Menschen Dupuytren&#39;sche<em&gt; Ex vivo</em&gt; Kultur für das Studium der Myofibroblasten und extrazellulären Matrix-Interaktionen

Zusammenfassung

Morbus Dupuytren (DD) ist ein fibroproliferative Erkrankung der Handfläche der Hand. Hier stellen wir ein Protokoll zur Kultur Resektionsproben aus DD in einem dreidimensionalen (3D) Kultur-System. Solche Kurzzeitkultur-System ermöglicht die Erhaltung der 3D-Struktur und molekularen Eigenschaften des fibrotischen Gewebe.

Zusammenfassung

Organ fibrosis or “scarring” is known to account for a high death toll due to the extensive amount of disorders and organs affected (from cirrhosis to cardiovascular diseases). There is no effective treatment and the in vitro tools available do not mimic the in vivo situation rendering the progress of the out of control wound healing process still enigmatic.

To date, 2D and 3D cultures of fibroblasts derived from DD patients are the main experimental models available. Primary cell cultures have many limitations; the fibroblasts derived from DD are altered by the culture conditions, lack cellular context and interactions, which are crucial for the development of fibrosis and weakly represent the derived tissue. Real-time PCR analysis of fibroblasts derived from control and DD samples show that little difference is detectable. 3D cultures of fibroblasts include addition of extracellular matrix that alters the native conditions of these cells.

As a way to characterize the fibrotic, proliferative properties of these resection specimens we have developed a 3D culture system, using intact human resections of the nodule part of the cord. The system is based on transwell plates with an attached nitrocellulose membrane that allows contact of the tissue with the medium but not with the plastic, thus, preventing the alteration of the tissue. No collagen gel or other extracellular matrix protein substrate is required. The tissue resection specimens maintain their viability and proliferative properties for 7 days. This is the first “organ” culture system that allows human resection specimens from DD patients to be grown ex vivo and functionally tested, recapitulating the in vivo situation.

Einleitung

Dupuytren-Krankheit (DD), bewirkt eine gutartige fibroproliferative Krankheit Permanent Beugung der Finger aufgrund der Bildung von Knötchen und Leitungen in der Handfläche der Hand. Obwohl die Krankheit verbreitet ist besonders hoch bei Kaukasiern in Nordeuropa, die zugrunde liegenden genetischen Ursache der Erkrankung ist unbekannt ^1. Das Hauptmerkmal der DD ist die Überproduktion von extrazellulärer Matrix (ECM), Proteine ​​(zB Kollagen), die den Raum zwischen den Sehnen und Haut der Handfläche der Hand und der Finger besetzen eine harte Fasergewebe zu bilden, die feinen Bewegungen dauerhaft gestört der Hand ^{2, 3.} Die Wiederauftreten der Krankheit schlägt zugrunde liegenden genetischen Veränderungen als Ursache der Fibrose ^{1, 4.} Eine wirksame Behandlung sein könnte, um direkt zielen auf die unkontrollierbare fibrotische Mechanismen auf zellulärer und molekularer Ebene.

Unsere jüngsten Arbeiten zur Fibrose hat uns zur Entwicklung einer LED-neuartigen 3D Kultursystem, das Kurzzeitkultur der menschlichen fibrotischen Gewebes, die das Potenzial von Drogentests ermöglicht. Dieses System hat dazu beigetragen, die einschränkender Versuch 2D Fibroblastenkulturen zu überwinden und eine Rolle zum teilweisen Abregulation durch Exon-Skipping erreicht, von TGFß Stoffwechselwegaktivierung der Vermittlung Fibrose ⁵ definieren.

