Automated Quantificação de células hematopoiéticas - Interações de células estromais em imagens histológicas de osso não descalcificadas

Resumo

A strategy to quantitatively analyze histological data in the bone marrow is presented. Confocal microscopy of fluorescently labeled cells in tissue sections results in 2-dimensional images, which are automatically analyzed. Co-localization analyses of different cell types are compared to data from simulated images, giving quantitative information about cellular interactions.

Resumo

A microscopia confocal é o método de escolha para a análise da localização de vários tipos de células presentes nos tecidos complexos, tais como a medula óssea. No entanto, a análise e quantificação de localização celular é difícil, já que em muitos casos, depende de contagem manual, tendo, assim, o risco de introduzir um viés dependente avaliadores e reduzindo a confiabilidade entre examinadores. Além disso, muitas vezes é difícil avaliar se a co-localização entre duas células resulta de posicionamento aleatório, especialmente quando tipos de células diferem fortemente da frequência de sua ocorrência. Aqui, um método para a quantificação isenta de co-localização celular na medula óssea é introduzido. O protocolo descreve a preparação da amostra para se obter secções histológicas de ossos longos de murino inteiros, incluindo a medula óssea, bem como o protocolo de coloração e a aquisição de imagens de alta-resolução. Um fluxo de trabalho de análise que vai desde o reconhecimento da hematopoiética e não hemattipos de células opoietic em 2 dimensões imagens de medula (2D) osso para a quantificação dos contactos directos entre as células é apresentado. Isto também inclui uma análise de vizinhança, para se obter informações sobre o microambiente celular em torno de um determinado tipo de célula. A fim de avaliar se a co-localização dos dois tipos de células é a mera função do posicionamento de célula ou aleatório reflecte associações preferenciais entre as células, uma ferramenta de simulação, que é adequado para testar esta hipótese, no caso de células hematopoiéticas, assim como as células do estroma, é utilizado. Esta abordagem não é limitada para a medula óssea, e pode ser alargado a outros tecidos para permitir a análise reprodutível, quantitativa dos dados histológicos.

Introdução

Devido a recentes desenvolvimentos tecnológicos rápidos na microscopia, incluindo imageamento óptico, a análise de células dentro do contexto de todo o tecido tornou-se cada vez mais acessível para os imunologistas. A caracterização de células individuais em suspensão representa um método valioso e indispensável para compreender a função celular e molecular. No entanto, a análise das células dentro do seu (micro) -anatomical ambiente é essencial para a compreensão das interacções entre os vários tipos de células que colaboram com os processos complexos, tais como o desenvolvimento de respostas imunitárias.

Embora seja relativamente fácil para os microscopistas para obter informações qualitativas a partir de imagens, continua a ser um desafio para quantificar esses dados, em parte devido ao fato de que os métodos de análise neste domínio estão ficando para trás em comparação com o que é possível na aquisição de imagem. Muitos pesquisadores ainda dependem de contagem manual de células em suas imagens de histologia demorado,introduzindo assim uma polarização entre diferentes avaliadores e impedindo a replicação por outros grupos. Muitas vezes, uma imagem representativa é escolhido para sublinhar uma declaração sobre a posição celular ou co-localização em uma publicação, tornando-se difícil para o leitor a julgar a relevância estatística de um evento como esse.

Juntamente com o fato de que o conteúdo de informação completa de dados de imagem são raramente exploradas, que enfatiza a necessidade de uma abordagem mais imparcial, mais rápido e abrangente para analisar imagens histológicas.

A medula óssea é um tecido complexo, que assume as funções vitais importantes como o órgão de hematopoiese em vertebrados adultos. Além de ser o local de nascimento de células hematopoiéticas ^1,2 e desempenhando um papel importante no desenvolvimento de linfócitos B ^3, ele também atua como um local onde as reações imunológicas são iniciados ⁴ e apoia, células de recirculação B maduras ^5. Além disso, o seu papel na manutenção da imemória mmunological tornou-se cada vez mais apreciado na última década, como vários tipos de células que constituem a memória imunológica, foram encontrados para residir ^6-9.

A relação entre a arquitetura complexa do tecido da medula óssea e as suas funções ainda permanece elusiva. Ao contrário de órgãos linfóides secundários, que são organizadas em macro-compartimentos tais como zonas de células T e B, a medula óssea não tem uma macro-compartimentalização clara. Até agora compartimentos distintos na medula óssea são definidos, pela sua proximidade ao córtex do osso ou a vasculatura. A importância das várias populações de células do estroma residentes na medula óssea para um número de processos tais como células estaminais, que suportam o desenvolvimento de células B ou a manutenção de populações de células de memória imunes (tais como células plasmáticas durabilidade (PCs), CD4 ⁺ e CD8 ^+, células T da memória) indica claramente que existe um certo grau de micro-compartimentalização na medula óssea.

