Umana Dupuytren di<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultura per lo Studio dei miofibroblasti e matrice extracellulare Interazioni

Riepilogo

Malattia di Dupuytren (DD) è una malattia fibroproliferativa del palmo della mano. Qui vi presentiamo un protocollo per i campioni della cultura di resezione di DD in un tridimensionale (3D) sistema di coltura. Tale sistema di coltura a breve termine permette conservazione della struttura 3D e proprietà molecolari del tessuto fibrotico.

Abstract

Organ fibrosis or “scarring” is known to account for a high death toll due to the extensive amount of disorders and organs affected (from cirrhosis to cardiovascular diseases). There is no effective treatment and the in vitro tools available do not mimic the in vivo situation rendering the progress of the out of control wound healing process still enigmatic.

To date, 2D and 3D cultures of fibroblasts derived from DD patients are the main experimental models available. Primary cell cultures have many limitations; the fibroblasts derived from DD are altered by the culture conditions, lack cellular context and interactions, which are crucial for the development of fibrosis and weakly represent the derived tissue. Real-time PCR analysis of fibroblasts derived from control and DD samples show that little difference is detectable. 3D cultures of fibroblasts include addition of extracellular matrix that alters the native conditions of these cells.

As a way to characterize the fibrotic, proliferative properties of these resection specimens we have developed a 3D culture system, using intact human resections of the nodule part of the cord. The system is based on transwell plates with an attached nitrocellulose membrane that allows contact of the tissue with the medium but not with the plastic, thus, preventing the alteration of the tissue. No collagen gel or other extracellular matrix protein substrate is required. The tissue resection specimens maintain their viability and proliferative properties for 7 days. This is the first “organ” culture system that allows human resection specimens from DD patients to be grown ex vivo and functionally tested, recapitulating the in vivo situation.

Introduzione

Malattia di Dupuytren (DD), una malattia benigna fibroproliferativa provoca la flessione permanente delle dita a causa della formazione di noduli e corde nel palmo della mano. Anche se la diffusione della malattia è particolarmente alta tra i caucasici del Nord Europa, l'eziologia genetica alla base della malattia resta sconosciuta ^1. La caratteristica principale del DD è l'eccesso di produzione di matrice extracellulare (ECM) proteine ​​(per esempio, collagene), che costituiscono un tessuto fibroso duro che occupa lo spazio tra i tendini e la pelle del palmo della mano e delle dita, interrompendo definitivamente i movimenti fini della mano ^{2, 3.} La ricorrenza della malattia suggerisce alterazioni genetiche sottostanti come causa di fibrosi ^{1, 4.} Un trattamento efficace potrebbe essere quella di indirizzare direttamente le incontrollabili meccanismi fibrotiche a livello cellulare e molecolare.

Il nostro recente lavoro sulla fibrosi ci ha portato allo sviluppo di unnuovo sistema cultura in 3D che permette di cultura a breve termine di tessuto fibrotico umano con il potenziale di test anti-droga. Questo sistema ha contribuito a superare l'approccio limitazione di colture di fibroblasti 2D e definire un ruolo per la regolazione giù parziali, raggiunti da exon skipping, di TGFβ attivazione della via nella mediazione fibrosi ^5.

Abbiamo sviluppato un metodo di coltura ex vivo campioni di resezione umano da pazienti DD di studiare l'interazione tra miofibroblasti e ECM circostante ^{5, 6.} Lo studio della fibrosi tessuto connettivo DD nonché altre malattie fibrotiche basa sull'analisi istopatologica del escisso chirurgica esemplari, l'isolamento dei fibroblasti del tessuto e la creazione di colture primarie o procedure di separazione delle cellule. Questi approcci sono alquanto statico in quanto non consentono la manipolazione delle proprietà esogena malattia o intervento terapeutico dallo sperimentatore. Inoltre, ce primariall culture tendono ad adattarsi alle condizioni di coltura e le loro proprietà di espressione genica differiscono sostanzialmente dalla situazione in vivo su ogni passaggio, anche durante i primi passaggi (tra il passaggio 3 e 6) ^{7, 8.} Siamo riusciti a mantenere il materiale chirurgico rifiuti ex vivo condizioni di coltura per un periodo di tempo che permette lo studio delle caratteristiche specifiche del paziente e lo screening di composti farmacologici anti-fibrotiche o anti-infiammatori.

