الكمي الآلي للخلية المكونة للدم - التفاعلات خلية انسجة في صور النسيجية من Undecalcified العظام

Summary

A strategy to quantitatively analyze histological data in the bone marrow is presented. Confocal microscopy of fluorescently labeled cells in tissue sections results in 2-dimensional images, which are automatically analyzed. Co-localization analyses of different cell types are compared to data from simulated images, giving quantitative information about cellular interactions.

Abstract

المجهر متحد البؤر هو الأسلوب المفضل لتحليل توطين أنواع الخلايا متعددة داخل أنسجة معقدة مثل نخاع العظام. ومع ذلك، فإن التحليل النوعي والكمي لتوطين الخلوية أمر صعب، لأنها تعتمد في كثير من الحالات على العد والفرز اليدوي، وبالتالي تحمل مخاطر إدخال تحيز تعتمد على التصنيفات والحد من الموثوقية interrater. وعلاوة على ذلك، غالبا ما يكون من الصعب الحكم على ما إذا كان في توطين التعاون بين خليتين النتائج من المواقع عشوائي، وخصوصا عندما تختلف أنواع الخلايا بقوة في وتيرة حدوثها. هنا، هو عرض طريقة لتقدير غير متحيز للخلوي شارك في التعريب في نخاع العظام. يصف بروتوكول إعداد العينة المستخدمة للحصول على أقسام النسيجية من بأكملها العظام الطويلة الفئران بما في نخاع العظام، وكذلك بروتوكول تلطيخ واكتساب صور عالية الدقة. سير عمل تحليل تمتد من الاعتراف المكونة للدم وغير همت-يتم تقديم أنواع الخلايا opoietic في 2 الأبعاد صور نخاع (2D) العظم لالكمي لاتصالات مباشرة بين تلك الخلايا. وهذا يشمل أيضا تحليلا الحي، للحصول على معلومات حول المكروية الخلوية المحيطة نوع من الخلايا معين. من أجل تقييم ما إذا كان المشارك توطين أنواع الخلايا اثنين هو مجرد نتيجة لتحديد المواقع خلية عشوائي أو يعكس الجمعيات التفضيلية بين الخلايا، وهي أداة المحاكاة الذي هو مناسبة لاختبار هذه الفرضية في حالة المكونة للدم وكذلك خلايا انسجة، هو المستخدمة. وهذا النهج لا يقتصر على نخاع العظام، ويمكن أن تمتد إلى الأنسجة الأخرى للسماح للتكرار، والتحليل الكمي للبيانات النسيجية.

Introduction

بسبب التطورات التكنولوجية السريعة التي حدثت مؤخرا في المجهر، بما في ذلك التصوير الضوئي، أصبح تحليل الخلايا داخل سياق الأنسجة كلها يمكن الوصول إليها على نحو متزايد لالمناعة. توصيف الخلايا واحد في تعليق يمثل طريقة قيمة والتي لا غنى عنها لفهم وظيفة الخلوية والجزيئية. ومع ذلك، فإن تحليل الخلايا داخل (الصغرى) بيئتهم -anatomical أمر ضروري لفهم التفاعلات بين مختلف أنواع الخلايا التي تتعاون في العمليات المعقدة مثل تطوير الاستجابات المناعية.

في حين أنه من السهل نسبيا على المجاهر للحصول على المعلومات النوعية من الصور، فإنه لا يزال يشكل تحديا لقياس هذه البيانات، ويرجع ذلك جزئيا إلى حقيقة أن طرق التحليل في هذا المجال لا تزال متخلفة بالمقارنة مع ما هو ممكن في الحصول على الصور. لا يزال كثير من الباحثين يعتمدون على العد اليدوي خلية في الصور الأنسجة التي تستغرق وقتا طويلا،وبالتالي إدخال التحيز بين المقيمون المختلفة والتي تعيق التكرار من قبل جماعات أخرى. في كثير من الأحيان، يتم اختيار صورة تمثيلية واحدة للتأكيد بيان على موقف الخلوي أو زملاء التعريب في منشور، مما يجعل من الصعب على القارئ للحكم على أهمية الإحصائية لمثل هذا الحدث.

جنبا إلى جنب مع حقيقة أن محتوى المعلومات كاملة من بيانات الصورة ونادرا ما تستغل، وهذا يؤكد على الحاجة إلى نهج أكثر متحيز وأسرع وشامل لتحليل الصور النسيجية.

