Humano Dupuytren<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultura para el Estudio de miofibroblastos y matriz extracelular Interacciones

Resumen

Enfermedad de Dupuytren (DD) es una enfermedad fibroproliferativa de la palma de la mano. A continuación, presentamos un protocolo para muestras de resección cultura de DD en un sistema de cultivo en tres dimensiones (3D). Tal sistema de cultivo a corto plazo permite la preservación de la estructura 3D y propiedades moleculares del tejido fibrótico.

Resumen

Organ fibrosis or “scarring” is known to account for a high death toll due to the extensive amount of disorders and organs affected (from cirrhosis to cardiovascular diseases). There is no effective treatment and the in vitro tools available do not mimic the in vivo situation rendering the progress of the out of control wound healing process still enigmatic.

To date, 2D and 3D cultures of fibroblasts derived from DD patients are the main experimental models available. Primary cell cultures have many limitations; the fibroblasts derived from DD are altered by the culture conditions, lack cellular context and interactions, which are crucial for the development of fibrosis and weakly represent the derived tissue. Real-time PCR analysis of fibroblasts derived from control and DD samples show that little difference is detectable. 3D cultures of fibroblasts include addition of extracellular matrix that alters the native conditions of these cells.

As a way to characterize the fibrotic, proliferative properties of these resection specimens we have developed a 3D culture system, using intact human resections of the nodule part of the cord. The system is based on transwell plates with an attached nitrocellulose membrane that allows contact of the tissue with the medium but not with the plastic, thus, preventing the alteration of the tissue. No collagen gel or other extracellular matrix protein substrate is required. The tissue resection specimens maintain their viability and proliferative properties for 7 days. This is the first “organ” culture system that allows human resection specimens from DD patients to be grown ex vivo and functionally tested, recapitulating the in vivo situation.

Introducción

Enfermedad de Dupuytren (DD), una enfermedad benigna fibroproliferativa provoca la flexión permanente de los dedos debido a la formación de nódulos y cordones en la palma de la mano. Aunque la propagación de la enfermedad es particularmente alto entre los caucásicos del norte de Europa, la etiología genética subyacente de la enfermedad sigue siendo desconocida ^1. La principal característica de DD es el exceso de producción de (ECM) proteínas de la matriz extracelular (por ejemplo, colágeno), que forman un tejido fibroso duro que ocupa el espacio entre los tendones y la piel de la palma de la mano y los dedos, lo que altera permanentemente los movimientos finos de la mano ^{2, 3.} La recurrencia de la enfermedad sugiere alteraciones genéticas subyacentes como una causa de la fibrosis ^{1, 4.} Un tratamiento eficaz podría ser para apuntar directamente los mecanismos fibróticas incontrolables a nivel celular y molecular.

Nuestro trabajo reciente sobre la fibrosis nos ha llevado al desarrollo de unnovedoso sistema de cultivo 3D que permite cultivo a corto plazo de tejido fibrótico humano con el potencial de pruebas de drogas. Este sistema ha ayudado a superar el enfoque limitante de cultivos de fibroblastos 2D y definir el papel de la regulación a la baja parcial, logrado por la omisión de exón, de activación de la vía TGF en la mediación de la fibrosis ^5.

Hemos desarrollado un método para el cultivo ex vivo especímenes de resección humana de pacientes con DD para estudiar la interacción entre los miofibroblastos y la ECM circundante ^{5, 6.} El estudio de DD fibrosis del tejido conectivo, así como otras enfermedades fibróticas se basa en el análisis histopatológico de la extirpado quirúrgica especímenes, el aislamiento de los fibroblastos del tejido y el establecimiento de cultivos primarios o procedimientos de clasificación de células. Estos enfoques son bastante estática, ya que no permiten la manipulación exógena de las propiedades de la enfermedad o intervención terapéutica por el experimentador. Además, ce primariall culturas tienden a adaptarse a las condiciones de cultivo y sus propiedades de expresión de genes difieren esencialmente de la situación in vivo después de cada paso, incluso durante los primeros pasajes (entre el paso 3 y 6) ^{7, 8.} Hemos logrado mantener el material quirúrgico de residuos en ex vivo condiciones de cultivo para un periodo de tiempo que permite el estudio de las características específicas del paciente y el cribado de compuestos de fármacos anti-fibróticos o anti-inflamatorios.