Il sistema si basa su una membrana di nitrocellulosa che permette il contatto del tessuto con il mezzo, ma non con la plastica, quindi, impedendo l'alterazione del tessuto su di attaccamento, come precedentemente osservato quando la coltura fibroblasti DD così come altri tipi di cellule ^9. Non è richiesta alcuna gel di collagene o altro substrato proteine ​​ECM, poiché la stessa tessuto DD produce grandi quantità di queste proteine. Questo è vantaggioso per il mantenimento dei nativi microambiente ECM e il fatturato del peccatosubstrati matrice ce sono importante regolatore dell'architettura del tessuto e della funzione ^{10, 11.} Ad esempio, le proteine ​​ECM, come fibronectina, laminina e collagene, possono influenzare la polarità anteriore-posteriore fibroblasti come simile mostrati per polarità apicale-basale in cellule epiteliali ^{12, 13} . cellule polarizzate hanno una distribuzione asimmetrica di molecole extracellulari che determina la migrazione delle cellule e l'espressione genica, ad esempio, l'accessibilità α1β1 integrina sulla membrana colpisce adesione delle cellule al collagene di tipo I ^14. Dal momento che l'obiettivo primario di questo modello 3D è stato quello di preservare il microambiente nativo, è stato utilizzato alcun substrato matrice ECM artificiale.

In breve: campioni di resezione sono ugualmente tagliati in un ambiente sterile e posti su membrane nitrocellular. Se è richiesto un trattamento somministrato tramite iniezione i tessuti vengono iniettati dopo che sono state collocate sulla membrana. Se il trattamento non ha bisogno di essere amministrato via injezione poi il composto viene aggiunto al mezzo di coltura (Dulbecco Modified mezzo di Eagle (DMEM), con siero fetale di vitello 1% (FCS), 1% di penicillina-streptomicina (P / S)). Le colture vengono mantenute per un massimo di dieci giorni dopo che il tessuto è fissato in 4% paraformaldeide (PFA), elaborati attraverso soluzione di saccarosio al 30%, incorporato in OCT e conservati a -80 ° C, come descritto in precedenza ^5.

Protocollo

Questo protocollo segue le linee guida LUMC e AMC di umana comitato etico della ricerca.

1. Procedura chirurgica e Tissue Collection

Nota: Anche se esistono varie tecniche per l'asportazione chirurgica della contrattura di Dupuytren, il gold standard attuale è il fasciectomy parziali ^15. La maggior parte dei pazienti sono trattati nella clinica day-surgery.