Estas observações levaram ao conceito de nichos microanatômico distintas, que são especializados em certas funcionalidades (manutenção de células estaminais, o desenvolvimento de células B em várias fases, e manutenção de memória imunológica) na medula óssea. Embora pareça haver um certo grau de heterogeneidade entre os nichos que servem funções diferentes, alguns dos factores produzidos pelas células estromais, tais como ligando de quimiocina CXC-12 (CXCL12) ou a interleucina 7 (IL-7), são componentes cruciais para vários desses nichos ^10. A visualização e caracterização de células do estroma da medula óssea é difícil devido às suas características morfológicas, com extensões dendríticas longos e finos formando uma rede em toda a medula óssea, e a falta de marcadores apropriados para discriminar subpopulações estromais.

Ainda não está claro até que ponto esses nichos partilham características comuns em relação à sua compositio celular e molecularn, e que elementos tornar um determinado nicho único. Para além das células do estroma, os tipos de células hematopoiéticas tenham sido mostrado desempenhar um papel crucial, fornecendo certos sinais de, pelo menos, para alguns dos nichos. Claramente, a complexidade da composição nicho requer sua análise in situ, e tornou-se cada vez mais importante para imunologistas e hematologistas para aumentar o zoom na microarquitetura de medula óssea, por exemplo, analisando as relações espaciais entre seus componentes celulares.

Aqui, uma estratégia para quantificar co-localização e de vizinhança relações celulares na medula óssea de uma forma automática e imparcial é apresentado. Um fluxo de trabalho detalhadas, incluindo a geração de camundongos quiméricos, que abriga as células fluorescentes estromais e células hematopoiéticas não fluorescentes, preparação de cortes histológicos de ossos não descalcificadas, aquisição de imagens confocal que cobrem o osso inteiro, bem como a análise de imagem automatizado de c celularo-localização e a sua validação / discriminação de posicionamento aleatório por uma ferramenta de simulação é fornecida (Figura 8).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocolo

As experiências com animais foram aprovados pelos comitês estaduais apropriadas para bem-estar animal (Landesamt für Gesundheit und Soziales, Berlin) e foram realizados de acordo com as diretrizes atuais e regulamentos (licença de experiência com animais G0194 / 11).

1. Produção de fluorescente de Medula Óssea Ratos quiméricos

NOTA: A geração de medula óssea fluorescente ratinhos quiméricos para visualizar as células do estroma da medula óssea é realizado tal como descrito antes ^9.

1. Iniciar o tratamento Del-Cre x ratos ROSA-tdRFP (camundongos que expressam a proteína fluorescente vermelha em tandem (tdRFP) ubíqua ^11-13) para prepará-los para a irradiação. Como alternativa, use qualquer outra estirpe com expressão ubíqua da proteína fluorescente. Administrar 1 mg / ml de neomicina e 1 mg / ml de vitaminas (A, D3, E, C) através da água de beber, dois dias antes da irradiação.
2. Irradiar ratos duas vezes com 3.8 cinza com um Césio-137 gamma-irradiador wifina um intervalo de 3 horas. Para este efeito, colocar ratinhos em uma gaiola de torta de irradiação adequados para o respectivo irradiador.
   NOTA: Para a irradiação de ratos, o Instituto não requer anestesia. Siga as políticas institucionais locais referentes à anestesia para irradiação. Tratar os animais com 5 mg / kg por via subcutânea de carprofeno (sc) por dia após a irradiação, se há sinais de dor.
3. No dia seguinte, reconstituir os ratos com uma injecção intravenosa de 3 x 10 ⁶ células da medula óssea preparadas a partir de ossos longos de ratinhos C57BL / 6 dadores em tampão de transferência ^9. Mantenha os ratos sobre Neomicina e vitaminas para até 2 semanas e acompanhar o seu bem-estar e de peso durante este tempo. Aguardar pelo menos 4 semanas para permitir a reconstituição do sistema imunológico, antes de iniciar os tratamentos experimentais específicos (por exemplo, a imunização) ^9.
4. Sacrifício camundongos e colocá-los em uma placa de dissecação, esterilizar as pernas com etanol 70%. Euthanize camundongos, em conformidade com as políticas institucionais locais. Nosso Instituto realiza luxação cervical.
5. Use fórceps e tesouras para remover a pele das coxas. Remover o tecido muscular para expor o osso femoral. Desarticular o osso femoral a partir do quadril e joelho usando uma pinça e tesouras. Tenha cuidado para não quebrar ou cortar o osso.
6. Remova cuidadosamente restantes grandes pedaços de tecido muscular e da cartilagem do osso usando uma tesoura. Remover o tecido muscular remanescente por fricção com o osso papel de seda laboratório. Recolher os ossos limpos em um prato de petri com salina tamponada com fosfato (PBS).
7. Corrigir os ossos do fêmur inteiras em 4% de paraformaldeído (PFA, microscopia eletrônica-grade) para 4-6 horas.
8. Descartar PFA e incubar ossos em 10% de sacarose em PBS S / N. No dia seguinte, incubar os ossos em 20% de sacarose S / N. Um dia depois, incubar os ossos em 30% de sacarose O / N.

