Человек Дюпюитрена<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Культура по изучению Миофибробласты и внеклеточный матрикс взаимодействий

Резюме

Болезнь Дюпюитрена (ДД) является фибропролиферативных заболевание ладони. Здесь мы приводим протокол к культуре резекции образцов из DD в трехмерном (3D) системе культуры. Такая краткосрочная система культуры позволяет сохранение структуры 3D и молекулярные свойства фиброзной ткани.

Аннотация

Organ fibrosis or “scarring” is known to account for a high death toll due to the extensive amount of disorders and organs affected (from cirrhosis to cardiovascular diseases). There is no effective treatment and the in vitro tools available do not mimic the in vivo situation rendering the progress of the out of control wound healing process still enigmatic.

To date, 2D and 3D cultures of fibroblasts derived from DD patients are the main experimental models available. Primary cell cultures have many limitations; the fibroblasts derived from DD are altered by the culture conditions, lack cellular context and interactions, which are crucial for the development of fibrosis and weakly represent the derived tissue. Real-time PCR analysis of fibroblasts derived from control and DD samples show that little difference is detectable. 3D cultures of fibroblasts include addition of extracellular matrix that alters the native conditions of these cells.

As a way to characterize the fibrotic, proliferative properties of these resection specimens we have developed a 3D culture system, using intact human resections of the nodule part of the cord. The system is based on transwell plates with an attached nitrocellulose membrane that allows contact of the tissue with the medium but not with the plastic, thus, preventing the alteration of the tissue. No collagen gel or other extracellular matrix protein substrate is required. The tissue resection specimens maintain their viability and proliferative properties for 7 days. This is the first “organ” culture system that allows human resection specimens from DD patients to be grown ex vivo and functionally tested, recapitulating the in vivo situation.

Введение

Болезнь Дюпюитрена (DD), доброкачественная фибропролиферативных заболевание вызывает постоянное сгибание пальцев в связи с образованием узелков и шнуры в ладони. Хотя болезнь распространилась особенно высока среди кавказцев Северной Европы, основной генетический этиология этого заболевания остается неизвестной ^1. Основной характеристикой ДД избыточное производство внеклеточного матрикса (ECM) белков (например, коллагена), которые образуют жесткую волокнистую ткань, занимающий пространство между жилами и кожи ладони и пальцев, постоянно нарушая тонких движений от руки ^{2, 3.} рецидив болезни, говорит о внутренней генетические изменения в качестве причины фиброза ^{1, 4.} эффективное лечение может быть ориентирована непосредственно на неконтролируемые фиброзные механизмы на клеточном и молекулярном уровне.

Наша последняя работа на фиброз привело нас к развитиюНовая система культуры 3D, что позволяет краткосрочный культуру человека фиброзной ткани с потенциалом тестирования на наркотики. Эта система помогла преодолеть предельный подход 2D фибробластов культур и определить роль частичного вниз регулирования, достигнутый пропуска экзона, в пути активации TGF-beta в посредничестве фиброз ^5.

Мы разработали метод к культуре Экс Vivo человек резекция образцы от пациентов DD для изучения взаимодействия между миофибробластов и окружающей ECM ^{5, 6.} Исследование Д. соединительной ткани фиброза, а также другие фиброзные заболевания зависит от гистопатологический анализ Иссеченную хирургическое Образцы, изоляция фибробластов из ткани и создания первичных культур или процедур сортировки клеток. Эти подходы довольно статического, так как они не позволяют экзогенный манипулирование свойствами заболеваний или терапевтического вмешательства со стороны экспериментатора. Кроме того, первичный CELL культуры, как правило, адаптироваться к условиям культивирования и их свойства выражения гена по существу от ситуации в естественных условиях отличаются от всех прохода, даже во время ранних пассажах (среди проход 3 и 6) ^{7, 8.} Мы сумели сохранить отходов хирургического материала в Экс Vivo условия культивирования в течение периода времени, что позволяет изучение конкретного пациента характеристики и скрининга анти-фиброзных или противовоспалительных соединений наркотиков.

