Human Dupuytren de<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Culture pour l&#39;étude de myofibroblastes et de matrice extracellulaire Interactions

Résumé

La maladie de Dupuytren (DD) est une maladie fibroproliférative de la paume de la main. Ici, nous présentons un protocole à la culture spécimens de résection de DD dans un (3D) système de culture tridimensionnelle. Ce système de culture à court terme permet la préservation de la structure 3D et propriétés moléculaires du tissu fibreux.

Résumé

Organ fibrosis or “scarring” is known to account for a high death toll due to the extensive amount of disorders and organs affected (from cirrhosis to cardiovascular diseases). There is no effective treatment and the in vitro tools available do not mimic the in vivo situation rendering the progress of the out of control wound healing process still enigmatic.

To date, 2D and 3D cultures of fibroblasts derived from DD patients are the main experimental models available. Primary cell cultures have many limitations; the fibroblasts derived from DD are altered by the culture conditions, lack cellular context and interactions, which are crucial for the development of fibrosis and weakly represent the derived tissue. Real-time PCR analysis of fibroblasts derived from control and DD samples show that little difference is detectable. 3D cultures of fibroblasts include addition of extracellular matrix that alters the native conditions of these cells.

As a way to characterize the fibrotic, proliferative properties of these resection specimens we have developed a 3D culture system, using intact human resections of the nodule part of the cord. The system is based on transwell plates with an attached nitrocellulose membrane that allows contact of the tissue with the medium but not with the plastic, thus, preventing the alteration of the tissue. No collagen gel or other extracellular matrix protein substrate is required. The tissue resection specimens maintain their viability and proliferative properties for 7 days. This is the first “organ” culture system that allows human resection specimens from DD patients to be grown ex vivo and functionally tested, recapitulating the in vivo situation.

Introduction

La maladie de Dupuytren (DD), une maladie fibroproliférative bénigne provoque la flexion des doigts permanente due à la formation de nodules et les cordons dans la paume de la main. Bien que la propagation de la maladie est particulièrement élevé chez les Caucasiens d'Europe du Nord, l'étiologie génétique sous-jacente de la maladie reste inconnue ^1. La principale caractéristique de DD est l'excès de production de matrice extracellulaire (ECM) protéines (par exemple, collagène), qui forment un tissu fibreux dur occupant l'espace entre les tendons et la peau de la paume de la main et des doigts, ce qui perturbe de façon permanente les mouvements fins de la main ^{2, 3.} La récurrence de la maladie suggère altérations génétiques sous-jacents comme une cause de la fibrose ^{1, 4.} Un traitement efficace pourrait être de cibler directement les mécanismes fibrotiques incontrôlables au niveau cellulaire et moléculaire.

Notre travail récent sur la fibrose nous a conduit à l'élaboration d'unnouveau système de culture en 3D qui permet la culture à court terme de tissu fibreux humain avec le potentiel de dépistage des drogues. Ce système a contribué à surmonter l'approche limite de cultures de fibroblastes 2D et de définir un rôle pour la régulation à la baisse partielle, réalisée par le saut d'exon, d'activation de la voie TGF dans la médiation de la fibrose ^5.

Nous avons développé une méthode à la culture ex vivo pièces d'exérèse humaine de patients DD pour étudier l'interaction entre les myofibroblastes et l'ECM entourant ^{5, 6.} L'étude de DD fibrose du tissu conjonctif ainsi que d'autres maladies fibrotiques se appuie sur l'analyse histopathologique de l'excisée chirurgicale spécimens, l'isolement des fibroblastes du tissu et l'établissement de cultures primaires ou de procédures de triage des cellules. Ces approches sont assez statique, car ils ne permettent pas la manipulation exogène des propriétés de la maladie ou une intervention thérapeutique par l'expérimentateur. En outre, CE primairecultures ll ont tendance à se adapter aux conditions de culture et de leurs propriétés d'expression des gènes diffèrent essentiellement de la situation in vivo sur tous les passages, même pendant les premiers passages (parmi passage 3 et 6) ^{7, 8.} Nous avons réussi à maintenir le matériel chirurgical des déchets ex vivo conditions de culture pour une période de temps qui permet l'étude des caractéristiques spécifiques du patient et le criblage de composés médicamenteux anti-fibrotiques ou anti-inflammatoires.