نخاع العظم هو نسيج المعقدة، والتي تأخذ على الوظائف الحيوية الهامة بوصفها جهاز تكون الدم في الفقاريات الكبار. وبالإضافة إلى كونها مهد للخلايا المكونة للدم ^1،2 ولعب دورا هاما في التنمية اللمفاويات B ^3، فإنه يعمل أيضا كموقع حيث بدأت التفاعلات المناعية ⁴ ويدعم، وخلايا إعادة تدوير B الناضجة ^5. وبالإضافة إلى ذلك، ودورها في الحفاظ على طأصبح ذاكرة mmunological تقدير متزايد في العقد الماضي، حيث تم العثور على عدة أنواع من الخلايا التي تشكل ذاكرة مناعية في الإقامة هناك ^6-9.

العلاقة بين العمارة الأنسجة المعقدة للنخاع العظام وظائفها لا تزال بعيدة المنال. على عكس الأجهزة اللمفاوية الثانوية، التي يتم تنظيمها في مقصورات الكلية مثل مناطق خلية T و B، ونخاع العظام يفتقر إلى اضحة التقسيم الكلي. وحتى الآن تم تعريفها مقصورات متميزة في نخاع العظام بواسطة قربها من قشرة العظام أو الأوعية الدموية. أهمية مختلف السكان الخلية انسجة المقيمين في نخاع العظام لعدد من العمليات مثل دعم الخلايا الجذعية، وتطوير الخلايا البائية أو صيانة السكان خلية ذاكرة المناعة (مثل خلايا البلازما المعمرة (أجهزة الكمبيوتر)، CD4 ⁺ و CD8 ⁺ خلايا الذاكرة T) يشير بوضوح إلى أن هناك درجة معينة من التقسيم الجزئي في نخاع العظام.

وقد أدت هذه الملاحظات إلى مفهوم محاريب microanatomical متميزة، وهي متخصصة في بعض وظائف (الجذعية صيانة الخلية، وتطوير الخلايا B في مراحل مختلفة، والحفاظ على الذاكرة المناعية) في نخاع العظام. على الرغم من أن يبدو أن هناك درجة معينة من عدم التجانس بين المنافذ التي تخدم وظائف مختلفة، وبعض من العوامل التي تنتجها الخلايا اللحمية، مثل CXC-chemokine يجند 12 (CXCL12) أو انترلوكين 7 (IL-7)، هي العناصر الحاسمة ل العديد من هذه محاريب ^10. التصور وتوصيف الخلايا اللحمية في نخاع العظام أمر صعب نظرا لخصائصها المورفولوجية مع طويلة، ملحقات شجيري رقيقة تشكيل شبكة في جميع أنحاء نخاع العظام، وعدم وجود علامات المناسبة لتميز القطعان اللحمية.

وليس من الواضح لبعد ما مدى تتقاسم هذه المنافذ السمات المشتركة فيما يتعلق تكوين. من الخلوية والجزيئيةن، والتي تجعل عناصر مكانة معينة فريدة من نوعها. بالإضافة إلى خلايا انسجة، وقد ثبت أن أنواع الخلايا المكونة للدم للعب دورا حاسما من خلال توفير إشارات معينة على الأقل لبعض المنافذ. ومن الواضح أن تعقيد التركيبة المتخصصة يتطلب تحليلهم في الموقع، وأنها أصبحت ذات أهمية متزايدة للالمناعة وأمراض الدم لزوم في نخاع العظام المعمارية المصغرة، على سبيل المثال، من خلال تحليل العلاقات المكانية بين المكونات الخلوية لها.

هنا، ووضع استراتيجية لقياس شارك في توطين وحي علاقات الخلوية في نخاع العظام في طريقة تلقائية وغير متحيزة وتقدم. سير عمل مفصلة بما في ذلك جيل من الفئران خيالية، بإيواء الخلايا الفلورسنت انسجة والخلايا المكونة للدم غير الفلورسنت، وإعداد أقسام النسيجية من عظام undecalcified، والحصول على الصور مبائر تغطي العظم كله، فضلا عن تحليل الصور الآلي للج الخلويةوتقدم س التعريب ولها التحقق من صحة / التمييز من المواقع عشوائي من قبل أداة المحاكاة (الشكل 8).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

تمت الموافقة على التجارب على الحيوانات من قبل اللجان الولائية المناسبة لرعاية الحيوانات (Landesamt FÜR Gesundheit اوند Soziales، برلين) وأجريت وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح الحالية (رخصة التجربة الحيوان G0194 / 11).