Система основана на нитроцеллюлозную мембрану, которая позволяет контакт ткани со средой, но не с пластика, таким образом, предотвращая изменение ткани при присоединении, как ранее наблюдали при культивировании DD фибробласты, а также другие типы клеток ^9. Нет коллагеновый гель или другой белок, ЕСМ подложки не требуется, так как сама по себе ДД ткани производит большое количество этих белков. Это выгодно для поддержания родного ECM микросреды и оборота грехаCE матричных субстратов являются важным регулятором архитектуры и функции ^{10, 11} ткани. Например, ECM белки, такие как фибронектин, ламинин и коллаген, могут влиять на передних и задних полярность фибробластов, как аналогично представленным на апикально-базальной полярности в эпителиальных клетках ^{12, 13} . поляризованных клетки имеют асимметричное распределение молекул внеклеточного который определяет миграцию клеток и экспрессию генов, например, α1β1 интегрин доступность на мембране влияет клеточную адгезию к типу коллагена ^14. С Основная цель этой 3D модели было сохранить родной микросреду, не использовался искусственный ECM подложке матрицы.

Вкратце: резекции образцы равной степени сократить в стерильной среде и помещали на nitrocellular мембран. Если лечение управляются с помощью инъекции требуется ткани вводят после того как они были размещены на мембране. Если лечение не требует быть введены с помощью Injотражения, то соединение добавляют к культуральной среде (модифицированной Игла среде Дульбекко (DMEM), с 1% фетальной телячьей сыворотки (FCS), 1% пенициллина-стрептомицина (P / S)). Культуры поддерживали в течение не более десяти суток, после чего ткань фиксировали в 4% параформальдегида (PFA), обработанного с помощью 30% раствора сахарозы, вложенной в октябре соединения и хранили при -80 ° С, как описано ранее ^5.

протокол

Этот протокол следует руководству LUMC и AMC Научно-технического комитета по этике человека.

1. Хирургические процедуры и тканей Коллекция

Примечание: Хотя различные методы хирургического иссечения контрактуры Дюпюитрена существует, ток золотой стандарт частичное fasciectomy ^15. Большинство пациентов лечатся в день хирургической клиники.

1. Выполните операцию под общей или местной анестезией в зависимости от предпочтений пациента и анестезиолог-х и сопутствующих заболеваний пациента. Эти соображения выходят за рамки данной статьи. До разрез, прикасаться к коже с помощью острого предмета, чтобы убедиться, что анестезия является удовлетворительным. Используйте жгут, чтобы облегчить хирургическую визуализацию в результате бескровного области.
2. После стерильной готовит и драпировки, выделить ожидаемую разрез с ручкой. Надрезать кожу скальпелем под лупой увеличении либо продольно оR с помощью зигзаг разрезы, чтобы предотвратить дополнительные контрактуры, а также для обеспечения достаточного воздействия.
3. Использование ножниц рассечение, освободить кожу и подкожный слой из основных договорных фасции Palmaris. Выявление и охрана сосудисто-нервный пучок пальца, потому что больной мозг может вытеснять его к средней линии. После фиброзной ткани (узелка и / или шнура) подчеркивается, вырезать его резко и региональном (субтотальная) с помощью скальпеля. Выполнение тщательного гемостаза под контролем жгута в конце процедуры, чтобы предотвратить образование гематомы.
4. Чтобы закрыть оболочку, использовать дополнительные Z-plasties, чтобы получить частичное удлинение кожи.
5. Для этих исследований используют только узелок часть фиброзного шнура, наиболее активной и клеточного звена заболевания. У хирурга выполнять макроскопические идентификации. Выделенные узлы в ладони часто предшественников или шнур, но вряд ли когда-либо резекции, так как они, как правило, не вызывают симптомов.Те, кого мы резекции были узелки, которые были частью мозга, указанного в контракте пальца. Определите эти узелки на жестком толстой части шнуров в handpalm (рис 1а).
6. После того, как хирург удаляет ткань, немедленно передать его с помощью стерильного пинцета в 50 мл пробирку, содержащую DMEM среде, дополненной 10% FCS и 1% (P / S). Держите ткани в течение максимум 2 часов в этой среде на коробке льду (4 o C) (например, транспортировка ткани из операционной, на объект для культивирования клеток).
7. Держите образцов на льду (4 ° С) при подготовке к следующему шагу. Подготовка материалов и в клеточной культуре камере требуется 10-20 мин.

2. Подготовка инструментов, культуральной среды и культуры вставками

Примечание: Все процедуры проводили при комнатной температуре, если специально не указано иное.