Le système est basé sur une membrane de nitrocellulose qui permet un contact du tissu avec le milieu, mais pas avec la matière plastique, par conséquent, la prévention de l'altération du tissu lors de la fixation, comme observé précédemment lors de la mise en culture de fibroblastes de DD ainsi que d'autres types de cellules ^9. Aucun gel de collagène ou d'un autre substrat de protéine ECM est nécessaire, étant donné que le tissu DD se produit de grandes quantités de ces protéines. Ce est avantageux pour l'entretien des micro ECM natif et le chiffre d'affaires le péchédes substrats à matrice CE sont régulateur important de l'architecture et de la fonction ^{10, 11} tissus. Par exemple, les protéines de la MEC telles que la fibronectine, la laminine et le collagène, peuvent influencer polarité avant-arrière de fibroblastes indiqués comme similaire à polarité apicale-basale dans les cellules epitheliales ^{12, 13} . cellules polarisées ont répartition asymétrique des molécules extracellulaires qui détermine la migration cellulaire et l'expression des gènes, par exemple, l'accessibilité de l'intégrine α1β1 sur la membrane affecte l'adhérence cellulaire de collagène de type I ^14. Etant donné que l'objectif principal de ce modèle 3D a été de préserver le micro-environnement natif, aucune substrat de matrice ECM artificielle a été utilisée.

En bref: pièces d'exérèse sont également coupés dans un environnement stérile et placés sur des membranes nitrocellular. Si le traitement administré par injection est nécessaire, les tissus sont injectés après qu'ils ont été placés sur la membrane. Si le traitement ne nécessite pas d'être administrés par injection puis le composé est ajouté au milieu de culture (milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM), avec 1% de sérum de veau foetal (FCS), 1% de pénicilline-streptomycine (P / S)). Les cultures sont maintenues pendant un maximum de dix jours, après quoi le tissu est fixé à 4% de paraformaldehyde (PFA), traité par une solution de saccharose à 30%, noyé dans du composé OCT et stocké à -80 ° C, comme décrit précédemment ^5.

Protocole

Ce protocole suit les directives LUMC et AMC de comité d'éthique de la recherche humaine.

1. Procédure chirurgicale et collecte de tissus

Remarque: Bien qu'il existe différentes techniques pour l'excision chirurgicale de la maladie de Dupuytren, l'étalon-or actuel est le fasciectomie partielle ^15. La plupart des patients sont traités dans la clinique chirurgie d'un jour.