1. جيل من الفئران نيون نخاع العظم همي

ملاحظة: جيل من نخاع العظام الفلورسنت الفئران خيالية لتصور خلايا نخاع العظم انسجة يتم تنفيذ كما هو موضح قبل ^9.

1. بدء علاج ديل-لجنة المساواة العرقية س الفئران ROSA-tdRFP (الفئران معربا عن جنبا إلى جنب البروتين الفلوري الأحمر (tdRFP) بتواجد مطلق ^11-13) لإعدادهم للإشعاع. بدلا من ذلك، استخدام أي سلالة أخرى مع التعبير في كل مكان من البروتين الفلوري. إدارة 1 ملغ / مل من نيومايسين و 1 ملغ / مل من الفيتامينات (A، D3، E، C) عن طريق مياه الشرب قبل يومين من الإشعاع.
2. أشرق الفئران مرتين مع 3.8 رمادي مع السيزيوم 137 غاما-irradiator وايرقيقة فاصل 3 ساعة. لهذا، وضع الفئران في قفص فطيرة التشعيع مناسبة لirradiator المعنيين.
   ملاحظة: للإشعاع من الفئران، ومعهد لدينا لا تتطلب التخدير. اتبع سياسات المؤسسية المحلية بشأن التخدير لتشعيع. علاج الحيوانات مع 5 ملغ / كغ من تحت الجلد كاربروفين (الشوري) يوميا بعد التشعيع إذا كانت هناك علامات الألم.
3. في اليوم التالي، إعادة تكوين الفئران عن طريق الحقن في الوريد من 3 × 10 ⁶ خلايا نخاع العظام المحضرة من العظام الطويلة من C57BL / 6 الفئران المانحة في نقل عازلة ^9. الحفاظ على الفئران على نيومايسين والفيتامينات لمدة تصل الى 2 أسابيع ورصد رفاههم والوزن خلال هذا الوقت. انتظر 4 أسابيع على الأقل للسماح لإعادة تشكيل النظام المناعي قبل بدء العلاجات التجريبية محددة (على سبيل المثال، والتحصين) ^9.
4. التضحية الفئران ووضعها على لوحة التشريح، وتعقيم الساقين مع 70٪ من الإيثانول. Euthanizالفئران البريد وفقا للسياسات المؤسسية المحلية. معهدنا يقوم خلع عنق الرحم.
5. استخدام ملقط ومقص لإزالة الجلد من الفخذين. إزالة الأنسجة العضلية لفضح عظم الفخذ. خلع عظم الفخذ من الورك ومفصل الركبة باستخدام ملقط ومقص. يجب الحرص على عدم كسر أو قطع العظام.
6. إزالة بعناية المتبقية قطع كبيرة من الأنسجة العضلية والغضروف من العظام باستخدام المقص. إزالة الأنسجة العضلية المتبقية عن طريق فرك العظام مع المناديل الورقية المختبر. جمع العظام تنظيفها في طبق بتري مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS).
7. إصلاح عظام الفخذ كلها في 4٪ بارافورمالدهيد (PFA، والإلكترون المجهري الصف) ل4-6 ساعة.
8. تجاهل PFA واحتضان العظام في 10٪ سكروز في برنامج تلفزيوني O / N. في اليوم التالي، واحتضان العظام في 20٪ سكروز O / N. في اليوم التالي، احتضان العظام في 30٪ سكروز O / N.

2. Cryosectioning من العظام

ملاحظة: بعد 16-24 ساعة في 30٪ سكروز، وتجميد العظام وcryosection لهم وفقا لطريقة كاواموتو في الشريط ^14،15.

