조혈 세포의 자동화 된 정량화 - Undecalcified 뼈의 조직 학적 이미지에서 기질 세포 상호 작용

요약

A strategy to quantitatively analyze histological data in the bone marrow is presented. Confocal microscopy of fluorescently labeled cells in tissue sections results in 2-dimensional images, which are automatically analyzed. Co-localization analyses of different cell types are compared to data from simulated images, giving quantitative information about cellular interactions.

초록

초점 현미경은 골수 같은 복잡한 조직 내에서 여러 종류의 세포 편재 분석위한 선택 방법이다. 많은 경우에 따라서 레이터 의존적 바이어스를 도입하고 자간 신뢰성을 감소의 위험을 담지 수동 계산에 의존하지만, 셀룰러 편재 및 정량 분석​​이 어렵다. 세포 유형은 그 발생 빈도의 차이가 특히 강하게 또한, 임의 위치로부터의 결과 두 셀 간의 공동 지역화 여부를 판단하는 것이 곤란하다. 여기서, 골수 세포 공동 편재 편견 정량 방법이 도입된다. 프로토콜은 골수를 포함한 전체 뮤린 긴 뼈의 조직 학적 섹션을 획득하기 위해 사용되는 샘플 제조뿐만 아니라, 염색 프로토콜과 고해상도 화상의 취득을 설명한다. 조혈 및 비 hemat의 인식에서 스패닝 분석 워크 플로우이들 셀 사이의 직접적인 접촉의 정량화 2 차원 (2D) 골수에서 이미지 opoietic 세포 유형이 제공된다. 이것은 또한 특정 세포 유형을 둘러싸 세포 미세 환경에 대한 정보를 얻기 위해, 이웃 분석을 포함한다. 두 종류의 세포 공동 지역화 랜덤 셀 위치의 단순한 결과 또는 셀 간의 우선 연결을 적용할지 여부를 평가하기 위해, 조혈뿐만 아니라 간질 세포의 경우,이 가설을 시험하기에 적합하다 시뮬레이션 도구이며, 사용. 이 방법은 골수에 한정되지 않으며, 조직 학적 데이터의 재현성, 정량 분석​​을 허용하기 위해 다른 조직으로 확장 될 수있다.

서문

인해 광학 현미경 이미지 등을 포함한 최근의 급속한 기술 발전에, 조직 전체의 문맥 내에서 세포의 분석은 면역학 점점 접근되고있다. 서스펜션에서 단일 세포의 특성은 세포 및 분자 기능을 이해하는 귀중한 불가결 방법을 나타냅니다. 그러나, 그들의 (마이크로) -anatomical 환경 내 세포의 분석은 면역 반응의 개발과 같은 복잡한 공정에서 공동 다양한 세포 유형 간의 상호 작용을 이해하는 데 필수적이다.

현미경 학자, 이미지의 정 성적 정보를 획득하는 것이 상대적으로 용이하지만, 그것은 부분적으로는이 분야의 분석 방법은 화상 획득 가능한 것과 비교 뒤쳐져 있다는 사실, 이들 데이터를 정량화 할 과제로 남아. 많은 연구자들은 여전히​​ 시간 소모적 그들의 조직학 이미지에서 수동 세포 카운팅에 의존따라서 다른 평가자 사이에 바이어스를 도입하고 다른 그룹에 의해 복제를 방해. 때때로, 하나의 대표 이미지는 하드 독자가 이러한 경우의 통계적 관련성을 판단 할 만들기, 책에서 휴대 전화 위치 또는 공동 현지화에 문을 강조하기 위해 선택된다.

함께 화상 데이터의 전체 정보 콘텐츠가 거의 이용되지 않는다는 사실과, 이는 더 빠르고 편견 광범위한 조직 학적 방법이 이미지를 분석 할 필요성을 강조한다.

