人間デュピュイトラン<em&gt;エクスビボ</em筋線維芽細胞と細胞外マトリックス相互作用の研究のために&gt;文化

要約

デュピュイトラン病（DD）は、手のひらの線維増殖性疾患である。ここでは、三次元（3D）培養系においてDDから培養切除標本のプロトコルを提示する。このような短期培養系は、3次元構造の保存および線維性組織の分子特性を可能にする。

要約

Organ fibrosis or “scarring” is known to account for a high death toll due to the extensive amount of disorders and organs affected (from cirrhosis to cardiovascular diseases). There is no effective treatment and the in vitro tools available do not mimic the in vivo situation rendering the progress of the out of control wound healing process still enigmatic.

To date, 2D and 3D cultures of fibroblasts derived from DD patients are the main experimental models available. Primary cell cultures have many limitations; the fibroblasts derived from DD are altered by the culture conditions, lack cellular context and interactions, which are crucial for the development of fibrosis and weakly represent the derived tissue. Real-time PCR analysis of fibroblasts derived from control and DD samples show that little difference is detectable. 3D cultures of fibroblasts include addition of extracellular matrix that alters the native conditions of these cells.

As a way to characterize the fibrotic, proliferative properties of these resection specimens we have developed a 3D culture system, using intact human resections of the nodule part of the cord. The system is based on transwell plates with an attached nitrocellulose membrane that allows contact of the tissue with the medium but not with the plastic, thus, preventing the alteration of the tissue. No collagen gel or other extracellular matrix protein substrate is required. The tissue resection specimens maintain their viability and proliferative properties for 7 days. This is the first “organ” culture system that allows human resection specimens from DD patients to be grown ex vivo and functionally tested, recapitulating the in vivo situation.

概要

デュピュイトラン病（DD）、良性の線維増殖性疾患が原因の手のひらの上で結節及びコードの形成に指の永久的な屈曲を引き起こす。病気の広がりは、北欧の白人の中でも特に高いが、疾患の根底にある遺伝的病因は^、1不明のまま。 DDの主な特徴は、恒久的に細かい動きを破壊し、腱や手のひらの皮膚と指の間のスペースを占有しているタフな繊維組織を形成する細胞外マトリックス（ECM）タンパク質（ 例えば、コラーゲン）の過剰生産である手²の^、3。疾患の再発が線維^1,4の原因として、基礎となる遺伝的変化を示唆している。有効な治療は、細胞および分子レベルで直接制御できない線維性のメカニズムを標的とすることができる。

線維症に関する我々の最近の研究は、の開発に私たちをリードしてきました新規な薬物検査の潜在的なヒト線維性組織の短期培養を可能にする三次元培養系。このシステムは、2D線維芽細胞培養の制限アプローチを克服し、線維症^5の仲介にTGFβ経路活性化のエクソンスキッピングによって達成部分的なダウンレギュレーションの役割を、定義するために貢献してきました。

私たちは、筋線維芽細胞と周囲のECM ^5、6の間の相互作用を研究するために培養したDD患者からex vivoでの人間の切除標本の方法を開発した。DD結合組織線維化の研究だけでなく、他の線維性の疾患は、切除した外科の病理組織学的分析に依存している標本、組織及び初代培養または細胞選別手順の確立からの線維芽細胞を単離する。彼らは実験者による病気の性質または治療的介入の外因性の操作を許可しないので、これらのアプローチは非常に静的です。加えて、一次のceLL培養は、培養条件に適応する傾向があり、それらの遺伝子発現特性にも早期の継代（継代3間および^6）7、8の間に、すべての通過時の生体内の状況から本質的に異なっている。私たちは、廃棄物の外科的材料を維持するために管理している患者特有の特性の研究及び抗線維症または抗炎症性薬剤化合物のスクリーニングを可能にする期間のex vivoでの培養条件。