1. إعداد كوب كبير (2،000 مل الحجم) مع الثلج الجاف والأسيتون (حوالي 2: 1 نسبة حجم، على سبيل المثال، 400 مل من الثلج الجاف و 200 مل من الأسيتون) تحت غطاء الدخان. وضع كوب صغير (150-250 حجم مل) مع الهكسان داخل (30 - 50 مل تقريبا). انتظر المزيج ليبرد (حوالي 10 دقيقة، حتى يظهر الصقيع على السطح الخارجي للكوب كبير).
2. ملء ¾ من cryomold المسمى مع سوبر Cryoembedding متوسط ​​(SCEM)؛ وضع بعناية العظام داخل حتى يتم مغمورة تماما أنهم، مع الحرص على أن لا تلمس حواف القالب. مع ملقط كبير عقد cryomold في الكأس مع الجزء السفلي من القالب مجرد لمس سطح الهكسان.
   1. السماح للالحواف الخارجية للتجميد SCEM (المشار إليها التعتيم، وهذا يستغرق حوالي 15 ثانية). ثم تراجع بشكل كامل القالب في الهكسان والسماح لها الصحائفإز ل1 - 2 دقيقة. إخراج العينة المجمدة والتفاف في السيلوفان ثم رقائق الألومنيوم (لحماية عينة من الجفاف، وتجنب التعرض للضوء). متجر في -80 درجة مئوية حتى cryosectioning.
3. لcryosectioning من عظام الفخذ استخدام مشراح ومشراح القياسية شفرات لالأنسجة الصلبة.
4. تعيين العينة وشفرة درجة حرارة مشراح إلى -24 ° C. السماح للعينة الجلوس داخل مشراح لمدة 15 دقيقة قبل القطع.
   1. إصلاح كتلة العينة إلى صاحب العينة المعدنية مع SCEM أو درجة الحرارة المثلى القطع (OCT) متوسطة. ضبط اتجاه من كتلة إذا لزم الأمر. تقليم العينة حتى يتم فتح العظم بشكل كامل ونخاع مرئيا. ضبط القسم سمك إلى 7 ميكرون (تجاهل القسم الأول).
   2. إصلاح قطعة من الشريط كاواموتو مع الجانب زجة على الجزء العلوي من كتلة العينة باستخدام ملعقة خشبية مغطاة الجلود الغزلان. وفي وقت لاحق، وقطع عينة وتحويل الشريط بحيث القسمالمتمركزة على الجانب العلوي. نقل الشريط إلى كوب الشريحة باستخدام ملقط. إصلاح الشريط إلى شريحة زجاجية مع لاصق شفاف.
5. السماح أقسام تجف لمدة 30 دقيقة على الأقل وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام. تخزين الشرائح غير ملوثين وصاعد في صناديق الشريحة البلاستيكية التي تحتوي على الفواصل بين الشرائح واحدة من أجل تجنب أنها تلتصق ببعضها البعض. ويمكن تخزين الملون والتي شنت الشرائح لمدة تصل إلى أسبوع في الكرتون المجلدات الشريحة في 4 درجات مئوية.

مجموعة 3. صورة

1. ذوبان الجليد وcryosections وصمة عار وفقا لبروتوكولات المناعي المشتركة ^9. تشمل وصمة عار النووية، على سبيل المثال، 4، 6-diamidino-2-phenylindole هيدروكلوريد (دابي) لتصور سلامة الأنسجة.
   ملاحظة: وصمة عار، على سبيل المثال، لطلب تقديم العروض لتصور خلايا انسجة الحمضات وصمة عار مع الفئران مكافحة رئيسي البروتين الأساسي (ب ب) الأجسام المضادة ومكافحة الفئران اليكسا فلور 647 الضد (مكافحة RFP-البيوتين الأجسام المضادة وstreptavidin-فلور اليكسا 555)، والخلايا Bمع الفئران لمكافحة B220-اليكسا فلور 594 الضد وأجهزة الكمبيوتر مع الضوء مكافحة κ سلسلة فلوريسئين-ISO-ثيوسيانات (FITC) وأضداد λ1 ضوء سلسلة FITC (تم وصفها تفاصيل الإجراء تلطيخ في ^9).
2. جبل أقسام الملون: وضع قطرة واحدة من fluoromount على القسم ومن ثم تغطية مع # 1 غطاء زجاجي زلة، في حين تجنب بعناية تشكيل فقاعات الهواء. وفي وقت لاحق، نفذ المسح بالليزر متحد البؤر المجهري مع أداة مجهزة خطوط الليزر مناسبة للتلطيخ.
3. من أجل تسجيل الصور الآلي لتحليل شارك في توطين الخلايا المكونة للدم نخاع العظام مع خلايا انسجة باستخدام أداة Wimasis، وتطبيق الإعدادات التالية:
   1. استخدام 20X عدسة الهدف ومجال الرؤية من 708،15 العاشر 708،15 ميكرون. للتحليل الآلي، والحفاظ على حجم كل صور متناسقة في 2،048 خ 2،048 بكسل (بكسل) من اجل الحفاظ على نتائج قابلة للمقارنة.
   2. تسجيل قناة واحدة لهياكل اللحمية (على سبيل المثال، 561 نانومتر خط ليزر)، قناة واحدة للنواة (على سبيل المثال، دابي، 405 نانومتر) وقنوات إضافية للخلايا المكونة للدم من الفائدة (على سبيل المثال، 3 قنوات، 488/594/633 نانومتر لالحمضات، وخلايا B وأجهزة الكمبيوتر).
   3. تسجيل صور باستخدام خط المتوسط ​​4 ^16. ومن الناحية المثالية، وتغطي القسم الفخذ كله من خلال اتخاذ الصور المتجاورة واحدة. بدلا من ذلك، والتقاط صور غير متجاورة من مناطق مختلفة من نخاع العظام (جدلي وكذلك المشاشية).
      ملاحظة: يجب الحرص على عدم إنتاج التداخل بين الصور المجاورة (لتجنب تحليل المتكررة من الخلايا في المناطق المتداخلة).
4. حفظ الصور في شكل ملف صورة المجهري. تحقق، وإذا لزم الأمر، وضبط التباين لجميع القنوات في برنامج عارض الصور / التحليل.
5. تصدير 3 ملفات .jpg ولكل ملف صورة: ملف .jpg واحد للقناة دابي (أحمر / أخضر / أزرق (RGB) الشكل، اللون كاذبة مشفرة باللون الأصفر)، ملف .jpg واحد للقناة سدى (اللون الرمادي) و.jpg واحد ملف يحتوي علىقنوات الخلايا المكونة للدم (3 قنوات كحد أقصى، شكل RGB، على سبيل المثال، FITC (أجهزة الكمبيوتر، واللون كاذبة: الأخضر) / اليكسا فلور 594 (خلايا B، اللون كاذبة: الأزرق) / اليكسا فلور 647 (الحمضات، اللون كاذبة: أحمر)) .