골수는 성인 척추 동물의 조혈 기관으로 중요한 기능 회복에 걸리는 복잡한 조직이다. 조혈 세포 ^1,2 출생지와 B 림프구의 발달 ³ 중요한 역할 외에, 또한 면역 반응 개시 ⁴ 성숙한 재순환 B 세포 ^{5 지원되는} 사이트로서 작용한다. 난을 유지하는 외에, 그 역할면역 메모리를 구성하는 세포의 여러 종류가 ^6-9이 존재하는 것으로 밝혀졌다으로 mmunological 메모리는 점점, 지난 10 년간 평가되고있다.

복잡한 조직 골수의 구조와 기능 사이의 관계는 여전히 애매 남아있다. 이러한 T 및 B 세포 영역으로 매크로 구획으로 구성되어 차 림프 기관과는 달리, 골수 맑은 매크로 구획화 없다. 지금까지 골수에서 별개의 구획 골 피질 또는 혈관의 근접에 의해 정의된다. 이러한지지 줄기 세포, B 세포 또는 장수 형질 세포 (PC와 같은 면역 기억 세포 집단 (유지), CD4 ⁺ 및 개발 등의 처리의 수에 대한 골수의 다양한 상주 간질 세포 집단의 중요성 CD8 ⁺ 메모리 T 세포)는 명확 골수 미세 구획화 어느 정도가 있음을 나타낸다.

이러한 관찰은 특정 기능 골수 (셀 유지 보수, 다양한 단계에서 B 세포 개발 및 면역 메모리의 유지 보수 줄기)를 전문으로하는 별개의 microanatomical 틈새 시장의 개념으로 이어졌다. 서로 다른 기능을 수행 틈새 사이에서 이질성의 어느 정도있을 것 같습니다 있지만, 이러한 CXC-케모카인 리간드 12 (CXCL12) 또는 인터루킨 7 (IL-7) 등의 기질 세포에 의해 생성되는 몇 가지 요소는 매우 중요 구성 요소 이러한 틈새 시장 ^(10)의 여러. 골수에서 시각화 및 간질 세포의 특성 때문에 가늘고 긴 돌기 확장 골수에 걸쳐 네트워크를 형성하는 자신의 형태 적 특징에 곤란하며, 해당 마커의 부족 기질 아 집단을 구별하기.

이러한 틈새가 자신의 세포 및 분자 compositio에 대한 공통적 인 특징을 공유 어느 정도는 아직까지 명확하지 않다n 및 요소는 특정 틈새 시장 고유의 렌더링합니다. 간질 세포 이외에, 조혈 세포 유형은 틈새의 적어도 일부 특정 신호들을 제공함으로써 중요한 역할을하는 것으로 나타났다. 분명히, 틈새 조성물의 복잡성은 동일계에서의 분석이 필요하고, 면역학 및 혈액학는 세포 성분 사이의 공간적 관계를 분석하여, 예를 들어 골수 마이크로 아키텍처를 확대하는 것이 점점 더 중요 해지고있다.

여기에, 전략은 제시 자동화 및 편견 방법으로 골수 세포 공동 현지화 및 이웃 관계를 정량화한다. 형광 기질 세포 및 비 형광 조혈 세포, undecalcified 뼈, 전체 뼈를 덮는 공 초점 화상의 취득으로부터 조직 학적 단면의 제조뿐만 아니라, 셀룰러 (C)의 자동화 된 이미지 분석, 키메라 마우스의 생성을 포함하는 형질 상세한 플로오 - 현지화 및 시뮬레이션 툴에 의해 임의의 위치에서의 검증 / 차별 (그림 8)을 제공한다.

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프로토콜

동물 실험은 동물 복지 (Landesamt에 대 한 아퍼 싶게 Soziales, 베를린)에 해당하는 국가위원회에 의해 승인되었고, 현재의 지침과 규정 (동물 실험 라이센스 G0194 / 11)에 따라 수행되었다.

형광 골수 키메라 마우스의 1 세대

주 : ⁹ 전에 설명한 바와 같이 골수 간질 세포를 시각화하기 위해 형광 골수 키메라 마우스의 생성이 행해진 다.