2. cryosectioning of Bones

NOTA: Após 16-24 h em 30% de sacarose, congelar os ossos e criocorte-los de acordo com o método de fita de Kawamoto ^14,15.

1. Prepara-se uma proveta grande (2,000 ml de volume) com gelo seco e acetona (cerca de 2: 1 ratio de volume, por exemplo, 400 ml de gelo seco e 200 ml de acetona) sob uma coifa. Coloque um copo pequeno (150-250 ml de volume) com hexano dentro (30-50 ml aproximadamente). Esperar para a mistura arrefecer para baixo (aproximadamente 10 min, até a geada aparece no exterior da proveta grande).
2. Preencha ¾ do cryomold marcado com Super Cryoembedding Médio (SCEM); coloque cuidadosamente os ossos dentro até que sejam totalmente imersa, tomando cuidado para que eles não se tocam as bordas do molde. Com grandes fórceps segurar o cryomold dentro do copo que a parte inferior do molde apenas tocando a superfície do hexano.
   1. Deixe as bordas exteriores do congelamento SCEM (indicado pela opacidade, isto leva cerca de 15 segundos). Em seguida, solte completamente o molde para o hexano e deixá-lo freeze por 1-2 min. Retire a amostra congelada e embrulhe em papel celofane e, em seguida, uma folha de alumínio (para proteger a amostra de secar e para evitar a exposição à luz). Armazenar a -80 ° C até cryosectioning.
3. Para cryosectioning dos ossos do fêmur usar um micrótomo e micrótomo padrão folhas de tecidos duros.
4. Regule a temperatura da amostra e lâmina do micrótomo a -24 ° C. Deixe a amostra sentar dentro do microtome por cerca de 15 min antes do corte.
   1. Fixe o bloco de amostra para o titular da amostra de metal com SCEM ou a temperatura de corte ideal (OCT) médio. Ajustar a orientação do bloco, se necessário. Apare a amostra até que o osso está totalmente aberta e a medula é visível. Ajuste a espessura de corte de 7 mm (rejeitar a primeira seção).
   2. Fixe um pedaço de fita Kawamoto com o lado adesivo na parte superior do bloco de amostra, utilizando uma espátula de madeira veado couro-coberto. Subsequentemente, a amostra cortada e ligar a fita de modo que a secção éLocalizada no lado de cima. Transfira a fita para uma lâmina de vidro usando uma pinça. Fixe a fita para a lâmina de vidro com fita Scotch.
5. Deixe secções secar durante pelo menos 30 min e armazená-las a -80 ° C até utilização. Guarde as lâminas não coradas e desmontados em caixas de plástico slide com espaçadores entre os slides individuais, a fim de evitar que elas se unem. Coradas e montadas lâminas podem ser armazenadas por até uma semana em papelão pastas de slides, a 4 ° C.