1. Eseguire l'intervento chirurgico in anestesia generale o regionale in base alle preferenze del paziente e anestesista di e comorbidità del paziente. Queste considerazioni sono oltre la portata di questo documento. Prima di Incisione, toccare la pelle con un oggetto appuntito per verificare che l'anestesia sia soddisfacente. Utilizzare un laccio emostatico per facilitare la visualizzazione chirurgica in un campo esangue.
2. Dopo Prepping sterile e drappeggi, segnare l'incisione previsto con una penna. Incidere la pelle con un bisturi sotto lente di ingrandimento sia longitudinalmente or utilizzando incisioni zigzag per prevenire contratture addizionali e anche per consentire l'esposizione sufficiente.
3. Utilizzando forbici dissezione, liberare la pelle e lo strato sottocutaneo dalle sottostanti palmare fascia contratto. Identificare e proteggere il fascio neurovascolare del dito perché il cavo di malati può spostare verso la linea mediana. Una volta che il tessuto fibrotico (noduli e / o spinale) è delineato, accise bruscamente e regionale (subtotale) con un bisturi. Eseguire emostasi meticolosa sotto controllo del laccio al termine della procedura per impedire la formazione di ematomi.
4. Per chiudere la pelle, utilizzare ulteriori Z-plasties avere allungamento parziale della pelle.
5. Per questi studi utilizzano solo la parte del cavo nodulo fibrotico, la parte più attiva e cellulare della malattia. Avere il chirurgo esegue l'identificazione macroscopica. I noduli isolati nel palmo della mano sono spesso precursori o un cavo, ma sono quasi mai resecati, come di solito non causano sintomi.Quelli che sono stati sottoposti a resezione i noduli che facevano parte di un cavo del dito contratto. Identificare questi noduli dalla parte spessa duro delle cordicelle nel handpalm (Figura 1A).
6. Una volta che il chirurgo rimuove il tessuto, trasferire immediatamente usando pinze sterili in una provetta da 50 ml contenente DMEM supplementato con 10% FCS e 1% (P / S). Mantenere il tessuto per un massimo di 2 ore in questo mezzo su una scatola di ghiaccio acquoso (4 ° C) (per esempio, il trasporto del tessuto dalla sala operatoria alla struttura coltura cellulare).
7. Mantenere i campioni in ghiaccio (4 ° C), mentre si prepara per il prossimo passo. Preparazione dei materiali e di coltura cellulare camera richiede 10-20 min.

2. Preparazione degli strumenti, Cultura Media e Cultura Inserti

Nota: Tutte le procedure vengono eseguite a temperatura ambiente salvo diversa indicazione.

1. Preparare 500 ml di DMEM supplementato con 10% FCS e 1% (P / S) e filtro sterilize. Preriscaldare il mezzo a 37 ° C.
2. Forcipe Autoclave, un paio di forbici Mayo curve lama (150-170 mm di lunghezza) e un paio di forbici Metzenbaum e conservare in un contenitore sterile.
3. Sotto flusso laminare, aprire un 12-pozzetti cultura sterile. Inserire un inserto cultura (0,45 micron dimensioni dei pori, diametro 12 mm) in ciascun pozzetto della piastra 12 pozzetti (Figura 1B, pannello inferiore).
4. Riempire la piastra 12 pozzetti con 600 ml di preriscaldata (37 ° C) Mezzi di coltura pipettando su e così non direttamente sulla membrana dell'inserto. Posizionare la piastra nel incubatore (37 ° C, 5% CO ₂₎ (Figura 1B, pannello superiore).
   1. In alternativa, utilizzare un 24-pozzetti e aggiungere 300 ml di media per pozzetto. Il volume di terreno per pozzetto è ottimale quando uno strato del menisco viene formato tra il liquido e la parte inferiore dell'inserto membrana.
      Nota: il supporto al fondo del pozzo diffonde attraverso la membr nitrocellulosaane formare lo strato menisco come illustrato negli schemi di figura 1B (pannello inferiore).

3. Tissue Preparazione Impostazione ed Ex Vivo Tissue Culture

Nota: Tutte le procedure vengono eseguite a temperatura ambiente salvo diversa indicazione.