1. 델-Cre 호텔이 조사를 위해 준비하기 (탠덤 적색 형광 단백질 (tdRFP) 도처 ^11-13을 표현 마우스) ROSA-tdRFP 마우스를 X 치료를 시작합니다. 또한, 형광 단백질의 유비쿼터스 식으로 다른 변형을 사용합니다. 이일 조사 전에 마시는 물을 통해 네오 마이신의 1 ㎎ / ㎖, 1 ㎎ / 비타민 ml의를 (A, D3, E, C) 관리합니다.
2. 세슘 137 감마선 조사 장치 위스콘신 3.8 회색으로 두 번 쥐를 조사3 시간의 간격 얇은. 이를 위해, 각각의 조사 장치에 적합한 조사 파이 케이지에 마우스를 놓습니다.
   참고 : 마우스의 조사의 경우, 우리 연구소는 마취가 필요하지 않습니다. 조사를위한 마취에 대한 지역 기관 정책을 따릅니다. 고통의 흔적이있는 경우 조사 후 하루 카프로 펜 피하 (SC)의 5 ㎎ / ㎏과 동물을 취급합니다.
3. 다음날, 전송 버퍼 ⁹ C57BL / 6 마우스의 공여체 긴 뼈로부터 제조 3 × ^106의 골수 세포의 정맥 내 주사에 의해 생쥐 재구성. 최대 2 주 동안 네오 마이신에 마우스 및 비타민을 유지하고이 시간 동안 자신의 건강과 체중을 모니터링 할 수 있습니다. 특정 실험 치료를 시작하기 전에 면역계의 재구성이 가능하도록 적어도 사주 잠깐 (예를 들어, 면역화) ^9.
4. 쥐를 희생하고 해부 보드에 배치, 70 % 에탄올로 다리를 소독. Euthaniz지역 기관 정책에 따라 전자 마우스. 우리 연구소는 자궁 경부 전위를 수행합니다.
5. 허벅지에서 피부를 제거하기 위해 집게와 가위를 사용합니다. 대퇴 뼈를 노출 근육 조직을 제거합니다. 집게와 가위를 사용하여 고관절과 무릎 관절에서 대퇴골을 삐다. 깨지거나 뼈를 절단하지 않도록주의하십시오.
6. 조심스럽게 가위를 사용하여 뼈에서 근육 조직과 연골의 큰 조각을 나머지 제거합니다. 실험실 휴지와 뼈를 문질러 남아있는 근육 조직을 제거합니다. 인산염 완충 식염수 (PBS)와 페트리 접시에서 청소 뼈를 수집합니다.
7. 6 시간 - 4 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA, 전자 현미경 등급)에 전체 대퇴 뼈를 고정합니다.
8. PFA를 버리고 PBS O / N 10 % 자당의 뼈를 품어. 다음 날, 20 % 자당 O의 / n에서 뼈를 품어. 날이 후, 30 % 자당 O의 / n에서 뼈를 품어.

뼈 2. 냉동 절편

참고 : 한 후6 - 30 % 자당에 24 시간, 뼈를 동결 카와 모토의 테이프 방법 ^{(14, 15)에} 따라 그들을 동결 절단 (Cryosections).