1. Effectuer la chirurgie sous anesthésie générale ou régionale en fonction des préférences du patient et de l'anesthésiste'S et de co-morbidités du patient. Ces considérations sont au-delà de la portée de ce document. Avant l'incision, toucher la peau avec un objet pointu afin de vérifier que l'anesthésie est satisfaisante. Utilisez un garrot pour faciliter la visualisation chirurgicale dans un champ sans effusion de sang.
2. Après apprêter stérile et drapage, marquer l'incision prévue avec un stylo. Inciser la peau avec un scalpel sous loupe grossissement soit longitudinalement or en utilisant des incisions en zigzag à prévenir les contractures supplémentaires et également pour permettre une exposition suffisante.
3. Utilisation de ciseaux de dissection, libérer la peau et la couche sous-cutanée de sous-jacents les palmaire fascia contractés. Identifier et protéger le faisceau neurovasculaire du doigt parce que le cordon malade peut le déplacer vers la ligne médiane. Une fois que le tissu fibreux (nodules et / ou cordon) est décrite, exciser fortement et régional (montant) à l'aide d'un scalpel. Effectuer hémostase méticuleuse sous contrôle de garrot à la fin de la procédure pour éviter la formation d'hématome.
4. Pour fermer la peau, utiliser plasties en Z supplémentaires pour obtenir un allongement partielle de la peau.
5. Pour ces études utilisent seulement la partie des nodules du cordon fibreux, la partie la plus active et cellulaire de la maladie. Demandez le chirurgien procéder à une identification macroscopique. Les nodules isolés dans la paume de la main sont souvent précurseurs ou une corde, mais ne sont presque jamais résection, car ils ne causent habituellement pas de symptômes.Ceux que nous résection étaient les nodules qui faisaient partie d'un cordon du doigt contractée. Identifier ces nodules par la partie épaisse et dure des cordons dans le handpalm (figure 1A).
6. Une fois que le chirurgien retire le tissu, transférer immédiatement à l'aide de pinces stériles dans un tube de 50 ml contenant du milieu DMEM supplémenté avec 10% de FCS et 1% (P / S). Maintenir le tissu pour un maximum de deux heures dans ce milieu sur une zone de la glace humide (4 ° C) (par exemple, le transport du tissu à partir de la salle d'opération de l'outil de culture cellulaire).
7. Gardez les échantillons sur de la glace (4 ° C) tout en préparant la prochaine étape. Préparation de la chambre de matériaux et culture cellulaire nécessite de 10 à 20 min.

2. Préparation des instruments, milieu de culture et Culture Inserts

Remarque: Toutes les procédures sont réalisées à température ambiante sauf indication contraire.

1. Préparer 500 ml de DMEM supplémenté avec 10% de FCS et 1% (P / S) et le filtre sterilize. Préchauffer le milieu à 37 ° C.
2. Forceps autoclave, une paire de ciseaux Mayo courbes lame (150-170 mm de longueur) et une paire de ciseaux de Metzenbaum et conserver dans un récipient stérile.
3. Sous flux laminaire, ouvrez une plaque de 12 puits de culture stérile. Placez un insert de culture (0,45 um taille des pores, 12 mm de diamètre) dans chaque puits de la plaque à 12 puits (figure 1B, panneau inférieur).
4. Remplir la plaque 12 puits avec 600 pi de préchauffé (37 ° C) milieux de culture par pipetage sur le bien et non pas directement sur la membrane de l'insert. Placer la plaque dans l'incubateur (37 ° C, CO ₂ 5%) (figure 1B, panneau supérieur).
   1. Vous pouvez également utiliser une plaque de 24 puits et ajouter 300 ul de milieu par puits. Le volume de milieu par puits soit optimale en une couche de ménisque étant formée entre le liquide et la partie inférieure de l'insert de membrane.
      Remarque: le milieu au fond du puits se diffuse à travers la nitrocellulose membrane former la couche de ménisque comme représenté dans les schémas de la figure 1B (panneau inférieur).

3. tissus installation de culture de tissus Préparation et ex vivo

Remarque: Toutes les procédures sont réalisées à température ambiante sauf indication contraire.