Wir haben ein Verfahren zur ex vivo-Kultur menschlicher Resektionsproben aus DD-Patienten, die Wechselwirkung zwischen Myofibroblasten und der umgebenden ECM ^{5, 6} studieren entwickelt. Das Studium der DD Bindegewebe Fibrose sowie anderer fibrotischer Erkrankungen beruht auf histopathologische Analyse des ausgeschnittenen chirurgischen Proben, Isolation von Fibroblasten aus dem Gewebe und Etablierung von Primärkulturen oder Zellsortierverfahren. Diese Ansätze sind ziemlich statisch, da sie exogener Manipulation der Krankheit Eigenschaften oder therapeutischen Intervention vom Experimentator nicht zulassen. Außerdem primären cell Kulturen neigen dazu, zu den Kulturbedingungen anpassen und ihre Genexpression Eigenschaften unterscheiden sich im Wesentlichen aus der in vivo Situation bei jedem Durchgang, auch während der frühen Passagen (unter Durchgang 3 und 6) ^{7, 8.} Es ist uns gelungen, den Abfall chirurgisches Material in zu erhalten Ex-vivo-Kulturbedingungen für eine Zeitdauer, die Studie über die patientenspezifische Eigenschaften und das Screening von anti-fibrotische oder entzündungshemmende Medikament Verbindungen ermöglicht.

Das System wird auf eine Nitrocellulosemembran, die einen Kontakt des Gewebes mit dem Medium, jedoch nicht mit dem Kunststoff ermöglicht somit die Verhinderung der Veränderung des Gewebes bei der Befestigung, wie zuvor beobachtet, wenn die Kultivierung DD Fibroblasten sowie andere Zelltypen ⁹ basiert. Kein Kollagengel oder andere ECM-Protein Substrat erforderlich, da die DD Gewebe selbst produziert große Mengen dieser Proteine. Dies ist für die Erhaltung der nativen ECM-Mikroumgebung und Umsätze sin vorteilhaftce Matrix Substrate sind wichtiger Regulator der Gewebearchitektur und Funktion ^{10, 11.} Zum Beispiel ECM Proteine, wie Fibronectin, Laminin und Kollagen kann von vorne nach hinten Polarität Fibroblasten ähnlich für apikal-basal Polarität in Epithelzellen ^{12 gezeigt, 13} beeinflussen . polarisierte Zellen haben asymmetrische Verteilung der extrazellulären Moleküle, die Zellmigration und Genexpression, zB α1β1 Integrin Zugänglichkeit auf die Membran wirkt Zelladhäsion an Kollagen Typ I ¹⁴ bestimmt. Da ein Hauptziel dieses 3D-Modell war es, die einheimischen Mikroumgebung zu erhalten, wurde keine künstlichen ECM Matrixsubstrat verwendet.

Kurz: Resektion Proben sind gleichmäßig in einer sterilen Umgebung abgeschnitten und auf nitrocellular Membranen gelegt. Wenn die Behandlung mittels Injektion verabreicht wird benötigt das Gewebe injiziert werden, nachdem sie auf der Membran platziert. Wenn die Behandlung nicht benötigen, um über inj verwaltet werdenection dann wird die Verbindung zu dem Kulturmedium (Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) mit 1% fötalem Kälberserum (FCS), 1% Penicillin-Streptomycin (P / S)) zugefügt. Die Kulturen werden für höchstens zehn Tage nach dem das Gewebe in 4% Paraformaldehyd (PFA) fixiert, durch 30% Saccharose-Lösung verarbeitet werden, in OCT-Verbindung eingebettet und bei -80 ° C gelagert gehalten, wie zuvor beschrieben ^5.

Protokoll

Dieses Protokoll folgt den LUMC und AMC Richtlinien der menschlichen Forschung Ethik-Kommission.

1. Chirurgisches Verfahren und Gewebeentnahme

Hinweis: Obwohl verschiedene Techniken zur chirurgischen Entfernung der Morbus Dupuytren vorhanden sind, ist der derzeitige Goldstandard die Teil Fasziektomie ^15. Die meisten Patienten sind in der Tageschirurgie behandelt.