1. 드라이 아이스, 아세톤으로 큰 비이커 (2000 ml의 부피)를 준비 (약 2 : 1 부피비를, 예를 들면, 드라이 아이스 및 아세톤 400 ㎖를 200 ㎖) 흄 후드. (- 50 ml의 약 30) 내부 헥산 - (250 ml의 볼륨 150) 작은 비커를 놓습니다. (서리가 큰 비커의 외부에 표시 될 때까지, 약 10 분) 냉각 믹스 기다립니다.
2. 슈퍼 Cryoembedding 중간 (SCEM)로 표시 cryomold의 ¾을 채우 그들은 완전히 그들이 금형의 가장자리를 만지지 않도록주의하면서 몰입 될 때까지 조심스럽게 내부의 뼈를 배치합니다. 큰 집게로 바로 헥산의 표면을 만져 금형의 바닥 비커에 cryomold를 개최합니다.
   1. SCEM 동결의 바깥 쪽 가장자리하자 (불투명도로 표시를,이 약 15 초 소요). 그런 다음 완전히 헥산으로 금형을 삭제하고 FRE을하자2 분 - 1 EZE. 냉동 샘플을 꺼내 셀로판 포장 한 후 알루미늄 호일 (건조되는 샘플을 보호하고 빛에 대한 노출을 피해야). 냉동 절편 때까지 -80 ° C에서 보관.
3. 대퇴 뼈의 냉동 절편을 위해 열심히 조직에 대한 표준 마이크로톰 및 마이크로톰 블레이드를 사용합니다.
4. -24 ° C에서 마이크로톰의 샘플 및 블레이드 온도를 설정합니다. 샘플을 절단하기 전에 약 15 분 동안 마이크로톰 안에 앉아 보자.
   1. SCEM 또는 최적의 절단 온도 OCT () 매체와 금속 시료 홀더에 샘플 블록을 수정합니다. 블록 필요한 경우의 방향을 조정합니다. 뼈가 완전히 열릴 때까지 샘플을 잘라 내고 골수 볼 수 있습니다. 7 μm의 단면 두께 (첫 번째 섹션 폐기) 조정합니다.
   2. 사슴 가죽 커버 나무 주걱을 사용하여 샘​​플 블록의 상단에있는 끈적 끈적한면 카와 모토 테이프의 조각을 수정. 이어서, 시료를 절단하고 단면이되도록 테이프를 켜상부 측에 위치. 집게를 사용하여 슬라이드 글래스에 테이프를 전송합니다. 스카치 테이프로 슬라이드 글라스에 테이프를 고정합니다.
5. 섹션 적어도 30 분 동안 건조 시키 및 사용 때까지 -80 ° C에 저장합니다. 그들이 함께 스틱 것을 피하기 위해 하나의 슬라이드 사이에 스페이서 플라스틱 슬라이드 상자에 흠 및 마운트 해제 슬라이드를 저장합니다. 스테인드 및 장착 된 슬라이드는 4 ° C에서 최대 일주일 판지에 슬라이드 폴더에 저장할 수 있습니다.

3. 이미지 모음

1. 일반적인 면역 프로토콜 ⁹ 항에 해동 얼룩 저온부. 예 : 핵 염색, 조직 무결성을 나타낼 4 ', 6-diamidino-2 염산염 페닐 인돌 (DAPI)을 포함한다.
   참고 : 얼룩, 예를 들어, RFP에 대한 기질 세포 (안티 - RFP - 비오틴 항체 및 스트렙 타비 딘 - 알렉사 형석 555), 쥐 안티 주요 기본 단백질 (MBP) 항체 및 안티 쥐 알렉사 형석 647 항체와 얼룩 호산구를 시각화 , B 세포안티 κ 경쇄 형광 이소 티오 시아 네이트 (FITC) 및 항 λ1 경쇄-FITC 항체 랫트 항 - B220 - 알렉사 형석 594 항체 및 PC를 (염색 과정의 세부 ^{사항은도 9에} 기재되어있다).
2. 스테인드 섹션을 탑재합니다 섹션에 fluoromount 한 방울을 넣고 조심스럽게 기포의 형성을 방지하는 동안, # 1 유리 커버 슬립 커버. 그 후, 염색에 적합한 레이저 라인을 갖추고 악기 레이저 스캐닝 공 초점 현미경을 수행합니다.
3. 간질 세포는 다음과 같은 설정을 적용 Wimasis 도구를 사용하여 골수 조혈 세포의 자동화 공동 지역화 분석 이미지를 기록하기 위해 :
   1. 20 배 대물 렌즈와 708.15 X 708.15 ㎛,보기의 필드를 사용합니다. 자동화 된 분석을 위해, 비교 결과를 유지하기 위해 2048 X 2048 픽셀 (PX)에서 일관된 모든 이미지의 크기를 유지한다.
   2. 예를 들어, (간질 구조에 대한 하나의 채널을 기록, 561 nm의 레이저 라인), 핵에 대한 하나의 채널 (예를 들어, DAPI, 405 ㎚)과이자의 조혈 세포 (추가 채널 예를 들어, 3 채널, 호산구, B 세포와 PC 용 488/594/633 ㎚).
   3. 4 ^{16 평균} 회선을 사용하여 이미지를 기록. 이상적으로, 하나의 인접한 이미지를 취함으로써 전체 대퇴골 부분을 커버한다. 대안 적으로, 골수 (골간뿐만 아니라 성장판)의 다양한 영역들에서 인접하지 않은 사진을 촬영.
      참고 : 인접 이미지 (중복 영역에서 세포의 반복 분석을 피하기 위해) 사이의 중복을 생성하지 않도록주의하십시오.
4. 현미경 이미지 파일 포맷으로 이미지를 저장. 확인하고, 필요한 경우, 이미지 뷰어 / 분석 소프트웨어의 모든 채널에 대한 대비를 조정합니다.
5. 이미지 파일 당 수출 3 .JPG 파일 : DAPI 채널 (빨강 / 녹색 / 청색 (RGB) 형식으로, 노란색으로 구분 거짓 색상), 기질 채널에 대한 하나 .jpg 파일 (그레이 스케일)과 하나 .JPG 하나 .jpg 파일 파일 포함조혈 세포에 대한 채널 (3 채널 최대, RGB 형식, 예를 들어, FITC (PCS, 거짓 색상 : 녹색) / 알렉사 형석 594 (B 세포, 거짓 색상 : 블루) / 알렉사 형석 647 (호산구, 거짓 색상 : 적색)) .