4. الآلي تحليل الصور

1. استخدام أداة تحليل الصور لأداء تجزئة الصورة، وتحديد حجم شارك في توطين وتحليل حي (انظر مناقشة).
2. إذا باستخدام أدوات Wimasis، والمضي قدما على النحو التالي:
   1. تحميل مجموعات من 3 ملفات .jpg ولكل صورة مع اسم الملف نفسه تليها تسطير ورقم يشير إلى نوع من الصورة.
   2. استخدام _1 لملف .jpg مع الخلايا المكونة للدم، _2 لملف .jpg للقناة دابي، _3 لملف .jpg للقناة سدى. على سبيل المثال: Image1_1.jpg (الخلايا المكونة للدم)، Image1_2.jpg (قناة دابي)، وImage1_3.jpg (قناة سدى). تحميل الصور عبر حساب العميل.
   3. للاتصال خلية الكمياختيار أداة اتصال خلية عن طريق النقر على الحقل المعني. لمحيط الخلية الكمي، واختيار أداة محيط الخلية وتدخل في دائرة نصف قطرها محيط المفضل في ميكرون (الذي يقاس من حواف الخلايا ').
   4. تحميل النتائج.
      ملاحظة: يتم توفير النتائج على شكل ملفات .jpg وتظهر الخلايا المكونة للدم وقناة سدى مع حدود الأجسام المكتشفة مظلل، وكذلك ملفات .csv واحدة تحتوي على قياسات كل صورة، بالإضافة إلى ملخص ملف csv أن يحتوي على البيانات لجميع الصور التي تم تحميلها.
3. من الاتصال قياسات تحدد وتيرة الخلايا المكونة للدم (أحمر، أخضر، أزرق أو خلايا) في اتصال مع خلايا انسجة، أو الترددات من خلايا الدم الحمراء، الخضراء، الزرقاء أو الاتصال الأخرى أنواع الخلايا المكونة للدم (ويرد مثال في ممثل النتائج ، الشكل 4). من أجل تحديد الترددات، تقسيم التهم اتصال معين في الصورة عن طريقالخلية بحساب مجموع لكل صورة.
   1. لإجراء التجارب مع الفئران الفردية، نلخص العدد الكلى للاتصال من جميع الصور للفئران واحدة وتقسيمها على مجموع من إجمالي تعداد خلايا جميع الصور.
4. من قياسات محيط، وتحديد وتيرة خلايا الدم الحمراء، الخضراء أو الزرقاء ضمن حدود المسافة مختارة من خلايا انسجة و / أو الترددات من خلايا الدم الحمراء، الخضراء أو الزرقاء في القرب فضل أنواع الخلايا المكونة للدم أخرى كما هو موضح في الخطوة 4.3 ( انظر أيضا ممثل النتائج، الشكل 4).