1. Führen Operation unter Vollnarkose nach Präferenzen des Patienten und Anästhesisten und Begleiterkrankungen des Patienten. Diese Überlegungen sind über den Rahmen dieses Dokuments. Vor dem Schnitt, berühren Sie die Haut mit einem scharfen Gegenstand, um zu überprüfen, dass der Anästhesie ist zufriedenstellend. Verwenden Sie ein Tourniquet auf chirurgische Visualisierungs in einem unblutigen Bereich zu erleichtern.
2. Nach Steril prepping und Drapierungen, markieren die erwarteten Schnitt mit einem Stift. Inzision der Haut mit einem Skalpell unter Lupenvergrößerung entweder längs or mit Zickzackeinschnitte zusätzliche Kontrakturen zu verhindern und auch um eine ausreichende Belichtung zu ermöglichen.
3. Mit Schere Dissektion, befreien die Haut und Unterhaut aus den zugrunde liegenden Vertrag Fascia palmaris. Identifizieren und schützen das Gefäßnervenbündel des Fingers, weil der kranke Kabel kann es in Richtung der Mittellinie zu verschieben. Sobald der fibrotischen Gewebes (Knötchen und / oder Kabel) wird dargelegt, auszuschneiden es scharf und regional (Wert) mit einem Skalpell. Führen Sie sorgfältige Blutstillung unter Blutsperre am Ende des Verfahrens zur Hämatombildung zu verhindern.
4. Um die Haut zu schließen, verwenden Sie zusätzliche Z-Plastiken zu Teil Verlängerung der Haut zu erhalten.
5. Für diese Studien nur das Knötchen Teil des fibrotischen Kabel, die aktivsten und zellulären Teil der Krankheit. Haben der Chirurg durchführen makroskopischen Identifizierung. Die isolierten Knötchen in der Handfläche der Hand sind oft Vorläufer oder eine Schnur dabei jedoch kaum reseziert, wie sie in der Regel keine Symptome verursachen.Die, die wir herausgeschnitten waren die Knötchen, die Teil einer Schnur der vertraglich Finger waren. Identifizieren Sie diese Knötchen von der harten dicken Teil der Kabel in der handpalm (1A).
6. Sobald der Chirurg entfernt das Gewebe unmittelbar Übertragung mit Hilfe einer sterilen Pinzette in ein 50 ml Röhrchen, das DMEM-Medium mit 10% FCS und 1% (P / S) ergänzt. Halten Sie das Gewebe für maximal 2 Stunden in diesem Medium auf eine Schachtel mit nassem Eis (4 ° C) (zB Transport der Gewebe aus dem Operationssaal in die Zellkultur-Anlage).
7. Bewahren Sie die Proben auf nassem Eis (4 ° C), während der Vorbereitung für den nächsten Schritt. Herstellung der Materialien und Zellkulturkammer erfordert 10-20 min.

2. Vorbereitung des Instruments, Kulturmedium und Kultureinsätze

Hinweis: Alle Verfahren werden bei Raumtemperatur durchgeführt, wenn nicht ausdrücklich angegeben.

1. Bereiten 500 ml DMEM mit 10% FCS und 1% (P / S) und Filter s ergänztterilize. Vorwärmen des Mediums bei 37 ° C.
2. Autoklav Pinzette, ein Paar von gebogenen Blatt Mayo Schere (150 bis 170 mm Länge) und ein Paar von Metzenbaumschere und an einem sterilen Behälter.
3. Unter laminaren Strömung, öffnen Sie eine sterile 12-Well-Kulturplatte. Setzen Sie einen Kultureinsatzes (0,45 um Porengröße, Durchmesser 12 mm) in jede Vertiefung der 12-Well-Platte (1B, unteres Bild).
4. Füllen der Platte mit 12 Vertiefungen mit 600 & mgr; l vorgewärmtes (37ºC) Kulturmedium durch Pipettieren auf dem gut und nicht direkt auf die Membran des Einsatzes. Legen Sie die Platte in den Inkubator (37 ° C, 5% CO ₂₎ (Abbildung 1B, oberes Bild).
   1. Alternativ können Sie einen 24-Well-Platte und 300 ul Medium pro Vertiefung. Das Volumen des Mediums pro Vertiefung ist optimal, wenn ein Meniskus Schicht zwischen der Flüssigkeit und dem unteren Teil der Membraneinsatz gebildet.
      Anmerkung: das Medium an der Unterseite des Bohrlochs diffundiert durch die Nitrocellulose membrane Bildung des Meniskus Schicht, wie in Systemen von 1B (unten) dargestellt.