1. Transférer la partie des nodules du cordon du tube de 50 ml sur un plat 100 mm Petri et ajouter 10 ml d'préchauffé (37 ° C) moyenne. Assurez-vous que le tissu est en contact avec le liquide pendant toute la procédure.
   1. Retirer la couche de graisse périnodulaire l'aide des ciseaux de Metzenbaum. Jeter le tissu adipeux. Avec l'utilisation de forceps et les ciseaux courbes lame, couper transversalement le tissu en petits morceaux (épaisseur maximale de 200 um).
2. Transférer la plaque à 12 puits à partir de l'incubateur dans la hotte laminaire. Vérifiez que la membrane de l'insert est devenu transparent (humide) et est donc en contact avec le milieu.
3. En utilisant des pincessoulevez délicatement une partie des tissus en touchant la couche externe (ne pas appliquer la tension sur le tissu). Placer une pièce de tissu sur la membrane de l'insert de culture cellulaire de sorte que le tissu reste à l'interphase air-milieu. Culture un maximum de deux pièces de tissu sur le même insert / puits.
4. Assurez-vous que le tissu est placé à plat sur la membrane, en contact avec le milieu longitudinal de telle sorte que le tissu ne glisse de la membrane ne est entièrement couvert par le milieu. Éviter les bulles d'air.
   Remarque: A ce stade, il est possible d'ajouter des facteurs de croissance ou des inhibiteurs d'intérêt pour les médias; par exemple, les composés d'essai (A, B, C, D, E) à répétitions et / ou en courbe de concentration. Inclure au moins deux pièces de contrôle (non traitées) de tissu dans des conditions de croissance normales pour se assurer que l'expérience a été mis en place correctement. Incuber les tissus pendant 3-7 jours dans un incubateur de culture de tissu.
5. Infecter le tissu avec soit lentiviral construction ou adénoviral si la surexpression ou assommer eXperiments d'un besoin gène d'intérêt à effectuer (Figure 2). Transférer une partie de tissu à partir de la plaque à 12 puits dans une boîte de 35 mm en utilisant une pince.
   1. Utiliser un volume maximum de 10 ul de virus à titre élevé.
   2. Effectuer l'injection sous un microscope à dissection avec une seringue à insuline chargé avec 50 pl de PBS contenant 10 ul de virus sélectionné. Placez l'aiguille perpendiculaire au centre du tissu.
   3. Lentement injecter le contenu de la seringue. Ne pas rentrer directement l'aiguille. Quand la perforation du tissu, ne pas laisser passer l'aiguille à travers l'autre côté mais à maintenir l'aiguille dans le tissu lui-même (autour du centre du tissu).
   4. Transférer le tissu de nouveau dans la plaque de 12 puits, fermer la plaque de culture et le placer dans l'incubateur (37 ° C, 5% de CO _2).

4. totalité montage immunofluorescence et de la reconstruction 3D

Remarque: Tous les proprocédures sont réalisées à température ambiante sauf indication contraire. Le protocole pour toute immunocoloration montage et l'imagerie décrit ci-dessous est une adaptation des méthodes utilisées précédemment rapportées pour d'autres tissus ^16-19. Tampons et matériaux sont décrits dans le Tableau 1 et la liste des matériaux.