1. Приготовления 500 мл DMEM с добавлением 10% FCS и 1% (P / S) и фильтра сterilize. Prewarm среды на 37 ° С.
2. Автоклав щипцы, пара изогнутых лезвием ножниц Майо (150-170 мм в длину) и пара Metzenbaum ножницами и хранить в стерильный контейнер.
3. Под ламинарного потока, открыть стерильную культуральную пластину 12-а. Поместите одной культуры вставку (0,45 мкм размер пор, диаметр 12 мм) в каждую лунку 12-луночного планшета (Фиг.1В, нижняя панель).
4. Заполните 12-луночный планшет с 600 мкл предварительно нагретой (37 ° C) культуральной среды с помощью пипетки на лунку, а не непосредственно на мембрану вкладыша. Место пластины в инкубатор (37 ° C, 5% CO ₂₎ (Фигура 1В, верхняя панель).
   1. В качестве альтернативы, использовать 24-луночного планшета и добавить 300 мкл среды на лунку. Объем среды на лунку является оптимальным, когда мениск слой образован между жидкостью и нижней части мембраны вставки.
      Примечание: среда в нижней части скважины диффундирует через нитроцеллюлозный MembrЭНА формирования мениска слой, как показано на схемах фиг.1В (нижняя панель).

3. Ткань Setup Подготовка и Ex Vivo культуры ткани

Примечание: Все процедуры проводили при комнатной температуре, если специально не указано иное.

1. Трансфер узелок на кабеле от 50 мл трубку на блюдо 100 мм Петри и добавляют 10 мл предварительно нагретого (37 ° C) среды. Убедитесь, что ткань находится в контакте с жидкостью в течение всей процедуры.
   1. Снимите perinodular слой жира, используя ножницы Metzenbaum. Откажитесь от жировой ткани. При использовании щипцов и изогнутых лезвием ножниц, вырезать поперек ткани на более мелкие куски (максимальная толщина 200 мкм).
2. Передача пластины 12-а из инкубатора в ламинарном шкафу. Убедитесь, что мембрана вставки получилось прозрачным (влажный) и, следовательно, находится в контакте со средой.
3. Использование щипцовосторожно поднимите тканевой часть, коснувшись наружный слой (не применять напряжение на ткани). Поместите один ткани часть на мембрану из клеточной культуры вставки, так что ткань остается в воздушной среды интерфазы. Культура максимум из двух частей ткани на той же вставки / лунку.
4. Убедитесь, что ткань не помещается ровно на мембране, в продольном контакте со средой таким образом, что ткани ни плавает от мембраны, ни полностью покрывается среды. Избегайте воздушных пузырьков.
   Примечание: На этом этапе можно добавить факторы роста или ингибиторы, представляющие интерес для средств массовой информации; Например, тестируемые соединения (A, B, C, D, E) в повторах и / или в кривой концентрации. Включите по крайней мере 2 управления (необработанные) кусочков ткани при нормальных условиях роста, чтобы гарантировать, что эксперимент был настроен должным образом. Инкубируйте ткани в течение 3-7 дней в инкубаторе тканевых культур.
5. Инфекция ткани либо лентивирусным или аденовирусной конструкции, если гиперэкспрессией или сбить еxperiments гена интересов, должны быть выполнены (рисунок 2). Передача ткани часть от пластины 12-а в 35 мм блюдо с помощью щипцов.
   1. Использование максимального объема 10 мкл высокой титра вируса.
   2. Выполнение инъекции под микроскопом рассечение с инсулиновый шприц с грузом 50 мкл PBS, содержащий 10 мкл выбранного вируса. Поместите иглу перпендикулярно к центру ткани.
   3. Медленно вводить содержимое шприца. Не убрать иглу непосредственно. При прокалывания ткани, не позволить пройти через иглу с другой стороны, но поддерживать иглу внутри самой ткани (вокруг центра ткани).
   4. Передача ткани обратно в пластине 12-а, закрыть культуральный планшет и поместите его в инкубатор (37 ° C, 5% CO _2).

4. Всего монтажа Иммунофлуоресценции Окрашивание и 3D реконструкции

Примечание: Все процедуры выполняются при комнатной температуре, если специально не указано иное. Протокол всей горе иммунным и визуализации, описанной ниже как адаптация от ранее описанного методов, используемых для других тканей ^16-19. Буферы и материалы описаны в таблице 1 и список материалов.