3. Gewebepräparation und Ex-vivo-Gewebekultur-Setup

Hinweis: Alle Verfahren werden bei Raumtemperatur durchgeführt, wenn nicht ausdrücklich angegeben.

1. Übertragen Sie die Knoten Teil des Netzkabels aus der 50 ml Tube auf einer 100 mm Petrischale und 10 ml der vorgewärmten (37 ° C) Medium. Sicherzustellen, dass das Gewebe in während des gesamten Verfahrens mit der Flüssigkeit.
   1. Entfernen Sie die perinodular Fettschicht über die Metzenbaumschere. Entsorgen Sie das Fettgewebe. Mit der Verwendung von Pinzetten und die gebogenen Blatt Schere, geschnitten quer das Gewebe in kleinere Stücke (maximale Dicke von 200 um).
2. Übertragung der 12-Well-Platte aus dem Inkubator in das laminare Haube. Überprüfen Sie, dass die Membran der Beilage transparent (nass) gedreht und ist daher in Kontakt mit dem Medium.
3. Mit einer Pinzetteheben ein Gewebeteil durch Berühren der Außenschicht (nicht die Spannung auf das Gewebe Aufpreis). Platzieren einer Gewebeteil auf der Membran des Zellkultureinsatzes, so daß das Gewebe in der Luft-Medium Interphase verbleibt. Kultur maximal zwei Gewebeteile auf dem gleichen Einsatz / gut.
4. Sicherzustellen, dass das Gewebe flach auf der Membran mit dem Medium angeordnet ist, in Längskontakt, so daß das Gewebe nicht schwimmt von der Membran noch vollständig vom Füllgut bedeckt. Vermeiden Sie Luftblasen.
   Anmerkung: In diesem Stadium ist es möglich, Wachstumsfaktoren oder Inhibitoren von Interesse dem Medium hinzuzufügen; beispielsweise Testverbindungen (A, B, C, D, E) in Wiederholungen und / oder im Konzentrationskurve. Mindestens 2 Steuer (unbehandelt) Gewebestücke unter normalen Wachstumsbedingungen, um sicherzustellen, dass das Experiment wurde richtig eingerichtet. Gewebe für 3-7 Tage Inkubieren in einem Gewebekultur-Inkubator.
5. Infizieren das Gewebe entweder mit lentiviralen oder adenoviralen Konstrukt, wenn die Überexpression oder knock down eXperimente eines Gens von Interesse müssen (Figur 2) durchgeführt werden. Übertragen einer Gewebeteil aus der 12-Well-Platte in eine 35 mm-Schale mit einer Pinzette.
   1. Verwenden ein maximales Volumen von 10 ul Virus mit hohem Titer.
   2. Führen Sie die Injektion unter einem Präpariermikroskop mit einer Insulinspritze mit 50 ul PBS, enthaltend 10 ul des ausgewählten Virus belastet. Die Nadel senkrecht zu der Mitte des Gewebes.
   3. Langsam spritzen den Inhalt der Spritze. Sie nicht die Nadel direkt zurückzuziehen. Beim Durchstechen des Gewebes, lassen Sie die Nadel durch die andere Seite zu gehen, aber halten Sie die Nadel im Gewebe selbst (um die Mitte des Gewebes).
   4. Übertragen Sie das Gewebe wieder in die 12-Well-Platte, schließen Sie die Kulturplatte und legen Sie sie in den Brutschrank (37 ° C, 5% CO _2).