El sistema se basa en una membrana de nitrocelulosa que permite el contacto del tejido con el medio, pero no con el plástico, por lo tanto, la prevención de la alteración del tejido tras la unión, como ya se observó cuando el cultivo de fibroblastos DD, así como otros tipos de células ^9. No se requiere gel de colágeno u otro sustrato de proteínas ECM, ya que el propio tejido DD produce grandes cantidades de estas proteínas. Esto es ventajoso para el mantenimiento de la microambiente ECM nativa y sin rotaciónsustratos de matriz ce son importantes regulador de la arquitectura y la función ^{10, 11} tejidos. Por ejemplo, las proteínas ECM como la fibronectina, laminina y colágeno, pueden influir en la polaridad delantero-trasero del fibroblastos mostradas como igualmente para la polaridad apical-basal en las células epiteliales de ^{12, 13} . células polarizadas tienen una distribución asimétrica de moléculas extracelulares que determina la migración celular y la expresión génica, por ejemplo, la accesibilidad de la integrina α1β1 en la membrana afecta a la adhesión celular a colágeno de tipo I ^14. Puesto que un objetivo principal de este modelo 3D era preservar el microambiente nativo, no se utilizó sustrato matriz ECM artificial.

En resumen: los especímenes de resección son igualmente cortados en un ambiente estéril y se colocaron en membranas nitrocellular. Si se requiere un tratamiento administrado a través de la inyección de los tejidos se inyectan después de que se han colocado en la membrana. Si el tratamiento no requiere ser administrado a través de injección entonces el compuesto se añade al medio de cultivo (Medio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM), con 1% de suero de ternera fetal (FCS), 1% de penicilina-estreptomicina (P / S)). Los cultivos se mantuvieron durante un máximo de diez días después de que el tejido se fija en 4% de paraformaldehído (PFA), procesado a través de solución de sacarosa al 30%, embebidos en compuesto OCT y se almacenaron a -80 ° C, como se describió previamente ^5.

Protocolo

Este protocolo sigue las directrices LUMC y AMC de comité de ética de investigación humana.

1. Procedimiento Quirúrgico y Tejidos Colección

Nota: A pesar de que existen diversas técnicas para la extirpación quirúrgica de la contractura de Dupuytren, el actual estándar de oro es la fasciectomía parcial ^15. La mayoría de los pacientes son tratados en el hospital de día de la cirugía.