1. Trasferire la parte del nodulo del cavo dal tubo 50 ml su un piatto da 100 millimetri Petri e aggiungere 10 ml di preriscaldata (37 ° C) di media. Assicurarsi che il tessuto è a contatto con il liquido durante l'intera procedura.
   1. Rimuovere lo strato di grasso perinodulare usando le forbici Metzenbaum. Eliminare il tessuto adiposo. Con l'uso di pinze e forbici curve pale, tagliare trasversalmente il tessuto in pezzi più piccoli (spessore massimo di 200 micron).
2. Trasferire la piastra 12 pozzetti dal termostato nella cappa laminare. Verificare che la membrana dell'inserto ha trasformato trasparente (umido) e quindi è in contatto con il fluido.
3. Utilizzando pinzeSollevare con attenzione una parte di tessuto toccando lo strato esterno (non applicare la tensione sul tessuto). Inserire una parte del tessuto sulla membrana dell'inserto coltura cellulare in modo che il tessuto rimanga in interfase aria medio. Culture un massimo di due parti di tessuto sullo stesso inserto / pozzetto.
4. Assicurarsi che il tessuto è posto sulla membrana piatta, a contatto con il mezzo longitudinale tale che il tessuto non galleggia la membrana non sia completamente coperta dal mezzo. Evitare bolle d'aria.
   Nota: A questo punto, è possibile aggiungere fattori di crescita o inibitori di interesse ai media; per esempio, composti di prova (A, B, C, D, E) in replicati e / o in curva concentrazione. Includere almeno 2 di controllo (non trattati) pezzi di tessuto in condizioni di crescita normali, per assicurare che l'esperimento è stato impostato correttamente. Incubare tessuti per 3-7 giorni in un tessuto culturale incubatore.
5. Infettare il tessuto sia con costrutto lentivirale o adenoviral se sovraespressione o abbattere experiments di un bisogno gene di interesse da eseguire (Figura 2). Trasferire una parte di tessuto da 12-pozzetti in un piatto 35 millimetri con pinze.
   1. Utilizzare un volume massimo di 10 ml di elevata virus titolo.
   2. Eseguire l'iniezione sotto un microscopio di dissezione con una siringa da insulina caricata con 50 microlitri di PBS contenente 10 ml di virus selezionato. Inserire l'ago perpendicolare al centro del tessuto.
   3. Lentamente iniettare il contenuto della siringa. Non ritrarre direttamente l'ago. Quando pungere il tessuto, non lasciare passare l'ago attraverso l'altro lato, ma mantenere l'ago all'interno del tessuto stesso (intorno al centro del tessuto).
   4. Trasferire il tessuto di nuovo nel 12-pozzetti, chiudere la piastra di coltura e metterlo in incubatrice (37 ° C, 5% CO _2).

4. Whole-mount immunofluorescenza colorazione e la ricostruzione 3D

Nota: Tutti i proprocedure vengono eseguite a temperatura ambiente salvo diversa indicazione. Il protocollo per l'intero immunostaining montaggio e l'imaging di seguito descritto è un adattamento da metodi precedentemente riportati utilizzati per altri tessuti ^16-19. Buffer e materiali sono descritti nella tabella 1 e List materiali.

