의 방법으로 "최대"를 선택합니다. 3D 재구성의 회전을 위해 "프레임 번호"를 입력 (예를 들어, 20은 회전 이상의 회전 속도를 감소시키기 위해). "적용"을 클릭합니다. 동영상을 보내 시각적 파일로 (예를 들어, "아비") 각각의 회전 각도에 대한 이미지 파일 생성 "티파니"파일로 (보충 영화 1), 수출 (그림 3B, 회전 R4, R10, R18)을.

5. 결합 된 두 번째 고조파 세대 (콜라겐) 및 문화 동안 전 생체 조직에 두 광자 흥분된 형광 (엘라스틴) 영상

참고 : 특별히 언급하지 않는 한 모든 절차는 RT에서 수행됩니다.

1. 인큐베이터에서 트랜스 웰 플레이트를 제거하고 TI (고정되지 않은) 하나를 배치매체의 500 μl를 포함하는 35mm 세포 배양 접시에 ssue 부분.
2. 긴 축이 접시에 평면이되도록 조직을 배치합니다. 그러나 항상 젖은 떠있는 조직을 유지합니다.
3. 직접 조직 (그림 1C)와 접촉 광자 현미경의 물에 침지 목표를 놓습니다.
4. 800 나노 미터의 여기 파장 이미지를 구하여 371-425 nm의 (SHG, 콜라겐)과 474-532 nm의 (자가 형광, 엘라스틴) (그림 3C) 사이에서 방출되는 빛을 수집합니다. 20X / 1.0 NA 물 액침 대물를 사용 펨토초 레이저를 구비 직립 공 초점 현미경의 이광자 현미경을 수행한다. 프로세스 공 초점은 제조업체의 소프트웨어 스택.
   참고 : 콜라겐 분자의 근적외선 레이저로인가 전압이 다른 깊이에서 네이티브 콜라겐 구조의 높은 콘트라스트 이미지를 생성합니다.

결과

생체에있어서, 결합 조직의 3 차원 배양뿐만 아니라 ECM 섬유화 및 DD 조직을 구성하는 다른 세포 성분 및 잠재적으로 다른 유형의 관계를 이해하기 쉽고 견고한 세트 업 시스템이다. 더욱이이 시스템은 신뢰할 수있는 방법은 여러 종류의 세포 및 섬유 성 부하 ^(20)에 미치는 영향에 대한 화합물의 효과를 테스트 할 수있다.

Dupuytren의 섬유증으로부터 유도 수술 폐...

토론

인간 생체 결합 조직 배양에서 가장 중요한 단계는 생존을 보장하기 위해 제거 수술 후의 조직의 즉시 사용이고; 조직은 항상 중간 또는 식염수 용액에 남아 있어야한다; 멸균 문화를 유지; 조직의 횡단면은 최대 200 μm의 두께를 가져야한다; 조직이 매체와 접촉 있지만 완전히 침수하지 않을 경우 체외 배양 시스템의 설정은 최적입니다. 보통은 작은 부피에서 트랜스 웰의 외측 챔버 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium	Invitrogen	11965-084
fetal calf serum (FCS)	Gibco		high glucose, heat inactivated
penicillin-streptomycin	Invitrogen	15070-063
Cell culture inserts	Millicell	PIHA01250	0.45 μm pore size, 12 mm diameter
anti-collagen type I	Southern Biotech	1310-08
anti-α smooth muscle actin	Sigma	A2547
anti-collagen type III	Southern Biotech	1330-01
Alexa Fluor555 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)	Invitrogen	A-31570
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody	Invitrogen	A-11055
TOPRO-3	Invitrogen	T3605
methylsalicylate	Sigma	M6752
paraformaldehyde	Sigma	P6148
Tissue Tek OCT	Sakura	25608-930
Microsccope glass coverslips	Menzel-Glaser	BB024060A1	24 x 60 mm
Microscope SuperFrost slides	Menzel-Glaser	AA00000102E	76 x 26 mm
VECTASHIELD HardSet Mounting Medium	Vector laboratories	H-1400
Leica TCS SP5 II confocal microscope	Leica Microsystems		Argon-488, 514 nm and HeNe-633 nm laser lines
Zeiss 710 NLO upright confocal microscope	Jena, Germany		Equipped with femtosecond Spectra - Physics Deep See MP laser (Santa Clara, United States) using a Plan-Apochromat 20X/1.0 NA water-immersion objective.