4. Whole-mount Immunfluoreszenzfärbungen und 3D-Rekonstruktion

Hinweis: Alle Pro-verfahren werden bei Raumtemperatur durchgeführt, wenn nicht ausdrücklich angegeben. Das Protokoll für die ganze Berg Immunfärbung und Imaging unten beschrieben ist eine Adaption von für andere Gewebe ^16-19 verwendet die zuvor beschriebenen Verfahren. Puffer und Materialien sind in Tabelle 1 und Materialliste beschrieben.

1. Übertragungsgewebe von der Kulturplatte zu 2 ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit PBS. 2 x Waschen für 5 min in PBS-Lösung auf einer rotierenden Plattform. Fix Gewebe in 4% PFA gepuffert (1,5 ml Lösung pro Gewebe in 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen), O / N bei 4 ° C auf einer rotierenden Plattform.
2. PFA entfernen und waschen 3x in PBS für jeweils 5 min.
3. Dehydratisieren Gewebe durch Eintauchen in eine 25% ige Methanollösung 2 h lang bei RT auf einer rotierenden Plattform. Erhöhen des Methanolprozent allmählich (50%, 75%, 100%) mit den in jeder Lösung 2 h lang bei RT auf einer rotierenden Plattform eingetaucht Geweben.
4. Übertragungsgewebe in DMSO / Methanol-Lösung (Permeabilisierung Schritt) für 3 Wochen bei 4 ° C,wie zuvor ¹⁸ beschrieben.
   Anmerkung: In diesem Stadium können Gewebe langfristig in 100% Methanol bei -20 ° C gelagert werden.
5. Fahren Sie mit dem Färbeverfahren ^{16, 17;} allmählich rehydrieren Gewebe (75% -50% -25% -0% Methanol-Serie). Führen Sie jede Rehydratisierungsschritt für 2 h bei RT oder O / N bei 4 ° C, unter ständigem Rühren.
6. Proben mit primären Antikörpern in PBS mit 1% Rinderserumalbumin (BSA) und 20% DMSO O / N bei 4 ° C inkubieren. Verwenden Antikörper in den folgenden Verhältnissen über die kommerziellen Vorräte in PBS: anti-α Glattmuskelaktin (1: 500, Maus), Anti-Kollagen Typ I (1: 500, Ziege), anti-Kollagen Typ III (1: 500, Ziege).
7. Umfassend Waschen in PBS für 48 Stunden bei 4 ° C (Änderung PBS-Lösung 3 bis 4 mal).
8. Verdünne geeigneten sekundären Antikörper (Alexa 555-Anti-Maus, Alexa 488-Anti-Ziegen) bei 1: 250 Verdünnung in PBS, enthaltend 1% (BSA) und 20% DMSO. Inkubieren Sie O / N bei 4 ° C.
9. Umfassend Waschen in PBS für 48 Stunden bei 476; C und Inkubation mit Kerngegenfärbung, TO-PRO-3, verdünnt 1: 500 in PBS bei dem letzten Waschschritt.
   Anmerkung: TO-PRO-3 ist eine weit rotemittierende DNA-Farbstoff (mit einem He-Ne-Laser mit 633 nm-Linie) und ist für die gleichzeitige Abbildung mit anderen Kanälen kombiniert; in diesem Fall von Kollagen Typ I / Kollagen Typ III (488 nm), α Glattmuskelaktin (555 nm), TO-PRO-3 (647 nm).
10. Übertragen die Gewebe auf ein Methanol-Reihe (25% -50% -75%), langsam in das Gewebe zu entwässern; Ausführen der einzelnen Entwässerungsschritt für 2 h bei RT und O / N bei 4 ° C unter konstantem Rühren.