4. 자동 이미지 분석

1. 영상 분할, 공동 현지화 및 지역 분석 (토론 참조)의 정량을 수행하기 위해 이미지 분석 도구를 사용합니다.
2. Wimasis 도구를 사용하는 경우 다음과 같이 진행합니다 :
   1. 밑줄과 화상의 종류를 나타내는 숫자가 뒤에 동일한 파일 이름으로 이미지 당 3 .JPG 파일 세트 업로드.
   2. 조혈 세포와 .jpg 파일에 대한 _1를 사용하여, 기질 채널에 대한 .jpg 파일에 대한 DAPI 채널 _3을위한 .jpg 파일에 대한 _2. Image1_1.jpg (조혈 세포), Image1_2.jpg (DAPI 채널) 및 Image1_3.jpg (기질 채널) 예를 들면 다음과 같습니다. 고객 계정을 통해 이미지를 업로드합니다.
   3. 세포 연락처 정량각각의 필드를 클릭하여 셀 접촉 도구를 선택합니다. 세포 주변 정량, 셀 주변 도구를 선택하고 (세포 '가장자리에서 측정) μm의에서 선호 주변 반경을 입력합니다.
   4. 결과를 다운로드합니다.
      주 : 결과 요약에 더하여, .JPG의 조혈 세포 및 검출 된 객체의 경계를 가진 기질 채널을 나타내는 파일 강조뿐만 아니라 모든 이미지에 대한 측정을 포함하는 단일 .CSV 파일로 제공되어 .CSV 파일 그 업로드 된 모든 이미지에 대한 데이터가 포함되어 있습니다.
3. 접촉으로부터 측정 예 대표 결과에 나타낸다 기질 세포 또는 다른 조혈 세포 유형을 접촉시키는 적색, 녹색 또는 청색 셀의 주파수와 접촉 (조혈 세포 (적색, 녹색 또는 청색의 셀)의 주파수를 결정 그림 4). 주파수를 결정하기 위해, 화상에 의해 주어진 접촉 당 카운트 분할총 셀은 이미지 당 계산합니다.
   1. 개별 쥐 실험을 위해, 하나의 마우스에 대한 사진의 총 접촉 카운트를 합산하고 사진의 총 세포 수의 합으로 나누어 이들을.
4. 단계 4.3 (에 기재된 근방 측정으로부터, 간질 세포 및 / 또는 다른 조혈 세포 유형에 바람직 근방 적색, 녹색 또는 청색 셀의 주파수로부터 선택된 거리에 적색, 녹색 또는 청색 셀의 주파수를 결정 또한 참조 대표 결과, 그림 4).