システムは、DD線維芽細胞ならびに他の細胞型^9を培養する際に、以前に観察されたように、取り付けの際に組織の変質を防止するため、プラスチックを含む培地と組織の接触を可能にするではなく、ニトロセルロース膜に基づいている。 DD組織自体は、これらのタンパク質を大量に生成するのでないコラーゲンゲルまたは他のECMタンパク質基質は、必要とされない。これは、ネイティブのECM微小環境と売上高の罪の維持のために有利であるCEのマトリックス基質は組織構造および機能^10、11の重要な調節因子である。例えば、フィブロネクチン、ラミニンおよびコラーゲンなどのECMタンパク質は、のように、同様の上皮細胞¹²に頂端-基底極性のために示された線維芽細胞の前後極性^、13に影響^を与える可能性。極性細胞は、細胞の移動および遺伝子発現、 例えば、膜上のα1β1インテグリンのアクセシビリティは、私が¹⁴型^{コラーゲン}への細胞接着に影響を与えるを決める外分子の非対称な分布を有する。この3Dモデルの主な目標は、天然の微小環境を維持することであったため、人工ECMマトリクス基板は使用しなかった。

簡単に言えば：切除標本を均等に無菌環境で切断され、nitrocellularメンブレン上に置いた。注射による投与の治療が必要とされる場合、それらは、膜上に配置された後に組織が注入される。治療は、INJを経由して投与するために必要としない場合ection次に、化合物（1％ウシ胎児血清（FCS）、1％ペニシリン - ストレプトマイシン（P / S）を、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM））を培養培地に添加される。以前⁵に記載^のように培養物を、30％ショ糖溶液を介して処理組織を4％パラホルムアルデヒド（PFA）で固定した後10日目の最大、OCTコンパウンドに包埋し、-80℃で保存のために維持される。

プロトコル

このプロトコルは、人間の研究倫理委員会のLUMCとAMCガイドラインに従っています。

1.手術手順及び組織収集

注：デュピュイトラン拘縮の外科的切除のための様々な技術が存在するが、現在のゴールドスタンダードは、部分的な筋膜切除術¹⁵です。ほとんどの患者は、一日手術クリニックで治療されている。

1. 患者と麻酔専門医の好みにし、患者の合併症による一般的または局所麻酔下に手術を行う。これらの考慮事項は本稿の範囲を超えています。切開の前に、麻酔が十分であることを確認するために、鋭利なもので皮膚に触れる。無血分野における外科的可視化を容易にするために、止血帯を使用してください。
2. 無菌プレッピングとドレーピングした後、ペンで予想される切開をマークします。どちらか縦方向にOルーペ倍率の下で、メスで皮膚を切開するrのさらなる拘縮を防止するために、ジグザグ切開を使用しても十分な露光を可能にする。
3. はさみ解剖を使用して、基礎となる契約筋膜の掌から皮膚と皮下層を解放。病気のコードは正中線に向かって変位させることができるので、指の神経血管束を特定し、保護する。線維性組織（結節および/またはコード）で概説された後、メスを用いて鋭くし、地域（小計）それを切り出す。血腫の形成を防ぐために、手順の最後に止血帯制御下細心の止血を行う。
4. 皮膚を閉じるには、皮膚の部分的な延長を得るために、追加のZ-plastiesを使用しています。
5. これらの研究のために線維性コードの唯一の結節部分、疾患の最も活発なと細胞の一部を使用しています。外科医は巨視的識別を行う必要があります。の手のひらの上で孤立した結節は、多くの場合、前駆体またはコードですが、彼らは通常、症状を引き起こさないようにほとんどない、切除されている。我々は切除ものは、契約指のコードの一部であった結節た。 handpalm（ 図1A）でコードのハード厚い部分によってこれらの結節を特定します。
6. 外科医は、組織を除去した後、直ちに、10％FCSおよび1％（P / S）を補充したDMEM培地を含む50mlチューブに滅菌ピンセットを使用して転送する。湿った氷（4℃）のボックスに、この培地中で2時間の最大のための組織を維持（ 例えば、細胞培養施設への操作室からの組織の輸送）。
7. 次のステップの準備をしながら、湿った氷（4℃）でサンプルを保管してください。材料および細胞培養室の調製は、10〜20分を要する。