    1. Übertragungsgewebe in Polypropylenröhrchen. Klar Gewebe in Methylsalicylat (Griff unter chemischen Abzugshaube) ¹⁸ oder eine alternative Nutzung BABB Lösung ^19. Inkubation bei RT unter ständigem Rühren, bis die Gewebe transparent. Berg zwischen einer Rutsche und einem Deckglas mit harten Satz Eindeckmedium (1C, oberes Bild) abgedichtet.
11. Bild Proben auf einem invertierten konfokalen MikroRahmen mit hoher NA 63X und / oder 100X Ölimmersionsobjektiven (1C) ausgestattet.
    1. Reinigen Sie das Objektiv mit der Mikroskopherstellers Reinigungslösung.
    2. Einen Tropfen des Öls auf die Objektivlinse. Den Objektträger mit der Probe auf dem Mikroskoptisch und Fokus auf der Probe.
12. Eingestellt, die Konfigurationen am Mikroskop für die gleichzeitige Abbildung von Dreikanal-Fluoreszenz mit Laserlinien bei 488 nm, 514 nm und 633 nm.
13. Erfassung Einzel XY Bilder oder mehrere Fokalebene Bilder (Z stack) (3A). Verwenden Sie erhöhte Breite der Z-Stack zur Ausführung 3D-Rekonstruktion. Zu erhalten, ein hochauflösendes Bild zu verwenden niedrige Scangeschwindigkeit, Anzahl der durchschnittlichen Scans (≥ 3) und zu erwerben 16-Bit-Bildern von 1024 x 1024 Pixel Auflösung.
14. Analysieren Sie die Z-Stack aufgenommenen Bilder: zuerst benennen und speichern Bilddatei (xyz). Mit dem Software-Programm des konfokalen Mikroskops, konfigurieren Sie eine maximale Intensität projection der Z-Stapel-Bildern in ein 3D-Bild rekonstruiert.
    1. Wählen Sie das xyz-Datei, in der "Process Tools", klicken Sie unter "Visualisierung" und "3D-Projektion". Enter "Maximum" in dem Verfahren der Vorsprung (oder "Normal", wenn das Fluoreszenzsignal gesättigt ist). Für eine einzige Projektion nicht die X, Y, und Z-Ebenen ändern, und wenden Sie das Projektierungstool (3B, r1).
15. Verwenden Sie die Z-Stack Bilder, um eine 3D-Projektion mit Animation (konfokalen Software) zur Ansicht erstellen. Wählen Sie das xyz-Datei, in der Prozess Extras auf unter "Visualisierung" und "3D-Projektion".
    1. Klicken Sie auf "Film erstellen". Geben Sie die Start-Drehwinkel in Grad (zB 0 ° als Ausgangspunkt des Films, Y-Achse) und klicken Sie auf "Set Start". Geben Sie die End-Drehwinkel in Grad (Y-Achse) als Endpunkt des Films (zB 180 ° oder 3606; Eine vollständige Drehung) und klicken Sie auf "Set End".
    2. Wähle "Maximum" als ein Verfahren zur Projektion (oder "Average", wenn das Fluoreszenzsignal gesättigt ist). Geben Sie den "Number of Frames" für die Drehung des 3D-Rekonstruktion (beispielsweise 20 Umdrehungen oder höher, um die Drehgeschwindigkeit zu verringern). Klicken Sie auf "Übernehmen". Exportieren Sie den Film als visuelle Datei (zB "avi") (Ergänzende Film 1) oder Export als Datei "tiff", die ein Bild-Datei für jeden Drehwinkel erzeugt (3B; Dreh r4, r10, r18).

5. Kombinierte Second Harmonic Generation (Kollagen) und Zwei-Photonen-Fluoreszenz-Excited (Elastin) Imaging auf Ex vivo Tissue während Kultur

Hinweis: Alle Verfahren werden bei Raumtemperatur durchgeführt, wenn nicht ausdrücklich angegeben.