임의의 골수 위치 5. 시뮬레이션

1. 분석 골수 조직 학적 영상에 임의의 셀 위치 결정의 시뮬레이션을 실행하기 전에, 미리 다음 파일을 준비 : 세포 접촉 도구 DAPI 채널에 대한 원래 .JPG 파일과 원래 .JPG 파일에 의해 제공되는 단일 .CSV 파일 간질 채널.
2. 수행하기 위해서일련의 이미지에 배치 시뮬레이션 (예를 들어, 하나의 대퇴 섹션의 모든 이미지), 하나의 폴더에 모든 원본 .JPG 파일 (_1, _2와 _3)와 대응하는 하나의 .CSV 파일을 수집합니다.
   참고 : 임의의 골수 세포의 위치 결정을위한 시뮬레이션 도구의 요청에 따라 사용할 수 있습니다.
3. 박스 "자동로드 이미지 데이터를"확인, 시뮬레이션 도구를 시작합니다.
   주 : 프로그램 .csv 파일에서 세포 수 및 평균 기포 크기를 자동으로 판독 할 것이다. 이 값은 "셀 번호"와 "셀 크기 AVG"(그림 5A)에 대한 상자에 표시됩니다.
4. .CSV 파일, 즉, 이름에 공통 요인에 대한 공통 태그를 입력합니다. 회분식 시뮬레이션 표기 화상 세트의 수를 입력한다.
5. (파일 이름 끝 _3과) 기질 채널에서 발생하는 .jpg 파일을로드합니다.
6. DAPI 채널로부터 마스크를 생성하기위한 설정 입력 :
   1. 상자를 "확인? 마스크를 적용 "(10) (- 255 범위 0)에 바이너리 마스크로 DAPI 이미지를 변환하는 임계 값을 설정합니다.
   2. 확인란을 선택합니다 "팽창?" "? 8 비트"상자를 선택하고 5 픽셀로 팽창의 등급을 설정합니다. "/ 침식? w"확인란을 선택합니다.
   3. 시뮬레이션 이미지의 분석에 사용 근방 반경 (이웃 반경)에 대한 원하는 값을 입력한다. (픽셀 스케일링 XY : 0.346 μm의) 2,048 X 2,048 픽셀의 크기 708.15 X 708.15 μm 인 이미지의 경우, 29 PX 10 μm의에 해당합니다.
7. 확인란을 선택합니다 "오오 츠를 사용?"간질 구조를 자동으로 감지 오츠의 알고리즘 ^(17)를 사용합니다.
   주 :이 접촉 부근 툴에 의해 사용되는 동일한 알고리즘이다. 기록 된 화상과 시뮬레이션 화상의 자동 분석에 동일한 이미지 분할 알고리즘을 이용하여 유사한 데이터를 유지하기 위해 중요하다.
8. 아칸소 조혈 세포에 대한 설정을 입력전자는 원형 모양으로 시뮬레이션.
   참고 : 적색, 녹색, 청색 세포의 세포 수를 직접합니다 (5.6 단계) .csv 파일에서로드됩니다.
   1. 적색, 녹색, 청색의 픽셀 셀의 평균 직경을 계산하는 시뮬레이션 툴을 사용한다. 이미지 당 총 세포 수로 나눈 PX의 이미지의 각 세포 유형의 총면적 단일 셀의 평균 면적을 결정한다. 수식을 이용하여 디스크의 반경을 계산하는 평균 면적을 사용한다. 평균 직경을 결정하기 위해 반경 두배.
9. 오브젝트 세그멘테이션 기능을 포함하는 이미지 분석 소프트웨어로 분석 세포 유형의 세포 크기 분포를 측정한다. 모든 조혈 세포 유형 ⁽¹⁸ 및도 5b)에 대한 σ를 결정합니다.