楽器、培養培地と文化インサートの調製

注：特に記載のない限り、全ての手順を室温で実施される。

1. DMEM 500mlのを準備し、10％FCSおよび1％（P / S）を補充し、フィルタのterilize。 37℃でメディアをPrewarm。
2. オートクレーブ鉗子、湾曲した刃メイヨーはさみのペア（長さ150〜170ミリメートル）と滅菌容器内Metzenbaumのハサミや店舗。
3. 層流下、無菌の12ウェル培養プレートを開く。 12ウェルプレート（ 図1B、下パネル）の各ウェルに1つの培養インサート（孔径0.45μm、直径12mm）を配置します。
4. 挿入物の膜上に直接ウェル上にピペッティングにより予め温め（37℃）の培養培地600μlの12ウェルプレートを記入し、ではない。インキュベーターにプレートを置き（37℃、5％CO _2）（ 図1B、上パネル）。
   1. 代わりに、24ウェルプレートを使用し、ウェル当たり300μlの培地を追加。メニスカス層は、液体および膜インサートの下部との間に形成されたときにウェル当たり培地の体積は最適である。
      注：ウェルの底の媒体は、ニトロセルロースmembrを通って拡散図1B（下部パネル）のスキームに示すように、ANEメニスカス層を形成する。

3.組織の調製およびex vivo組織培養のセットアップ

注：特に記載のない限り、全ての手順を室温で実施される。

1. 100ミリメートルペトリ皿に50ミリリットルチューブからコードの結節部分を転送し、予め温め（37℃）培地10mlを追加します。組織は全体の手順の間に液体と接触していることを確認してください。
   1. Metzenbaumはさみを使ってperinodular脂肪層を削除します。脂肪組織を捨てる。鉗子と湾曲した刃ハサミを使用することで、横方向に小さな断片（200μmの最大厚さ）に組織を切断する。
2. 層流フードにインキュベーターから12ウェルプレートを転送します。挿入物の膜は（ウェット）透明になって、したがって、媒体と接触していることを確認してください。
3. 鉗子を使用して外層を（組織上の張力を適用しない）に触れることにより、組織の一部を慎重に持ち上げます。組織は、空気中間期に残るように細胞培養インサートのメンブレン上に1組織部分を配置します。文化/ウェル同じインサート上の2つの組織の部分の最大。
4. 組織は組織が膜をオフに浮くことも、完全に媒体によって覆われてもされていないような媒体と縦に接触して、メンブレン上に平らに置かれていることを確認します。空気の泡を避けてください。
   注：この段階では、成長因子またはメディアへの関心の阻害剤を添加することが可能である。例えば、反復および/または濃度曲線における試験化合物（A、B、C、D、E）。実験は適切に設定されていることを確実にするために、通常の成長条件下で組織の少なくとも2コントロール（未処理）の作品を含める。組織培養インキュベーターで3-7日間、組織をインキュベートする。
5. 過剰発現した場合、レンチウイルスまたはアデノウイルス構築のいずれかで組織に感染するか、電子をノックダウン実行される目的遺伝子の必要性（ 図2）のxperiments。鉗子を用いて35ミリメートル皿に12ウェルプレートから組織部分を転送します。
   1. 高力価ウイルスを10μlの最大音量を使用してください。
   2. 選択されたウイルスの10μlのを含む50μlのPBSでロードされたインスリン注射器で解剖顕微鏡下で注入を実行します。組織の中心に垂直に針を置きます。
   3. ゆっくりと注射器の内容を注入する。直接針を撤回しないでください。組織を穿刺すると、針が他の側を通って行くが、（組織の中心付近）組織自体の中に針を維持させてください。
   4. バック12ウェルプレートに組織を転送する培養プレートを閉じ、インキュベーター（37℃、5％CO _2）内に置きます。

4.ホールマウント免疫蛍光染色および三次元再構成

注：すべてのプロを特に明記しない限りceduresはRTで行う。後述の全体マウント免疫染色およびイメージングのためのプロトコルは、他の組織^16-19のために使用される以前に報告された方法から適応したものです。バッファおよび材料は、表1及び物質一覧に記載されている。