1. Hacer una cirugía con anestesia general o regional de acuerdo con las preferencias del paciente y anestesiólogo de y para las comorbilidades del paciente. Estas consideraciones están más allá del alcance de este documento. Antes de la incisión, toque la piel con un objeto afilado para verificar que la anestesia es satisfactoria. Use un torniquete para facilitar la visualización quirúrgica en un entorno sin sangre.
2. Después de preparar de estéril y drapeado, marcar la incisión anticipada con un bolígrafo. Incisión en la piel con un bisturí con una lupa lupa de forma longitudinal or mediante incisiones en zigzag para evitar contracturas adicionales y también para permitir una exposición suficiente.
3. El uso de la disección de tijera, liberar a la piel y la capa subcutánea de los subyacentes palmar fascia contratados. Identificar y proteger el paquete neurovascular del dedo porque el cable enfermo puede desplazarlo hacia la línea media. Una vez que el tejido fibrótico (nódulo y / o espinal) se perfila, extirparlo bruscamente y regional (subtotal) utilizando un bisturí. Realice una hemostasia meticulosa bajo control torniquete al final del procedimiento para evitar la formación de hematoma.
4. Para cerrar la piel, utilice Z-plastias adicionales para obtener el alargamiento parcial de la piel.
5. Para estos estudios utilizan sólo la parte del cable de nódulo fibrótico, la parte más activa y celular de la enfermedad. Haga que el cirujano realice la identificación macroscópica. Los nódulos aislados en la palma de la mano son a menudo precursores o una cuerda, pero casi nunca se resecan, ya que por lo general no causan síntomas.Los que fueron resecados los nódulos que formaban parte de un cordón del dedo contratado. Identificar estos nódulos por la parte gruesa duro de las cuerdas en el handpalm (Figura 1A).
6. Una vez que el cirujano extirpa el tejido, inmediatamente transferir utilizando pinzas estériles a un tubo de 50 ml que contenía medio DMEM suplementado con 10% de FCS y 1% (P / S). Mantener el tejido por un máximo de 2 horas en este medio en una caja de hielo húmedo (4 ° C) (por ejemplo, el transporte del tejido desde la sala de operación para las instalaciones de cultivo celular).
7. Mantener las muestras en hielo (4 ° C) mientras se prepara para el siguiente paso. Preparación de la cámara de materiales y cultivo celular requiere 10-20 min.

2. Preparación de los instrumentos, medio de cultivo y Cultura Inserciones

Nota: Todos los procedimientos se realizan a temperatura ambiente a menos que se indique específicamente.

1. Preparar 500 ml de DMEM suplementado con 10% de FCS y 1% (P / S) y el filtro sterilize. Calentar inicialmente el medio a 37 ° C.
2. Fórceps Autoclave, un par de tijeras de Mayo-curvadas hoja (150-170 mm de longitud) y un par de tijeras Metzenbaum y guardar en un recipiente estéril.
3. Bajo flujo laminar, abra una placa de cultivo de 12 pocillos estériles. Coloque un inserto de cultivo (0,45 micras de tamaño de poro, 12 mm de diámetro) en cada pocillo de la placa de 12 pocillos (Figura 1B, panel inferior).
4. Llene la placa de 12 pocillos con 600 l de precalentado (37 ° C) los medios de cultivo por pipeteo en el pozo y no directamente sobre la membrana de la inserción. Colocar la placa en la incubadora (37 ° C, 5% de CO ₂₎ (Figura 1B, panel superior).
   1. También puede utilizar una placa de 24 pocillos y añadir 300 l de medio por pocillo. El volumen de medio por pocillo es óptima cuando se forma una capa de menisco entre el líquido y la parte inferior de la inserción de la membrana.
      Nota: el medio en la parte inferior del pozo se difunde a través de la membr nitrocelulosaane formar la capa de menisco como se representa en los esquemas de la figura 1B (panel inferior).

3. Tejido Preparación Configuración y ex vivo de Cultivo de Tejidos

Nota: Todos los procedimientos se realizan a temperatura ambiente a menos que se indique específicamente.