1. Передача ткани из культуральной пластины к 2 мл микроцентрифужных пробирках, содержащих PBS. Промыть 2x в течение 5 мин в PBS раствора на поворотной платформе. Исправить ткани в 4% буферный PFA (1,5 мл раствора на ткани в 2 мл микроцентрифужных пробирках), O / N при 4 ° С на вращающейся платформе.
2. Удалить PFA и мыть 3 раза в PBS в течение 5 минут каждый.
3. Высушить ткани путем погружения в 25% -ном растворе метанола в течение 2 ч при комнатной температуре на поворотной платформе. Увеличение процентного метанола постепенно (в 50%, 75%, 100%) с тканей, погруженных в каждый раствор в течение 2 ч при комнатной температуре на поворотной платформе.
4. Передача ткани в ДМСО / метанол Раствор (пермеабилизации этапе) в течение 3 недель при 4 ° С,как описано выше ^18.
   Примечание: На этом этапе, ткани могут быть сохранены на долгий срок в 100% метаноле при -20 ° С.
5. Продолжайте Процедура окраски ^{16, 17;} постепенно увлажняет ткани (75% -50% -25% -0% серии метанол). Выполнение каждой стадии регидратации в течение 2 ч при комнатной температуре или O / N при 4 ° С при постоянном перемешивании.
6. Инкубируйте образцы с первичными антителами в PBS, содержащим 1% бычьего сывороточного альбумина (BSA) и 20% ДМСО O / N при 4 ° С. Использование антител в следующих соотношениях с использованием коммерческих запасов в PBS: анти-α актин гладких мышц (1: 500, мышь), анти-коллагена типа I (1: 500, козы), анти-коллаген типа III (1: 500, коза).
7. Промыть широко в PBS в течение 48 ч при температуре 4 ° С (изменение раствора PBS, от 3 до 4 раз).
8. Развести соответствующие вторичные антитела (Alexa 555 анти-мыши, Alexa 488 анти-козел) в соотношении 1: 250 разбавление в PBS, содержащем 1% (BSA) и 20% ДМСО. Инкубируйте O / N при 4 ° С.
9. Промыть широко в PBS в течение 48 ч при 476; С и ​​инкубировали с ядерным контрастирующая, К-PRO-3 разводили 1: 500 в PBS на конечной стадии промывки.
   Примечание: TO-PRO-3 дальней красной излучающих краситель ДНК (с He-Ne 633 нм лазерной линии) и в сочетании для одновременного изображений с других каналов; в этом случае коллагена типа I / коллагена типа III (488 нм), α актин гладких мышц (555 нм), к-PRO-3 (647 нм).
10. Передача ткани в серии метанол (25% -50% -75%) медленно обезвоживают ткани; выполнять каждый шаг дегидратации в течение 2 ч при комнатной температуре или O / N при 4 ° С при постоянном перемешивании.
    1. Передача ткани в полипропиленовых трубах. Очистить ткани в метилсалицилат (ручка при химическом капотом) ¹⁸ или в качестве альтернативы использованию раствора Бабб ^19. Выдержите при комнатной температуре при постоянном перемешивании до тех пор, ткани не станут прозрачными. Устанавливается между горкой и покровного герметичного с жестким монтажный комплект среде (рис 1С, верхняя панель).
11. Образцы изображение на перевернутой конфокальной микроСфера оснащен высокой Н.А. 63x и / или 100x целей масло погружения (Рисунок 1С).
    1. Очистите объектив с чистящим раствором, предоставленной производителем микроскопа.
    2. Нанесите один каплю масла на линзу объектива. Поместите слайд с образца на столике микроскопа и сосредоточиться на образце.
12. Установите конфигураций на микроскопе для одновременного визуализации флуоресценции трехканальной с лазерных линий 488 нм, 514 нм и 633 нм.
13. Приобретать отдельные изображения XY или несколько фокальной плоскости изображения (Z стека) (рис 3а). Используйте повышенную ширину Z стека для выполнения 3D-реконструкция. Для получения изображения с высоким разрешением использовать низкую скорость сканирования, количество средних сканирования (≥ 3), и получать 16-битные изображения разрешения 1024 х 1024 пикселей.
14. Проанализируйте Z стек полученные изображения: сначала переименовать и сохранить файл изображения (XYZ). Использование программного обеспечения в конфокальной микроскопии, настроить максимальное PROJE интенсивностиие образов Z стека в 3D восстановленного изображения.
    1. Выберите файл XYZ, в «процесс Сервис", нажать на кнопку под "Визуализация" и "3D-проекции". Ввод "Максимум" в способе проекции (или "Средний", если флуоресцентный сигнал насыщенный). Для всего одна проекция не меняют X, Y и Z. самолетов, а также применять проекцию инструмент (рис 3B, r1).
15. Используйте изображений Z стека для создания 3D-проекцию с анимацией (конфокальной программного обеспечения) для целей обзора. Выберите файл XYZ в процессе Tools, нажмите в разделе "Визуализация" и "3D-проекции".
    1. Нажмите на кнопку "Создать фильм". Введите начальный угол поворота в градусах (например, 0 °, как отправной точки фильма, Y оси) и нажмите на кнопку "Set Start". Введите конечный угол поворота в градусах (по оси Y) как конечной точки фильма (например, 180 ° или 3606; для полного вращения) и нажмите на кнопку "Установить End".
    2. Выбрать "Максимум" в качестве способа проекции (или "Средний", если флуоресцентный сигнал насыщенный). Введите "количество кадров" для вращения реконструкции 3D (например, 20 оборотов или выше, чтобы снизить скорость вращения). Нажмите на кнопку "Применить". Экспорт фильма в визуальном файла (например, "AVI") (Дополнительный Фильм 1) или экспортировать в "TIFF", то файл, который создает файл изображения для каждого угла поворота (рис 3B; вращение R4, R10, R18).