1. PBSを含む2ミリリットルマイクロ遠心チューブに培養プレートからの転送組織。回転プラットフォーム上のPBS溶液中で5分間洗浄2倍。回転プラットフォーム上のPFA（2 mlのマイクロチューブ内の組織あたり1.5ミリリットル溶液）バッファリングされた4％で、O / N、4℃で組織を固定してください。
2. PFAを除去し、5分間ずつPBSで3回洗う。
3. 回転プラットフォーム上で室温で2時間、25％メタノール溶液中に浸漬することにより組織を脱水する。回転プラットフォーム上で室温で2時間、各ソリューションに浸さ組織と徐々にメタノールの割合（50％、75％、100％）を増やします。
4. 、4℃で3週間、DMSO /メタノール溶液（透過化工程）における組織を転送するとして以前に¹⁸に説明。
   注：この段階では、組織を-20℃で100％メタノール中で長期間保存することができる。
5. 染色手順^16、17に進みます。徐々に組織（75％-50％-25％-0％メタノールシリーズ）を再水和する。一定の撹拌の下、4℃でRTまたはO / Nで2時間ごとに再水和ステップを実行します。
6. 4℃で1％ウシ血清アルブミン（BSA）および20％DMSO O / Nを含有するPBS中で一次抗体とサンプルをインキュベートする。抗α平滑筋アクチン：PBS商用銘柄を使用して、次の割合で抗体を使用する（1：500、マウス）、抗コラーゲンタイプI（1：500、ヤギ）、抗コラーゲンタイプIII（1：500、ヤギ）。
7. 4℃（変更PBS溶液3〜4回）で48時間、PBSで広範囲に洗浄します。
8. 1で適切な二次抗体（アレクサ555抗マウスアレクサ488抗ヤギ）を希釈する：1％（BSA）および20％DMSOを含有するPBS中で250希釈。 4℃でO / Nインキュベートします。
9. 4で48時間、PBS中で広範囲に洗ってください最後の洗浄工程でPBS中に1：500; 76 CおよびTO-PRO-3、核対比でインキュベート1に希釈した。
   注：TO-PRO-3（ヘリウムネオン633nmのレーザー線を使用）遠赤色蛍光DNA色素であり、他のチャンネルとの同時イメージングのために組み合わされる。この場合、I型コラーゲン/ III型コラーゲン（488 nm）を、α平滑筋アクチン（555 nm）の中で、TO-PRO-3（647ナノメートル）。
10. ゆっくりと組織を脱水メタノールシリーズ（25％-50％-75％）に組織を移す。一定の攪拌下、4℃でRTまたはO / Nで2時間毎に脱水工程を行う。
    1. ポリプロピレンチューブ中に組織を転送します。サリチル酸メチルでクリア組織（化学フードの下ハンドル^）18または代替使用BABB液¹⁹として。組織が透明になるまで、一定の攪拌下、室温でインキュベートする。マウントスライドとハードセット封入（ 図1C、上部パネル）で密閉カバーガラスの間に。
11. 倒立共焦点マイクロ上の画像サンプル高NA 63Xおよび/ ​​または100倍油浸対物レンズ（ 図1C）を備えたスコープ。
    1. 顕微鏡メーカーが提供する洗浄液でレンズを清掃してください。
    2. 対物レンズ上の油の一滴を適用します。顕微鏡ステージ上の標本でスライドを置き、サンプルに焦点を当てる。
12. レーザーライン488 nmの、514 nmおよび633 nmの持つ3つのチャンネルの蛍光の同時イメージングのための顕微鏡の構成を設定します。
13. 単一XY画像又は複数の焦点面画像（Zスタック）（ 図3A）を取得する。 3D再構成を実行するためのZスタックの増加幅を使用してください。高解像度の画像を得るために、平均スキャン（≥3）の数を低い走査速度を使用し、1,024×1024ピクセルの解像度の16ビットの画像を取得する。
14. Zスタック取得した画像を分析します：最初の画像ファイル（XYZ）の名前を変更して保存します。共焦点顕微鏡のソフトウェアプログラムを使用して、最大強度projeを構成3D再構成画像にZスタック画像のction。
    1. 「プロセスツール」で、XYZファイルを選択し、「可視化」と「3Dプロジェクション」の下をクリックします。 （蛍光シグナルが飽和している場合、または「平均」）投影方法で「最大」と入力します。単一の投影のためにX、Y、およびZ平面を変更し、投影ツール（ 図3Bにおいて、r1）を適用しない。
15. 目的を表示するためのアニメーション（共焦点ソフトウェア）で3Dプロジェクションを作成するために、Zスタック画像を使用してください。プロセスツールで、XYZファイルを選択し、「可視化」と「3Dプロジェクション」の下をクリックします。
    1. 「ムービーの作成」をクリックします。度でスタート回転角度を入力します（ 例えば 、映画の出発点として、0°、Y軸）と「セットスタート」をクリックしてください。ムービー（ 例えば、180°または360の終点と度数で終了回転角度（Y軸）を入力する6;完全な回転のため）と "セット終了」をクリックしてください。
    2. 投影方法として「最大」（または「平均」蛍光シグナルが飽和している場合）を選択する。 3D再構成の回転のための「フレーム数」（回転数を削減するなど、20回転以上）を入力します。 「適用」をクリックします。各回転角度（;回転R4、R10、R18 図3B）用のイメージファイルを作成し、「TIFF」ファイルなどのビジュアルファイル（ 例えば、「aviファイル」）（補足作品1）またはエクスポートなどのムービーを書き出す。