1. Trasferimento tessuti dalla piastra di coltura a 2 ml microprovette contenenti PBS. Lavare 2x per 5 min in soluzione di PBS su una piattaforma rotante. Fissare tessuti in 4% PFA tamponata (1,5 ml di soluzione per tessuti in 2 ml provette da microcentrifuga), O / N a 4 ° C su una piattaforma rotante.
2. Rimuovere PFA e lavare 3x in PBS per 5 minuti ciascuno.
3. Disidratare tessuti mediante immersione in una soluzione di metanolo al 25% per 2 ore a temperatura ambiente su una piattaforma rotante. Aumentare la percentuale metanolo gradualmente (50%, 75%, 100%) con i tessuti immersi in ciascuna soluzione per 2 ore a temperatura ambiente su una piattaforma rotante.
4. Tessuti di trasferimento in DMSO / soluzione di metanolo (permeabilizzazione step) per 3 settimane a 4 ° C,come descritto in precedenza ^18.
   Nota: In questa fase, i tessuti possono essere conservati a lungo termine in metanolo 100% a -20 ° C.
5. Procedere con la procedura di colorazione ^{16, 17;} gradualmente reidratare tessuti (75% -50% -25% -0% serie metanolo). Eseguire ogni fase di reidratazione per 2 ore a temperatura ambiente o O / N a 4 ° C, sotto costante agitazione.
6. Incubare campioni con anticorpi primari in PBS contenente 1% di albumina sierica bovina (BSA) e 20% DMSO O / N a 4 ° C. Usare gli anticorpi ai seguenti rapporti con le scorte commerciali di PBS: anti-α actina muscolo liscio (1: 500, mouse), di tipo anti-collagene I (1: 500, di capra), anti-collagene di tipo III (1: 500, capra).
7. Lavare estesamente in PBS per 48 ore a 4 ° C (soluzione PBS cambiamento 3 a 4 volte).
8. Diluire appropriati anticorpi secondari (Alexa 555 anti-topo, Alexa 488 anti-capra) a 1: 250 di diluizione in PBS contenente 1% (BSA) e il 20% DMSO. Incubare O / N a 4 ° C.
9. Lavare estesamente in PBS per 48 ore a 476; C e incubare con contrasto nucleare, TO-PRO-3 diluito 1: 500 in PBS alla fase di lavaggio finale.
   Nota: TO-PRO-3 è un colorante DNA emettono lontano-rosso (con una linea laser 633 nm He-Ne) ed è abbinato per l'imaging simultaneo con altri canali; in questo tipo di tipo caso collagene I / collagene III (488 nm), α actina muscolo liscio (555 nm), TO-PRO-3 (647 nm).
10. Trasferire i tessuti ad una serie di metanolo (25% -50% -75%) a disidratare lentamente il tessuto; effettuare ogni passo di disidratazione per 2 ore a temperatura ambiente o O / N a 4 ° C sotto costante agitazione.
    1. Tessuti di trasferimento in tubi di polipropilene. Tessuti chiari in metilsalicilato (maniglia sotto cappa chimica) ¹⁸ o come uso alternativo soluzione BABB ^19. Incubare a RT sotto costante agitazione fino a quando i tessuti diventano trasparenti. Mount tra una diapositiva e un copri sigillato con set dura mezzo di montaggio (Figura 1C, pannello superiore).
11. Campioni un'immagine su un micro confocale invertitaambito dotato di alta NA 63X e / o gli obiettivi immersione olio 100X (Figura 1C).
    1. Pulire l'obiettivo con la soluzione di pulizia fornito dal produttore del microscopio.
    2. Applicare una goccia di olio sulla lente dell'obiettivo. Posizionare il vetrino con il campione sul palco microscopio e concentrarsi sul campione.
12. Impostare le configurazioni del microscopio per l'imaging simultaneo di fluorescenza a tre canali con linee laser 488 nm, 514 nm e 633 nm.
13. Acquisire le immagini XY singoli o più immagini sul piano focale (Z pila) (Figura 3a). Utilizzare maggiore larghezza di Z stack per eseguire la ricostruzione in 3D. Per ottenere un'immagine ad alta risoluzione utilizzare bassa velocità di scansione, numero di scansioni medi (≥ 3) e di acquisire immagini a 16 bit di risoluzione 1.024 x 1.024 pixel.
14. Analizzare le immagini Z pila acquisite: prima rinominare e salvare il file immagine (xyz). Utilizzando il programma software del microscopio confocale, configurare un proge intensità massimaction delle immagini Z pila in un 3D ricostruito un'immagine.
    1. Selezionare il file xyz, in "Strumenti di processo", fare clic su sotto "Visualizzazione" e "Proiezione 3D". Inserire "Maximum" nel metodo di proiezione (o "media" se il segnale fluorescente è saturo). Per una singola proiezione non cambiano X, Y, Z e aerei, e applicare lo strumento di proiezione (Figura 3B, r1).
15. Utilizzare le immagini Z pila per creare una proiezione 3D con l'animazione (software confocale) per scopi di visualizzazione. Selezionare il file xyz, negli strumenti di processo, fare clic su sotto "Visualizzazione" e "Proiezione 3D".
    1. Clicca su "Crea Movie". Inserire l'angolo iniziale di rotazione in gradi (ad esempio, 0 ° come punto di partenza del film, l'asse Y) e clicca su "Set Start". Inserire l'angolo di rotazione in gradi End (asse Y) come punto finale del film (ad esempio, 180 ° o 3606; per una rotazione completa) e clicca su "Set End".
    2. Selezionare "Maximum" come metodo di proiezione (o "media" se il segnale fluorescente è saturo). Inserire il "numero di fotogrammi" per la rotazione della ricostruzione 3D (ad esempio, 20 rotazioni o superiore per ridurre la velocità di rotazione). Fare clic su "Applica". Esportare il filmato come file visivo (ad esempio, "avi") (Film supplementare 1) o l'esportazione in formato "tiff", che crea un file di immagine per ogni angolo di rotazione (Figura 3B, rotazione r4, r10, r18).