5. محاكاة عشوائية نخاع العظم لتحديد المواقع

1. قبل تنفيذ عمليات المحاكاة لتحديد المواقع خلية عشوائي على نخاع العظم الصور النسيجية تحليلها، وإعداد الملفات التالية مقدما: ملفات .csv واحدة قدمت من قبل أداة اتصال الخلية، وملفات .JPG الأصلية للقناة دابي والملفات .JPG الأصلية للقناة اللحمية.
2. من أجل أداءالمحاكاة دفعة على سلسلة من الصور (على سبيل المثال، فإن جميع الصور من القسم الفخذ واحد)، وجمع جميع الملفات .JPG الأصلية (_1، _2 _3 و) وملفات .csv واحدة المقابلة في مجلد واحد.
   ملاحظة: أداة محاكاة لتحديد المواقع خلية نخاع العظم عشوائي متاحة عند الطلب.
3. بدء تشغيل أداة المحاكاة، والتحقق من مربع "لصناعة السيارات في تحميل بيانات الصورة".
   ملاحظة: سيقوم البرنامج قراءة عدد الخلايا ومتوسط ​​حجم الخلية من ملف .csv تلقائيا. يتم عرض هذه القيم في مربعات ل "عدد الخلايا" و "حجم خلية AVG" (الشكل 5A).
4. أدخل العلامة المشتركة للملفات. CSV، أي أن العامل المشترك في أسمائها. أدخل عدد مجموعات الصور التي ينبغي استخدامها لمحاكاة دفعة واسطة.
5. تحميل ملف .jpg المتولدة من قناة سدى (مع اسم الملف إنهاء _3).
6. إدخال الضبط لتوليد قناع من قناة دابي:
   1. ضع علامة في المربع "؟ تطبيق قناع "تعيين الحد الأدنى لتحويل الصورة إلى دابي قناع ثنائي إلى 10 (المدى 0-255).
   2. ضع علامة في المربع "8 بت؟" ضع علامة في المربع "تمدد؟" وتعيين درجة من التمدد إلى 5 بكسل. ضع علامة في المربع "ث / التآكل؟".
   3. أدخل القيمة المطلوبة لدائرة نصف قطرها محيط (دائرة نصف قطرها حي) المستخدمة لتحليل الصور المحاكاة. للحصول على صورة من 708.15 708.15 س ميكرون مع حجم 2،048 خ 2،048 بكسل (بكسل التحجيم س ص: 0.346 ميكرون)، 29 بكسل تتوافق مع 10 ميكرون.
7. خانة الاختيار "استخدام أوتسو؟" لاستخدام خوارزمية أوتسو في ¹⁷ الكشف التلقائي للهياكل اللحمية.
   ملاحظة: هذا هو نفس الخوارزمية المستخدمة من قبل اتصال والمنطقة المجاورة الأداة. باستخدام نفس خوارزمية تقطيع الصورة في التحليل الآلي للصورة المسجلة وصورة محاكاة أمر بالغ الأهمية من أجل الحفاظ على البيانات قابلة للمقارنة.
8. إدخال الضبط للخلايا المكونة للدم، والتي عالبريد محاكاة كأشكال دائرية.
   ملاحظة: أرقام الخلية لخلايا الدم الحمراء، الأخضر والأزرق يتم تحميلها مباشرة من ملف .csv (انظر أيضا خطوة 5.6).
   1. استخدام أداة محاكاة لحساب متوسط ​​قطرها في مقصف من خلايا الدم الحمراء والخضراء والزرقاء. تحديد متوسط ​​مساحة خلية واحدة كما إجمالي مساحة كل نوع من الخلايا في الصورة في مقصف مقسوما على عدد خلايا الكلي لكل صورة. استخدام متوسط ​​مساحة لحساب نصف قطر القرص باستخدام الصيغة. ضعف نصف قطر لتحديد متوسط ​​القطر.
9. قياس توزيع حجم الخلية من أنواع الخلايا تحليلها مع أي برنامج تحليل الصور التي تتضمن وظائف تجزئة الكائن. تحديد σ لجميع أنواع الخلايا المكونة للدم ⁽¹⁸ و الشكل 5B).