   주 : 기록 셀의 셀 크기 분포는 자동화 된 이미지 분석에 의해 측정되지 않기 때문에, 실제의 분포로 근사 가우스 분포를 사용한다. t의 폭그 분포 곡선은 σ에 의해 설명되고, 다양한 세포 유형에 대해 상당히 상이 할 수있다. (자세한 내용은 그림 5B 참조).
   1. 정지 화상 분석 툴에 의해 전체 셀로서 인식 작은 개체를 설명 PX의 직경이 측정에서, "셀 크기 컷"을 결정한다.
10. 그래픽 사용자 인터페이스 (그림 5A)에 각각의 상자에 매개 변수를 입력합니다.
    1. PX에 직경으로, 차단 셀 크기, 즉, 시뮬레이션에서 허용 최저 셀 크기를 입력한다.
    2. (단계 5.9)에서, 적색, 녹색 및 청색 셀 대 셀 크기 분포의 시뮬레이션 (PX)에서 σ를 입력한다.
    3. 하위 섹션 "마스크 세포"의 "삭제"확인란을 선택합니다. 이 마스크의 출입 금지 영역이 적어도 하나의 픽셀 겹치면이 설정 프로그램이 새로운 셀에 대한 위치를 선택한다. 세포의 중복을 피 "확인란을 선택? ̶1; 하위 섹션 "셀 배제"에.
    4. PX 두 세포의 중심 간의 최소 허용 거리를 입력한다.
       참고 : 최소 거리는 녹화 된 영상에서 결정해야합니다. 잘못 측정 된 최소 거리를 기록하고 시뮬레이션 이미지의 비교에 대한 편견 / 인공 결과로 이어질 것입니다.
    5. 오버랩 중심 중심으로부터 최단 거리에 의해 정의되는 경우 100 %의 최대 오버랩 영역을 설정.
    6. 1000 반복에 대한 시뮬레이션 도구를 설정합니다.
    7. 확인란을 선택합니다 "자동 저장 세포를?".rect 파일 (텍스트 형식)으로 배치의 각 이미지의 모든 반복에 대한 모의 객체의 좌표를 저장합니다. 확인란을 선택합니다 "자동 저장 이미지를?"시뮬레이트 된 각 이미지의 .TIFF 파일을 저장합니다. 저장된 파일에 대한 공통 태그를 입력합니다.
       주 : "? 자동 저장 셀"옵션을 실제 시뮬레이션 IMA를 저장할 때와 비교하여, 시뮬레이션 실행 시간 및 전체 데이터 크기를 줄일GES. .rect 파일은 직사각형으로 모의 셀의 좌표를 저장하고 필요에 따라서 시뮬레이션 이미지로 변환 할 수있다.
11. "실행 시뮬레이션"을 클릭하여 시뮬레이션을 시작합니다.
    주 : 시뮬레이션 도구가 자동 반복 시뮬레이션의 각 세트에 대해 적색, 녹색, 청색 및 간질 세포와, 적색, 녹색 및 청색 셀의 평균 접촉 횟수와 근방 카운트 포함한 모든 이미지의 1000 시뮬레이션을위한 .csv 파일을 생성 . 또한, 모든 값, 표준 편차 (STD)과 평균의 표준 오차 (SEM)과 1,000 시뮬레이션의 평균이 제공됩니다.
12. 연락처 주파수와 1,000 시뮬레이션 이미지 중 하나 세트의 주변 주파수 평균을 결정합니다. 이를 위해, 이미지 당 기록 된 세포 수에 의한 평균 연락처 및 주변 수를 나눕니다. 촬영 된 이미지의 자동화 된 공동 현지화 분석 결과에 주파수를 비교한다.
13. 적절한 쓰레딩 적용분석 ^(19)에 따라 stical 방법은 (그림 7, 우리는 양측 Wilcoxon signed rank test를 사용).