Coleção 3. Imagem

1. Descongele e criosecções mancha de acordo com protocolos de imunofluorescência comuns ^9. Incluir um corante nuclear, por exemplo, 4 ', 6-diamidino-2-fenilindole dicloridrato (DAPI) para visualizar a integridade do tecido.
   NOTA: mancha, por exemplo, para RFP para visualizar as células estromais eosinófilos mancha com anti-proteína básica principal (MBP) e anticorpo de rato anti-rato Alexa Fluor 647-anticorpo (anti-anticorpos biotina-RFP e estreptavidina-Alexa Fluor 555), , células Bcom anticorpo de rato anti-B220-Alexa Fluor 594 anticorpo e PCs com luz anti-cadeia κ-fluoresceína-iso-tiocianato (FITC) e anticorpos anti-FITC-λ1 cadeia leve (pormenores do procedimento de coloração são descritos em ^9).
2. Monte secções coradas: colocar uma gota de Fluoromount na seção e, em seguida, cubra com uma tampa de vidro # 1 deslizamento, evitando cuidadosamente a formação de bolhas de ar. Subsequentemente, realizar microscopia confocal de varrimento a laser com um instrumento equipado com linhas de laser adequados para a coloração.
3. Para gravar imagens para análise de co-localização automatizada de células hematopoiéticas da medula óssea com células estromais usando a ferramenta Wimasis, aplicam-se as seguintes definições:
   1. Usar uma lente da objectiva de 20X e um campo de visão de 708,15 x 708,15 mm. Para a análise automatizada, manter o tamanho de todas as imagens consistentes a 2.048 x 2.048 pixels (px), a fim de manter os resultados comparáveis.
   2. Grave um canal para estruturas do estroma (por exemplo, 561 nm, linha de laser), um canal para núcleos (por exemplo, DAPI, a 405 nm) e canais adicionais para as células hematopoiéticas de interesse (por exemplo, três canais, 488/594/633 nm para eosinófilos, células B e PCs).
   3. Gravar imagens utilizando linha média de 4 ^16. O ideal é cobrir toda a seção femoral tomando imagens adjacentes de solteiro. Alternativamente, tirar fotografias não adjacentes de diferentes regiões da medula óssea (diafisária bem como epifisária).
      NOTA: Tenha cuidado para não produzir sobreposições entre imagens adjacentes (para evitar a análise repetida de células nas áreas de sobreposição).
4. Salve as imagens em um formato de arquivo de imagem de microscopia. Verifique e, se necessário, ajustar o contraste para todos os canais no software Visualizador de Imagens / análise.
5. Exportação 3 arquivos .jpg por arquivo de imagem: um arquivo .jpg para o canal DAPI (/ verde / azul formato vermelho (RGB), falso código de cor amarela), um arquivo .jpg para o canal de estroma (escala de cinza) e um .jpg arquivo contendoos canais de células hematopoiéticas (máximo de 3 canais, em formato RGB, por exemplo, FITC (PCs, cor falsa: verde) / Alexa Fluor 594 (células B, cor falsa: azul) / Alexa Fluor 647 (eosinófilos, falsa cor: vermelho)) .

4. Automated Análise de Imagem

1. Use uma ferramenta de análise de imagem para realizar segmentação de imagens, quantificação de co-localização e análise de vizinhança (ver Discussão).
2. Se estiver usando as ferramentas Wimasis, faça o seguinte:
   1. Carregar os conjuntos de 3 ficheiros.jpg por imagem com o mesmo nome de ficheiro seguido por um sublinhado e um número que indica o tipo da imagem.
   2. Use _1 para o arquivo .jpg com células hematopoiéticas, _2 para o arquivo .jpg para o canal DAPI, _3 para o arquivo .jpg para o canal de estroma. Por exemplo: Image1_1.jpg (células hematopoiéticas), Image1_2.jpg (canal DAPI), e Image1_3.jpg (canal de estroma). Faça o upload das imagens através da conta do cliente.
   3. Para contato celular quantificaçãoescolha a ferramenta de contato celular, clicando no respectivo campo. Para arredores célula quantificação, escolha a ferramenta vizinhança da célula e introduzir o raio arredores preferido em um (que é medida a partir de bordas das células).
   4. Faça o download dos resultados.
      NOTA: Os resultados são fornecidos como ficheiros.jpg que mostram as células hematopoiéticas e do canal de estroma com os limites dos objectos detectados realçada, assim como ficheiros.csv individuais contendo as medições para cada imagem, para além de uma síntese que .csv contém os dados para todas as imagens enviadas.
3. A partir do contato medições determinar a freqüência de células hematopoiéticas (vermelho, verde, azul ou células) em contato com as células estromais, ou as freqüências de células vermelhas, verdes, azuis ou entrar em contato com os outros tipos de células hematopoiéticas (Um exemplo é mostrado em resultados representativos , Figura 4). A fim de determinar as freqüências, dividir as contagens de contato dadas por imagem poro total de células conta por imagem.
   1. Para as experiências com ratinhos individuais, soma-se as contagens totais de contacto de todas as imagens para os ratinhos individuais e dividi-los pela soma das contagens de células totais de todas as imagens.
4. A partir das medições arredores, determinar a frequência de células vermelhas, verdes ou azuis na distância seleccionada a partir de células estromais e / ou as frequências de células vermelhas, verdes ou azuis na proximidade preferido para os outros tipos de células hematopoiéticas, tal como descrito no passo 4.3 ( ver também resultados representativos, figura 4).