1. tissus de transfert de la plaque de culture à 2 ml microtubes contenant du PBS. Laver 2x pendant 5 min dans une solution de PBS sur une plate-forme tournante. Fixer tissus dans 4% PFA tamponnée (1,5 ml de solution par le tissu dans 2 ml microtubes), O / N à 4 ° C sur une plate-forme tournante.
2. Retirer PFA et laver 3x dans du PBS pendant 5 min chacun.
3. Déshydrater les tissus par immersion dans une solution de methanol à 25% pendant 2 heures à la température ambiante sur une plate-forme tournante. Augmenter le pourcentage de méthanol progressivement (50%, 75%, 100%) avec les tissus immergés à chaque solution pendant 2 heures à la température ambiante sur une plate-forme tournante.
4. tissus de transfert dans du DMSO / solution méthanolique (étape de perméabilisation) pendant 3 semaines à 4 ° C,¹⁸ comme décrit précédemment.
   Remarque: A ce stade, les tissus peuvent être stockés à long terme à 100% de methanol à -20 ° C.
5. Passez à la procédure ^{16, 17} coloration; réhydrater progressivement les tissus (75% -50% -25% -0% de la série de méthanol). Effectuez chaque étape de réhydratation pendant 2 heures à la température ambiante ou O / N à 4 ° C, sous agitation constante.
6. Incuber les échantillons avec des anticorps primaires dans du PBS contenant 1% d'albumine de sérum bovin (BSA) et 20% de DMSO O / N à 4 ° C. Utilisation des anticorps selon les rapports suivants en utilisant les stocks commerciaux de PBS: anti-α actine de muscle lisse (1: 500, souris), de type anti-collagène de type I (1: 500, de chèvre) anti-collagène de type III (1: 500, chèvre).
7. Laver abondamment dans du PBS pendant 48 heures à 4 ° C (solution PBS changement de 3 à 4 fois).
8. Diluer anticorps secondaire approprié (Alexa 555 anti-souris, Alexa 488 anti-chèvre) à 1: 250 dilution dans du PBS contenant 1% (BSA) et 20% de DMSO. Incuber O / N à 4 ° C.
9. Laver abondamment dans du PBS pendant 48 heures à 476; C et incuber avec contre-coloration nucléaire, TO-PRO-3 dilué à 1: 500 dans du PBS à l'étape de lavage final.
   Remarque: TO-PRO-3 est une émission rouge lointain colorant d'ADN (avec une ligne laser 633 nm He-Ne) et est combiné pour l'imagerie simultanée avec d'autres canaux; dans ce type de type cas collagène I / collagène III (488 nm), α actine musculaire lisse (555 nm), TO-PRO-3 (647 nm).
10. Transférer les tissus à une série de methanol (25% -50% -75%) à déshydrater lentement le tissu; exécuter chaque étape de déshydratation pendant 2 heures à la température ambiante ou O / N à 4 ° C sous agitation constante.
    1. tissus de transfert dans des tubes en polypropylène. Tissus clairs dans le salicylate de méthyle (de poignée sous hotte chimique) ¹⁸ ou une utilisation alternative de solution BABB ^19. Incuber à température ambiante sous agitation constante jusqu'à ce que les tissus deviennent transparents. Mont entre lame et une lamelle scellé avec jeu dur milieu de montage (figure 1C, panneau supérieur).
11. échantillons d'images sur une micro confocal inverséportée équipée avec une grande NA 63X et / ou 100X objectifs à immersion d'huile (figure 1C).
    1. Nettoyez l'objectif avec une solution de nettoyage fournies par le fabricant de microscope.
    2. Appliquer une goutte d'huile sur la lentille d'objectif. Placez la lame avec l'échantillon sur la platine du microscope et de se concentrer sur l'échantillon.
12. Définissez les configurations sur le microscope pour l'imagerie simultanée de la fluorescence à trois canaux avec des lignes laser 488 nm, 514 nm et 633 nm.
13. Acquérir des images simples ou multiples XY images plan focal (Z) de la pile (Figure 3A). Utilisez augmentation de la largeur de la pile Z pour effectuer la reconstruction 3D. Pour obtenir une image à haute résolution utilise à faible vitesse de balayage, nombre de balayages moyenne (≥ 3) et acquérir des images 16 bits de résolution 1024 x 1024 pixels.
14. Analyser les images Z pile acquis: d'abord renommer et sauvegarder le fichier d'image (xyz). En utilisant le programme logiciel du microscope confocal, configurer une intensité maximale de projection des images Z de la pile dans un 3D reconstruite image.
    1. Sélectionnez le fichier xyz, dans les "Outils de process", cliquez sur la rubrique «Visualisation» et «Projection 3D". Entrez "Maximum" dans la méthode de projection (ou "moyenne" si le signal fluorescent est saturé). Pour une seule projection ne changent pas l'X, Y et Z avions, et appliquer l'outil de projection (figure 3B, r1).
15. Utilisez les images de la pile Z pour créer une projection 3D avec animation (logiciel confocal) aux fins de visionnement. Sélectionnez le fichier xyz, dans les outils de traitement, cliquez sur la rubrique «Visualisation» et «Projection 3D".
    1. Cliquez sur "Créer un film". Saisissez l'angle de rotation Démarrer en degrés (par exemple, 0 ° que le point du film, de l'axe Y départ) et cliquez sur "Démarrer Set". Saisissez l'angle de rotation en degrés End (axe Y) comme point de fin du film (par exemple, 180 ° ou 3606; pour une rotation complète) et cliquez sur "Fin Set".
    2. Sélectionnez "Maximum" comme une méthode de projection (ou "moyenne" si le signal fluorescent est saturé). Entrez le «Number of Frames» pour la rotation de la reconstruction 3D (par exemple, 20 rotations ou plus pour réduire la vitesse de rotation). Cliquez sur "Appliquer". Exporter le film en tant que fichier visuelle (par exemple, "avi") (Movie supplémentaire 1) ou à l'exportation comme des fichiers "tiff" qui crée un fichier image pour chaque angle de rotation (figure 3B; rotation r4, r10, r18).