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결과

카와 모토 테이프 방법 undecalcified 뼈의 저온부를 절단 골간뿐만 아니라 함께 골단 영역 모두에서 전체 뼈 여전히 광물 뼈에 부착 내막 영역의 골수, 손상 부분으로 절단되도록 그들의 소주 골의 고밀도 (도 1). 섹션들의 핵 염색 제조에 작은 균열이 완전히 회피 될 수 없지만, 동맥 정현파의 구조뿐만 아니라, 실질의 망상 네트워크를 그대로 유지하는 것이 알 수있다.

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토론

현대 광학 묘화 법의 진보에도 불구하고, 데이터의 조직 학적 분석은 여전히​​ 종종 적절한 정량 도구와 방법의 부족 또는 관심사 작은 영역에 집중 편향된 분석에 의해 방해된다. 여기에 제시된 시너지 효과는 이미지 전체 골수 영역을 커버 분석, 자동 분할 및 다양한 조혈 및 간질 세포 유형, 공동 현지화 분석의 물체 인식, 새로운 관례가 제공하는 비 무작위로 발생하는 접점의 마지막 유효성...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Neomycin	Sigma	N6386 SIGMA	Neomycin trisulfate salt hydrate, EU hazard code: GHS08
Ursovit AD3EC	Serumwerke Bernburg		1 ml contains: 50.000 I.E. retinyl palmitate, 5.000 I.E. cholecalciferol, 30 mg tocopheryl acetate, 100 mg ascorbic acid, 1 mg sorbic acid, 200 mg polyoxyl 35 castor oil, 0,5 mg propyl gallate
Transfer buffer (100 ml PBS, 1 ml 1 M HEPES, 50 U/ml penicillin/streptomycin)	Sigma	P4333, H3375
4-Hydroxy-3-nitrophenylacetyl hapten conjugated to chicken gamma globulin
Chicken gamma globulin (CGG) 100 mg	Rockland	D602-0100
20% Paraformaldehyde solution (EM-grade)	Science Services	15713	EU hazard codes: GHS02, GHS05, GHS07, GHS08
D(+)-sucrose	Carl Roth	4621.1
Dry ice
Acetone	Sigma-Aldrich	179124 SIGMA-ALDRICH	EU hazard codes: GHS02, GHS07
Hexane	Sigma-Aldrich	208752 SIGMA-ALDRICH	EU hazard codes: GHS02, GHS07, GHS08, GHS09
Tissue-Tek cryomolds (standard)	Sakura	4557	25 x 20 x 5 mm
Tissue-Tek O.C.T.	Sakura	4583
Kawamoto's SCEM embedding medium	Section-Lab, JP
Kawamoto's cryosection preparation kit	Section-Lab, JP
Kawamoto's cryofilm type 2C(9)	Section-Lab, JP
Microtome blade MX35 premier plus, low profile	Thermo Scientific	3052835	L X W: 80 x 8 mm (31.5 x 3.13"), thickness: 0.25 mm (0.01")
Polyclonal rabbit anti-RFP antibody, biotinylated	Rockland	600-406-379
Alexa Fluor 555 streptavidin	Life Technologies	S-32355
Rat anti-MBP	J. and N. Lee		available from: J. and N. Lee, Mayo Clinic, Scottsdale, AZ , U.S.A., clone MT-14.7
Goat anti-rat-Alexa Fluor 647	Life Technologies	A-21247
Rat anti-B220 - Alexa Fluor 594			produced and coupled in-house (DRFZ), clone RA3.6B2, Alexa Fluor 594 from Life Technologies
Mouse anti-l1 light chain -FITC			produced and coupled in-house (DRFZ), clone LS136
Rat anti-k light chain - FITC			produced and coupled in-house (DRFZ), clone 187.1
DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)	Sigma	D9542 SIGMA
Fluorescent mounting medium	DAKO	S3023
Cover slips (24 x 24 x 0.13-0.16 mm)	Carl Roth	H875.2
Superfrost slides glasses (75 x 25 mm)	VWR	48311-703
Laser scanning confocal microscope			equipped with laser lines of 405, 488, 561, 594, 633 nm and a 20X/0.8 NA air objective lens. We used a Zeiss LSM710 and Zen 2010 Version 6.0 software.
Automated image analysis tools for bone marrow	Wimasis, Munich		The cell contact tool and cell vicinity tool will be made available by Wimasis upon request.
VC2012 runtime	Microsoft		free download
Simulation tool for random cell positioning			available from us, upon request
Image analysis software with image segmentation functions			We used Volocity (Perkin Elmer) for measuring cell size distributions of hematopoietic cell types in bone marrow (Figure 5). Alternatives are Definiens Image Analysis (Definiens) or Cell Profiler (free download)
Fiji image analysis software			free download. Fiji was used by trained raters for manual cell count (Figure 3).