1. Transferir la parte nódulo del cable desde el tubo de 50 ml en una placa de Petri de 100 mm y añadir 10 ml de precalentado (37 ° C) medio. Asegúrese de que el tejido está en contacto con el líquido durante todo el procedimiento.
   1. Retire la capa de grasa perinodular con las tijeras Metzenbaum. Deseche el tejido graso. Con el uso de fórceps y las tijeras curvadas hoja, cortar transversalmente el tejido en trozos más pequeños (espesor máximo de 200 micras).
2. Transferir la placa de 12 pocillos de la incubadora en la campana laminar. Compruebe que la membrana de la inserción se ha vuelto transparente (húmedo) y por lo tanto está en contacto con el medio.
3. Con unas pinzaslevante con cuidado una parte de tejido tocando la capa exterior (no aplicar tensión en el tejido). Colocar una parte de tejido sobre la membrana del inserto de cultivo celular para que el tejido permanece en la interfase aire-medio. Cultura un máximo de dos partes de tejido en el mismo inserto / pocillo.
4. Asegúrese de que el tejido se coloca plana sobre la membrana, en contacto con el medio longitudinal de tal manera que el tejido no flota fuera de la membrana ni está totalmente cubierto por medio. Evite las burbujas de aire.
   Nota: En esta etapa, es posible añadir factores de crecimiento o inhibidores de interés para los medios de comunicación; por ejemplo, los compuestos de ensayo (A, B, C, D, E) en repeticiones y / o en curva de concentración. Incluya por lo menos 2 de control (sin tratar) trozos de tejido en condiciones normales de crecimiento para asegurar que el experimento se ha establecido correctamente. Incubar los tejidos durante 3-7 días en una incubadora de cultivo de tejidos.
5. Infectar el tejido, ya sea con constructo lentiviral o si adenoviral sobreexpresión o derribar experimentos de una necesidad de genes de interés a realizar (Figura 2). Transferir una parte del tejido de la placa de 12 pocillos en una placa de 35 mm con pinzas.
   1. Utilizar un volumen máximo de 10 l de virus de alto título.
   2. Realice la inyección bajo un microscopio de disección con una jeringa de insulina cargada con 50 l de PBS que contiene 10 l de la virus seleccionado. Coloque la aguja perpendicular al centro del tejido.
   3. Lentamente inyectar el contenido de la jeringa. No retraiga la aguja directamente. Al pinchar el tejido, no permita que la aguja pase por el otro lado, pero mantener la aguja dentro del propio tejido (alrededor del centro del tejido).
   4. Transferir el tejido nuevo en la placa de 12 pocillos, cierre la placa de cultivo y colóquelo en la incubadora (37 ° C, 5% de CO _2).

4. Todo el montaje de inmunofluorescencia tinción y Reconstrucción 3D

Nota: Todos los prolos procedimientos se llevan a cabo a temperatura ambiente a menos que se indique específicamente. El protocolo para toda la inmunotinción de montaje y de formación de imágenes se describe a continuación es una adaptación de los métodos reportados previamente utilizados para otros tejidos ^16-19. Tampones y materiales se describen en la Tabla 1 y la Lista de Materiales.