5. Комбинированный Генерация второй гармоники (коллаген) и Двухфотонное Возбужденные флуоресценции (эластин) изображений на Ex Vivo ткани во время культуры

Примечание: Все процедуры проводили при комнатной температуре, если специально не указано иное.

1. Удалить Transwell пластины из инкубатора и место одного (незакрепленный) TiСГУП часть в 35 мм культуры клеток пластину, содержащую 500 мкл среды.
2. Расположите ткань так, чтобы длинная ось является квартира на тарелку. Держите ткани во влажном состоянии Однако, не плывет.
3. Поместите воды, погружают цели многофотонной микроскопа в непосредственном контакте с тканью (рис 1С).
4. Получение изображений с длиной волны возбуждения 800 нм и собирают свет, излучаемый от 371-425 нм (ГСП, коллаген) и 474-532 нм (автофлуоресцентной, эластин) (рис 3C). Выполнение двухфотонного микроскопии в вертикальном конфокальной микроскопии, оснащенной фемтосекундного лазера с использованием 20X / NA 1,0 водно-иммерсионный объектив. Процесс конфокальной стеки с программным обеспечением производителя.
   Примечание: Возбуждение с ближней инфракрасной лазерной молекул коллагена создает высокую контрастность изображений родных коллагеновых структур в различных глубинах.

Результаты

Метод экс естественных условиях, 3D культура соединительной ткани простое и надежное система, устанавливаемая понять отношение между ECM и других клеточных компонентов, составляющих DD ткани и потенциально других типов фиброза, а также. Кроме того эта система позволяет надежный спо?...

Обсуждение

Наиболее важные шаги культивирования Экс Vivo человеческой соединительной ткани немедленное использование ткани после хирургического удаления обеспечения жизнеспособности; Ткань должна оставаться в среднесрочной или физиологического раствора во все времена; поддерживать стер?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium	Invitrogen	11965-084
fetal calf serum (FCS)	Gibco		high glucose, heat inactivated
penicillin-streptomycin	Invitrogen	15070-063
Cell culture inserts	Millicell	PIHA01250	0.45 μm pore size, 12 mm diameter
anti-collagen type I	Southern Biotech	1310-08
anti-α smooth muscle actin	Sigma	A2547
anti-collagen type III	Southern Biotech	1330-01
Alexa Fluor555 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)	Invitrogen	A-31570
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody	Invitrogen	A-11055
TOPRO-3	Invitrogen	T3605
methylsalicylate	Sigma	M6752
paraformaldehyde	Sigma	P6148
Tissue Tek OCT	Sakura	25608-930
Microsccope glass coverslips	Menzel-Glaser	BB024060A1	24 x 60 mm
Microscope SuperFrost slides	Menzel-Glaser	AA00000102E	76 x 26 mm
VECTASHIELD HardSet Mounting Medium	Vector laboratories	H-1400
Leica TCS SP5 II confocal microscope	Leica Microsystems		Argon-488, 514 nm and HeNe-633 nm laser lines
Zeiss 710 NLO upright confocal microscope	Jena, Germany		Equipped with femtosecond Spectra - Physics Deep See MP laser (Santa Clara, United States) using a Plan-Apochromat 20X/1.0 NA water-immersion objective.