5. valant deuxième génération d'harmoniques (collagène) et à deux photons de fluorescence excité (élastine) imagerie ex vivo sur des tissus au cours Culture

Remarque: Toutes les procédures sont réalisées à température ambiante sauf indication contraire.

1. Retirer les plaques transwell de l'incubateur et placer un seul (non fixée) tiquest partie dans une plaque de culture cellulaire de 35 mm contenant 500 ul de milieu.
2. Placez le tissu de sorte que le grand axe est à plat sur la plaque. Gardez tissu humide à tout moment cependant, pas flottante.
3. Passer objectif immergé dans l'eau du microscope multiphoton directement en contact avec le tissu (Figure 1C).
4. Obtenir des images avec une longueur d'onde d'excitation de 800 nm et de recueillir la lumière émise entre 371 à 425 nm (SHG, le collagène) et de 474 à 532 nm (autofluorescence, élastine) (figure 3C). Effectuer microscopie à deux photons dans un microscope confocal verticale équipé d'un laser femtoseconde au moyen d'un objectif eau d'immersion 20X / NA 1.0. Processus confocale empile avec le logiciel du fabricant.
   Remarque: Excitation avec un laser infrarouge proche des molécules de collagène crée des images de contraste élevé de structures de collagène natif à différentes profondeurs.

Résultats

La méthode de l'ex vivo, la culture 3D de tissu conjonctif est un ensemble en place un système robuste et facile à comprendre la relation entre l'ECM et les autres composants de cellules constituant le tissu DD et potentiellement d'autres types de fibrose ainsi. En outre, ce système permet une méthode fiable pour tester les effets de composés sur différents types de cellules et de leurs effets sur la charge fibrotique ^20.

Les étapes de la collection de...

Discussion

Les étapes les plus critiques de la culture ex vivo du tissu conjonctif humain sont l'utilisation immédiate du tissu après l'ablation chirurgicale pour assurer la viabilité; le tissu doit rester en solution à moyen ou une solution saline en tout temps; maintenir une culture stérile; des coupes transversales de tissu doivent avoir une épaisseur maximale de 200 um; mise en place du système ex vivo de culture est optimale lorsque le tissu est en contact avec le milieu, mais non totalement ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium	Invitrogen	11965-084
fetal calf serum (FCS)	Gibco		high glucose, heat inactivated
penicillin-streptomycin	Invitrogen	15070-063
Cell culture inserts	Millicell	PIHA01250	0.45 μm pore size, 12 mm diameter
anti-collagen type I	Southern Biotech	1310-08
anti-α smooth muscle actin	Sigma	A2547
anti-collagen type III	Southern Biotech	1330-01
Alexa Fluor555 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)	Invitrogen	A-31570
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody	Invitrogen	A-11055
TOPRO-3	Invitrogen	T3605
methylsalicylate	Sigma	M6752
paraformaldehyde	Sigma	P6148
Tissue Tek OCT	Sakura	25608-930
Microsccope glass coverslips	Menzel-Glaser	BB024060A1	24 x 60 mm
Microscope SuperFrost slides	Menzel-Glaser	AA00000102E	76 x 26 mm
VECTASHIELD HardSet Mounting Medium	Vector laboratories	H-1400
Leica TCS SP5 II confocal microscope	Leica Microsystems		Argon-488, 514 nm and HeNe-633 nm laser lines
Zeiss 710 NLO upright confocal microscope	Jena, Germany		Equipped with femtosecond Spectra - Physics Deep See MP laser (Santa Clara, United States) using a Plan-Apochromat 20X/1.0 NA water-immersion objective.