1. Tejidos de transferencia de la placa de cultivo a 2 ml tubos de microcentrífuga que contenían PBS. Lavado 2x por 5 min en una solución de PBS en una plataforma giratoria. Fijar los tejidos en 4% PFA tamponada (1,5 ml de solución por el tejido en 2 ml tubos de microcentrífuga), O / N a 4 ° C en una plataforma giratoria.
2. Retire PFA y lavar 3 veces en PBS durante 5 minutos cada uno.
3. Deshidratar tejidos por inmersión en una solución de metanol 25% durante 2 h a RT sobre una plataforma giratoria. Aumentar el porcentaje de metanol gradualmente (50%, 75%, 100%) con los tejidos sumergidos en cada solución durante 2 h a RT sobre una plataforma giratoria.
4. Tejidos de transferencia en DMSO / solución de metanol (paso permeabilización) durante 3 semanas a 4 ° C,como se ha descrito previamente ^18.
   Nota: En esta etapa, los tejidos se pueden almacenar a largo plazo en 100% de metanol a -20 ° C.
5. Continúe con el procedimiento de tinción ^{16, 17;} rehidratar gradualmente los tejidos (75% -50% -25% -0% serie metanol). Realizar cada etapa de rehidratación durante 2 horas a temperatura ambiente o O / N a 4 ° C, con agitación constante.
6. Incubar las muestras con anticuerpos primarios en PBS que contenía 1% de albúmina de suero bovino (BSA) y 20% DMSO O / N a 4 ° C. Utilice anticuerpos en las siguientes proporciones utilizando las reservas comerciales en PBS: actina de músculo liso anti-α (1: 500, ratón), anti-colágeno tipo I (1: 500, de cabra), anti-colágeno tipo III (1: 500, cabra).
7. Lavar extensivamente en PBS durante 48 horas a 4 ° C (cambio de solución de PBS de 3 a 4 veces).
8. Diluir anticuerpos secundarios apropiados (Alexa 555 anti-ratón, Alexa 488 anti-cabra) a 1: 250 dilución en PBS que contenía 1% (BSA) y 20% DMSO. Incubar O / N a 4 ° C.
9. Lavar extensivamente en PBS durante 48 horas a 476; C e incubar con contratinción nuclear, TO-PRO-3 diluido 1: 500 en PBS a la etapa de lavado final.
   Nota: TO-PRO-3 es un tinte de ADN emisor de rojo lejano (con una línea de láser de 633 nm de He-Ne) y se combina para formación de imágenes simultánea con otros canales; en este tipo de colágeno caso de E / colágeno tipo III (488 nm), α-actina de músculo liso (555 nm), TO-PRO-3 (647 nm).
10. Transferir los tejidos a una serie metanol (25% -50% -75%) para deshidratar lentamente el tejido; realizar cada etapa de deshidratación durante 2 horas a temperatura ambiente o O / N a 4 ° C con agitación constante.
    1. Tejidos de transferencia en tubos de polipropileno. Tejidos claros en salicilato de metilo (mango bajo el capó química) ¹⁸ o como uso alternativo solución BABB ^19. Se incuba a RT con agitación constante hasta que los tejidos se vuelven transparentes. Monte entre un portaobjetos y un cubreobjetos sellada con juego duro medio de montaje (Figura 1C, panel superior).
11. Muestras de imagen en un micro confocal invertidoalcance equipado con alta NA 63X y / o 100X objetivos de inmersión en aceite (Figura 1C).
    1. Limpiar la lente con la solución de limpieza proporcionado por el fabricante microscopio.
    2. Aplicar una gota de aceite sobre la lente del objetivo. Colocar el portaobjetos con la muestra sobre la platina del microscopio y enfoque en la muestra.
12. Establezca las configuraciones en el microscopio en busca de imágenes simultáneas de la fluorescencia de tres canales con líneas de láser de 488 nm, 514 nm y 633 nm.
13. Adquirir imágenes individuales XY o varias imágenes de plano focal (Z pila) (Figura 3A). Utilice una mayor anchura de Z pila para realizar la reconstrucción 3D. Para obtener una imagen de alta resolución de usar baja velocidad de exploración, número de exploraciones promedio (≥ 3) y adquirir imágenes de 16 bits de resolución 1024 x 1024 píxeles.
14. Analizar las imágenes adquiridas Z pila: primero cambiar el nombre y guardar el archivo de imagen (xyz). Utilizando el programa de software del microscopio confocal, configurar proje máxima intensidadcción de las imágenes Z pila en un 3D reconstruido imagen.
    1. Seleccione el archivo xyz, en las "Herramientas de proceso", haga clic en "Visualización" y "Proyección 3D". Enter "Máximo" en el método de proyección (o "promedio" si la señal fluorescente está saturado). Para una sola proyección no cambian los ejes X, Y y Z aviones, y aplicar la herramienta de proyección (Figura 3B, r1).
15. Utilice las imágenes de pila Z para crear una proyección en 3D con animación (software confocal) para fines de visualización. Seleccione el archivo xyz, en las herramientas de proceso, haga clic en "Visualización" y "Proyección 3D".
    1. Haga clic en "Crear Película". Introduzca el ángulo de inicio de rotación en grados (por ejemplo, 0 ° como punto de partida de la película, eje Y) y haga clic en "Start Set". Introduzca el ángulo final de giro en grados (eje Y) como punto final de la película (por ejemplo, 180 ° o 3606; para una rotación completa) y haga clic en "End Set".
    2. Seleccione "máxima" como método de proyección (o "promedio" si la señal fluorescente está saturado). Introduzca el "Number of Frames" para la rotación de la reconstrucción 3D (por ejemplo, 20 rotaciones o superior para reducir la velocidad de rotación). Haga clic en "Aplicar". Exportar la película como archivo visual (por ejemplo, "avi") (Película 1 complementario) o exportar como archivo "tiff" que crea un archivo de imagen para cada ángulo de rotación (Figura 3B; r4 rotación, r10, r18).