5.コンバインド第二高調波発生（コラーゲン）および培養中のエクスビボ組織上の二光子励起蛍光（エラスチン）イメージング

注：特に記載のない限り、全ての手順を室温で実施される。

1. TI（未確定）インキュベーターからトランスウェルプレートを取り外し、シングルを配置培地500μlを含む35ミリメートル細胞培養プレートでssue一部。
2. 長軸がプレートの上に平らになるように組織を配置します。しかし、常に濡れていない浮動組織を保管してください。
3. 組織（ 図1C）と直接接触して多光子顕微鏡の水浸対物レンズを配置します。
4. 800nm ​​の励起波長で画像を取得し、371から425ナノメートル（SHG、コラーゲン）および474から532ナノメートル（自己蛍光、エラスチン）（図3C）の間に放出された光を集める。 20X / 1.0 NA水浸対物レンズを用いてフェムト秒レーザーを備えた直立共焦点顕微鏡において、二光子顕微鏡法を行う。プロセスの共焦点は、製造業者のソフトウェアとスタックします。
   注：コラーゲン分子の近赤外レーザーによる励起は、異なる深さで天然コラーゲン構造の高コン​​トラスト画像を作成する。

結果

エキソビボの方法は、結合組織の三次元培養は、同様にECMとDDの組織を構成する他の細胞成分および線維症の潜在的に他の種類との関係を理解するための簡単かつ堅牢なアップ方式である。さらにこのシステムは、異なる細胞型および線維性負荷²⁰への影響に対する化合物の効果を試験するための信頼性の高い方法を可能にする。

デュピュイトラン線維症?...

ディスカッション

ex vivoでの人間の結合組織を培養する最も重要なステップは実行可能性を確保するための外科的除去後の組織の直接の使用である。組織は常に培地または生理食塩溶液中に留まるべきである。無菌培養を維持する。組織の横断切片は、最大200μmの厚さを有するべきである。組織培地と接触しているが、完全に浸水しないときのex vivo培養系でセットアップすることが最適である。?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium	Invitrogen	11965-084
fetal calf serum (FCS)	Gibco		high glucose, heat inactivated
penicillin-streptomycin	Invitrogen	15070-063
Cell culture inserts	Millicell	PIHA01250	0.45 μm pore size, 12 mm diameter
anti-collagen type I	Southern Biotech	1310-08
anti-α smooth muscle actin	Sigma	A2547
anti-collagen type III	Southern Biotech	1330-01
Alexa Fluor555 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)	Invitrogen	A-31570
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody	Invitrogen	A-11055
TOPRO-3	Invitrogen	T3605
methylsalicylate	Sigma	M6752
paraformaldehyde	Sigma	P6148
Tissue Tek OCT	Sakura	25608-930
Microsccope glass coverslips	Menzel-Glaser	BB024060A1	24 x 60 mm
Microscope SuperFrost slides	Menzel-Glaser	AA00000102E	76 x 26 mm
VECTASHIELD HardSet Mounting Medium	Vector laboratories	H-1400
Leica TCS SP5 II confocal microscope	Leica Microsystems		Argon-488, 514 nm and HeNe-633 nm laser lines
Zeiss 710 NLO upright confocal microscope	Jena, Germany		Equipped with femtosecond Spectra - Physics Deep See MP laser (Santa Clara, United States) using a Plan-Apochromat 20X/1.0 NA water-immersion objective.