5. combinata seconda armonica Generation (collagene) e due fotoni fluorescenza Excited (elastina) Imaging su Ex Vivo Tissue durante Cultura

Nota: Tutte le procedure vengono eseguite a temperatura ambiente salvo diversa indicazione.

1. Rimuovere le piastre transwell da incubatore e posizionare un singolo (non fissata) tiparte SSUE in una piastra di coltura cellulare 35 mm avente 500 ml di mezzo.
2. Posizionare il tessuto in modo che l'asse lungo è piatto sulla piastra. Mantenere tessuto bagnato in ogni momento, tuttavia, non galleggiante.
3. Inserire obiettivo a immerso acqua del microscopio multifotone direttamente a contatto con il tessuto (Figura 1C).
4. Ottenere immagini con una lunghezza d'onda di eccitazione di 800 nm e raccogliere la luce emessa tra 371-425 nm (SHG, collagene) e 474-532 nm (autofluorescenza, elastina) (Figura 3C). Eseguire microscopia a due fotoni in un microscopio confocale verticale dotato di un laser a femtosecondi utilizzando un obiettivo ad immersione 20X acqua / 1.0 NA. Confocale Process stack con il software del produttore.
   Nota: eccitazione con un laser vicino infrarosso di molecole di collagene crea imaging ad alta contrasto delle strutture di collagene nativo a diverse profondità.

Risultati

Il metodo di ex vivo, 3D coltura del tessuto connettivo è un sistema di set up semplice e robusto per comprendere la relazione tra ECM e altri componenti cellulari che costituiscono il tessuto DD e potenzialmente altri tipi di fibrosi pure. Inoltre questo sistema permette un metodo affidabile per testare gli effetti dei composti sulla differenti tipi cellulari ei loro effetti sul carico fibrotica ^20.

I passi da raccolta di materiale chirurgico rifiuti derivati ​​da f...

Discussione

Le fasi più critiche di coltura ex vivo tessuto connettivo umano sono l'uso immediato del tessuto dopo la rimozione chirurgica per garantire la redditività; il tessuto dovrebbe rimanere in soluzione salina media o in ogni momento; mantenere una cultura sterile; sezioni trasversali di tessuto devono avere spessore massimo di 200 micron; set up del sistema di coltura ex vivo è ottimale quando il tessuto è in contatto con il mezzo ma non completamente sommerso. Piano dovrebbe essere aggiunto solo ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium	Invitrogen	11965-084
fetal calf serum (FCS)	Gibco		high glucose, heat inactivated
penicillin-streptomycin	Invitrogen	15070-063
Cell culture inserts	Millicell	PIHA01250	0.45 μm pore size, 12 mm diameter
anti-collagen type I	Southern Biotech	1310-08
anti-α smooth muscle actin	Sigma	A2547
anti-collagen type III	Southern Biotech	1330-01
Alexa Fluor555 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)	Invitrogen	A-31570
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody	Invitrogen	A-11055
TOPRO-3	Invitrogen	T3605
methylsalicylate	Sigma	M6752
paraformaldehyde	Sigma	P6148
Tissue Tek OCT	Sakura	25608-930
Microsccope glass coverslips	Menzel-Glaser	BB024060A1	24 x 60 mm
Microscope SuperFrost slides	Menzel-Glaser	AA00000102E	76 x 26 mm
VECTASHIELD HardSet Mounting Medium	Vector laboratories	H-1400
Leica TCS SP5 II confocal microscope	Leica Microsystems		Argon-488, 514 nm and HeNe-633 nm laser lines
Zeiss 710 NLO upright confocal microscope	Jena, Germany		Equipped with femtosecond Spectra - Physics Deep See MP laser (Santa Clara, United States) using a Plan-Apochromat 20X/1.0 NA water-immersion objective.