   ملاحظة: بما أنه لا يتم تحديد حجم التوزيعات خلية من الخلايا التي سجلتها تحليل الصور الآلي، واستخدام توزيع جاوس كما تقريبي للتوزيعات حقيقية. عرض تييوصف انه منحنى التوزيع من قبل σ، ويمكن أن تكون مختلفة تماما عن أنواع الخلايا المختلفة. (لمزيد من التفاصيل، انظر الشكل 5B).
   1. من هذه القياسات، وتحديد "حجم الخلية قطع": قطر في مقصف أن يصف أصغر الكائن لا يزال يعترف بها خلية كاملة من قبل أداة تحليل الصور.
10. أدخل المعلمات في صناديق منهما على واجهة المستخدم الرسومية (الشكل 5A).
    1. أدخل حجم الخلية قطع، أي الحد الأدنى لحجم الخلية المسموح بها في المحاكاة، وقطر في مقصف.
    2. أدخل σ في مقصف لمحاكاة توزيع حجم الخلية لخلايا الدم الحمراء، الخضراء، والزرقاء (من الخطوة 5.9).
    3. ضع علامة في المربع "حذف" في القسم الفرعي "خلايا في قناع". مع هذا الإعداد، سيقوم البرنامج اختار وظيفة جديدة لخلية إذا كان يتداخل مع بكسل واحد على الأقل مع منطقة محظورة من القناع. ضع علامة في المربع "تجنب التداخل الخليوي؟ ̶1؛ في القسم الفرعي "استبعاد الخلية".
    4. أدخل الحد الأدنى للمسافة المسموح به بين مراكز خليتين في مقصف.
       ملاحظة: يجب الحد الأدنى من المسافة يتم تحديدها من الصور المسجلة. خطأ مسافات الدنيا تقاس سيؤدي إلى متحيزة / النتائج اصطناعية للمقارنة بين الصور المسجلة والمحاكاة.
    5. تعيين المساحة القصوى من التداخل إلى 100٪ إذا تم تعريف التداخل عن طريق الحد الأدنى للمسافة من مركز لآخر.
    6. تعيين أداة المحاكاة إلى 1،000 التكرار.
    7. ضع علامة في المربع "خلايا الحفظ التلقائي؟" لحفظ إحداثيات الكائنات محاكاة لجميع التكرار من كل صورة من الدفعة كملفات .rect (تنسيق النص). ضع علامة في المربع "صور الحفظ التلقائي؟" لحفظ ملف .tiff لكل صورة المحاكاة. أدخل علامة مشتركة لحفظ الملفات.
       ملاحظة: "خلايا الحفظ التلقائي؟" الخيار يقلل محاكاة إدارة الوقت وحجم البيانات الإجمالي، مقارنة عند حفظ محاكاة معهد العالم العربي الفعليغيس. ملفات .rect حفظ إحداثيات الخلايا محاكاة مثل المستطيلات وبالتالي يمكن تحويلها إلى صور محاكاة إذا لزم الأمر.
11. بدء تشغيل المحاكاة من خلال النقر على "محاكاة تشغيل".
    ملاحظة: أداة محاكاة تلقائيا بإنشاء ملف .csv ل1،000 المحاكاة من كل صورة، بما في ذلك متوسط ​​التهم الاتصال والتهم المجاورة لخلايا الدم الحمراء والخضراء والزرقاء مع خلايا الدم الحمراء والأخضر والأزرق، وانسجة لكل مجموعة من عمليات المحاكاة المتكررة . بالإضافة إلى ذلك، لجميع هذه القيم، وتقدم متوسطات 1،000 المحاكاة مع الانحراف المعياري (STD) والخطأ المعياري للمتوسط ​​(SEM).
12. تحديد ترددات الاتصال والترددات مقربة من مجموعة واحدة من الصور 1،000 محاكاة المتوسط. لهذا، تقسيم متوسط ​​الاتصال والتهم المجاورة من قبل عدد خلايا سجلت في الصورة. مقارنة الترددات إلى نتائج التحليل المشترك التعريب الآلي للصورة المسجلة.
13. تطبيق الستاتي المناسبةطرق stical اعتمادا على تحليل ¹⁹ (الشكل 7 ل، استخدمنا قعت يلكوكسون ثنائي الطرف اختبار رتبة).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