1. Entfernen Transwell-Platten von Inkubator und legen Sie eine einzelne (nicht fixierte) tiUSGABE an einer 35 mm-Zellkulturplatte mit 500 ul Medium.
2. Positionieren Sie das Gewebe, so dass die lange Achse ist flach auf der Platte. Halten Gewebe nass zu allen Zeiten aber nicht schwimmen.
3. Zeigen wassereingetaucht Ziel der Multiphotonen-Mikroskop direkt in Kontakt mit dem Gewebe (Abbildung 1C).
4. Erhalten Bilder mit einer Anregungswellenlänge von 800 nm und sammeln emittierten Lichts zwischen 371 bis 425 nm (SHG-Kollagen) und 474 bis 532 nm (Autofluoreszenz, Elastin) (3C). Führen Zwei-Photonen-Mikroskopie in aufrechter konfokalen Mikroskop mit einem Femtosekundenlaser mit einer 20X / 1.0 NA Wasserimmersionsobjektiv ausgestattet. Prozess konfokalen Stacks mit Herstellersoftware.
   Hinweis: Die Anregung mit einem Nah-Infrarot-Laser der Kollagen-Moleküle erzeugt kontrastreiche Darstellung von nativem Kollagen-Strukturen in verschiedenen Tiefen.

Ergebnisse

Verfahren ex vivo, 3D-Kultur des Bindegewebes ist eine einfache und robuste Aufbau-System, um die Beziehung zwischen ECM und andere Zellbestandteile der DD Gewebe bilden und möglicherweise andere Arten von Fibrose als auch zu verstehen. Außerdem erlaubt dieses System eine zuverlässige Methode, um die Wirkungen der Verbindungen auf die verschiedenen Zelltypen und deren Auswirkungen auf den fibrotischen Last ²⁰ zu testen.

Die Schritte von Gewinnung von Operationsabfälle...

Diskussion

Die kritischsten Schritte der Kultivierung ex vivo menschlichen Bindegewebes sind die sofortige Verwendung des Gewebes nach der operativen Entfernung der Rentabilität zu gewährleisten; Das Gewebe sollte in Medium oder Kochsalzlösung zu jeder Zeit bleiben; Aufrechterhaltung einer sterilen Kultur; Querschnitten von Gewebe sollte maximal 200 & mgr; m Dicke zu haben; Einrichten der Ex-vivo-Kultursystem ist optimal, wenn Gewebe in Kontakt mit dem Medium, aber nicht vollständig untergetaucht. Medium ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium	Invitrogen	11965-084
fetal calf serum (FCS)	Gibco		high glucose, heat inactivated
penicillin-streptomycin	Invitrogen	15070-063
Cell culture inserts	Millicell	PIHA01250	0.45 μm pore size, 12 mm diameter
anti-collagen type I	Southern Biotech	1310-08
anti-α smooth muscle actin	Sigma	A2547
anti-collagen type III	Southern Biotech	1330-01
Alexa Fluor555 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)	Invitrogen	A-31570
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody	Invitrogen	A-11055
TOPRO-3	Invitrogen	T3605
methylsalicylate	Sigma	M6752
paraformaldehyde	Sigma	P6148
Tissue Tek OCT	Sakura	25608-930
Microsccope glass coverslips	Menzel-Glaser	BB024060A1	24 x 60 mm
Microscope SuperFrost slides	Menzel-Glaser	AA00000102E	76 x 26 mm
VECTASHIELD HardSet Mounting Medium	Vector laboratories	H-1400
Leica TCS SP5 II confocal microscope	Leica Microsystems		Argon-488, 514 nm and HeNe-633 nm laser lines
Zeiss 710 NLO upright confocal microscope	Jena, Germany		Equipped with femtosecond Spectra - Physics Deep See MP laser (Santa Clara, United States) using a Plan-Apochromat 20X/1.0 NA water-immersion objective.