5. Combinado de segunda generación armónica (colágeno) y de dos fotones de fluorescencia Emocionado (elastina) Imaging en ex vivo de tejidos durante la Cultura

Nota: Todos los procedimientos se realizan a temperatura ambiente a menos que se indique específicamente.

1. Retire las placas transwell de la incubadora y colocar una sola (sin fijar) tiparte DICIÓN en una placa de cultivo celular de 35 mm que contiene 500 l de medio.
2. Coloque el tejido de modo que el eje largo es plana en la placa. Mantenga tejido húmedo en todo momento sin embargo, no flotante.
3. Coloque objetivo sumergido en agua del microscopio multifotónica directamente en contacto con el tejido (Figura 1C).
4. Obtener imágenes con una longitud de onda de excitación de 800 nm y recoger la luz emitida entre 371-425 nm (SHG, colágeno) y 474-532 nm (autofluorescencia, elastina) (Figura 3C). Realizar microscopía de dos fotones en un microscopio confocal vertical equipado con un láser de femtosegundo usando un objetivo de inmersión en agua 20X / 1,0 NA. Confocal Proceso apila con el software del fabricante.
   Nota: la excitación con un láser de infrarrojo cercano de moléculas de colágeno de alta crea imágenes de contraste de las estructuras de colágeno nativo en diferentes profundidades.

Resultados

El método de la ex vivo, la cultura 3D de tejido conectivo es un conjunto de hasta sistema fácil y robusto para comprender la relación entre ECM y otros componentes de las células que constituyen el tejido DD y potencialmente otros tipos de fibrosis, así. Además, este sistema permite un método fiable para probar los efectos de los compuestos sobre diferentes tipos de células y sus efectos sobre la carga ²⁰ fibrótica.

Los pasos de la colección de material de dese...

Discusión

Los pasos más críticos de cultivo de tejido conectivo ex vivo humano son el uso inmediato del tejido después de la extirpación quirúrgica para asegurar la viabilidad; el tejido debe permanecer en solución del medio o solución salina en todo momento; mantener un cultivo estéril; secciones transversales de tejido deben tener un grosor máximo de 200 micras; configurar el sistema de cultivo ex vivo es óptima cuando el tejido está en contacto con el medio, pero no completamente sumergido. Medio d...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium	Invitrogen	11965-084
fetal calf serum (FCS)	Gibco		high glucose, heat inactivated
penicillin-streptomycin	Invitrogen	15070-063
Cell culture inserts	Millicell	PIHA01250	0.45 μm pore size, 12 mm diameter
anti-collagen type I	Southern Biotech	1310-08
anti-α smooth muscle actin	Sigma	A2547
anti-collagen type III	Southern Biotech	1330-01
Alexa Fluor555 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)	Invitrogen	A-31570
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody	Invitrogen	A-11055
TOPRO-3	Invitrogen	T3605
methylsalicylate	Sigma	M6752
paraformaldehyde	Sigma	P6148
Tissue Tek OCT	Sakura	25608-930
Microsccope glass coverslips	Menzel-Glaser	BB024060A1	24 x 60 mm
Microscope SuperFrost slides	Menzel-Glaser	AA00000102E	76 x 26 mm
VECTASHIELD HardSet Mounting Medium	Vector laboratories	H-1400
Leica TCS SP5 II confocal microscope	Leica Microsystems		Argon-488, 514 nm and HeNe-633 nm laser lines
Zeiss 710 NLO upright confocal microscope	Jena, Germany		Equipped with femtosecond Spectra - Physics Deep See MP laser (Santa Clara, United States) using a Plan-Apochromat 20X/1.0 NA water-immersion objective.