قطع cryosections من العظام undecalcified مع أسلوب الشريط كاواموتو يسمح العظم كله لا بد من تخفيض باعتباره القسم سليمة، مع نخاع العظم من منطقة الطعوم لا تزال تعلق حتى العظم المعدنية، سواء في diaphysis وكذلك في مناطق المشاشية مع هم كثافة عالية من تربيقية العظام (الشكل 1). تلطيخ ا...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

على الرغم من التقدم في أساليب التصوير البصرية الحديثة، لا يزال كثير من الأحيان أعاق تحليل البيانات النسيجي بسبب عدم وجود أدوات القياس الكمي المناسبة والأساليب، أو عن طريق التحليلات المغرضة التي تركز على منطقة صغيرة من الفائدة. نهج التآزر المقدمة هنا يجمع بين تحليل ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Neomycin	Sigma	N6386 SIGMA	Neomycin trisulfate salt hydrate, EU hazard code: GHS08
Ursovit AD3EC	Serumwerke Bernburg		1 ml contains: 50.000 I.E. retinyl palmitate, 5.000 I.E. cholecalciferol, 30 mg tocopheryl acetate, 100 mg ascorbic acid, 1 mg sorbic acid, 200 mg polyoxyl 35 castor oil, 0,5 mg propyl gallate
Transfer buffer (100 ml PBS, 1 ml 1 M HEPES, 50 U/ml penicillin/streptomycin)	Sigma	P4333, H3375
4-Hydroxy-3-nitrophenylacetyl hapten conjugated to chicken gamma globulin
Chicken gamma globulin (CGG) 100 mg	Rockland	D602-0100
20% Paraformaldehyde solution (EM-grade)	Science Services	15713	EU hazard codes: GHS02, GHS05, GHS07, GHS08
D(+)-sucrose	Carl Roth	4621.1
Dry ice
Acetone	Sigma-Aldrich	179124 SIGMA-ALDRICH	EU hazard codes: GHS02, GHS07
Hexane	Sigma-Aldrich	208752 SIGMA-ALDRICH	EU hazard codes: GHS02, GHS07, GHS08, GHS09
Tissue-Tek cryomolds (standard)	Sakura	4557	25 x 20 x 5 mm
Tissue-Tek O.C.T.	Sakura	4583
Kawamoto's SCEM embedding medium	Section-Lab, JP
Kawamoto's cryosection preparation kit	Section-Lab, JP
Kawamoto's cryofilm type 2C(9)	Section-Lab, JP
Microtome blade MX35 premier plus, low profile	Thermo Scientific	3052835	L X W: 80 x 8 mm (31.5 x 3.13"), thickness: 0.25 mm (0.01")
Polyclonal rabbit anti-RFP antibody, biotinylated	Rockland	600-406-379
Alexa Fluor 555 streptavidin	Life Technologies	S-32355
Rat anti-MBP	J. and N. Lee		available from: J. and N. Lee, Mayo Clinic, Scottsdale, AZ , U.S.A., clone MT-14.7
Goat anti-rat-Alexa Fluor 647	Life Technologies	A-21247
Rat anti-B220 - Alexa Fluor 594			produced and coupled in-house (DRFZ), clone RA3.6B2, Alexa Fluor 594 from Life Technologies
Mouse anti-l1 light chain -FITC			produced and coupled in-house (DRFZ), clone LS136
Rat anti-k light chain - FITC			produced and coupled in-house (DRFZ), clone 187.1
DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)	Sigma	D9542 SIGMA
Fluorescent mounting medium	DAKO	S3023
Cover slips (24 x 24 x 0.13-0.16 mm)	Carl Roth	H875.2
Superfrost slides glasses (75 x 25 mm)	VWR	48311-703
Laser scanning confocal microscope			equipped with laser lines of 405, 488, 561, 594, 633 nm and a 20X/0.8 NA air objective lens. We used a Zeiss LSM710 and Zen 2010 Version 6.0 software.
Automated image analysis tools for bone marrow	Wimasis, Munich		The cell contact tool and cell vicinity tool will be made available by Wimasis upon request.
VC2012 runtime	Microsoft		free download
Simulation tool for random cell positioning			available from us, upon request
Image analysis software with image segmentation functions			We used Volocity (Perkin Elmer) for measuring cell size distributions of hematopoietic cell types in bone marrow (Figure 5). Alternatives are Definiens Image Analysis (Definiens) or Cell Profiler (free download)
Fiji image analysis software			free download. Fiji was used by trained raters for manual cell count (Figure 3).