5. Simulação da Random Medula Óssea Posicionamento

1. Antes de executar as simulações de posicionamento celular aleatória nas imagens histológicas de medula óssea analisados, preparar os seguintes arquivos com antecedência: os únicos arquivos .csv fornecidos pela ferramenta de contacto das células, os arquivos .jpg originais para o canal DAPI e os arquivos .jpg originais para o canal do estroma.
2. A fim de realizarsimulações de grupo em uma série de imagens (por exemplo, todas as imagens a partir de uma seção femoral), recolher todos os arquivos .jpg originais (_1, _2 e _3) e os correspondentes arquivos .csv individuais em uma pasta.
   NOTA: A ferramenta de simulação para o posicionamento de células de medula óssea aleatória está disponível mediante solicitação.
3. Inicie a ferramenta de simulação, marque a caixa "Auto-load de dados de imagem".
   NOTA: O programa irá ler as contagens de células e tamanho médio das células a partir do arquivo .csv automaticamente. Estes valores são exibidos nas caixas para "número de celular" e "tamanho celular AVG" (Figura 5A).
4. Digite o tag comum para os arquivos .csv, ou seja, o fator comum em seus nomes. Digite o número de conjuntos de imagens que devem ser usados ​​para a simulação de modo batch.
5. Carregar o arquivo .jpg gerado a partir do canal de estroma (com nome terminando _3).
6. Introduza as definições para gerar a máscara do canal DAPI:
   1. Marque a caixa "? Aplique a máscara "Definir o limite para converter a imagem DAPI em uma máscara binária a 10 (faixa de 0 - 255).
   2. Marque a caixa "8-bit?" Marque a caixa "Dilate?" E defina o grau de dilatação a 5 px. Marque a caixa "w / erosão?".
   3. Entre o valor desejado para o raio da vizinhança (raio bairro) utilizado para a análise das imagens simuladas. Para uma imagem de 708,15 x 708,15 mm com um tamanho de 2048 x 2048 px (pixel de escala xy: 0,346 mm), 29 px correspondem a 10 um.
7. Caixa de seleção "Usar Otsu?", Para usar o algoritmo de Otsu ¹⁷ para detecção automática de estruturas do estroma.
   NOTA: Este é o mesmo algoritmo que é usado pela ferramenta de contacto e arredores. Usando o mesmo algoritmo de segmentação de imagem na análise automatizada da imagem gravada ea imagem simulado é fundamental a fim de manter os dados comparáveis.
8. Insira as configurações para células hematopoiéticas, que ARe simulado como formas circulares.
   NOTA: Os números de celulares para as células vermelhas, verdes e azuis estão diretamente carregado a partir do arquivo .csv (ver também o passo 5.6).
   1. Utilizar a ferramenta de simulação para calcular o diâmetro médio em px de células vermelhas, verdes e azuis. Para determinar a área média de uma única célula como a área total de cada tipo de célula na imagem em px dividido pela contagem total de células por imagem. Usar a área média para calcular o raio de um disco, utilizando a fórmula. Dobrar o raio para determinar o diâmetro médio.
9. Medir a distribuição de tamanho de célula dos tipos celulares analisados ​​com o software de análise de imagem que inclui funções de segmentação de objectos. Determinar σ para todos os tipos de células hematopoiéticas ⁽¹⁸ e Figura 5B).
   Observação: Uma vez que as distribuições de tamanho de célula das células gravadas não são determinadas pela análise de imagem automatizado, usar uma distribuição de Gauss, como uma aproximação das distribuições reais. A largura de tele curva de distribuição é descrita por σ e pode ser muito diferente para diferentes tipos de células. (Para mais detalhes, consulte a Figura 5B).
   1. A partir destas medições, determinar o "tamanho de célula de corte": o diâmetro em que px descreve o menor objeto ainda reconhecido como uma célula completa pela ferramenta de análise de imagem.
10. Digite os parâmetros nas respectivas caixas na interface gráfica do usuário (Figura 5A).
    1. Digite o tamanho da célula cortado, ou seja, o tamanho mínimo permitido celular na simulação, como um diâmetro em px.
    2. Introduzir σ em px para a simulação da distribuição de tamanho de célula para as células vermelhas, verdes, azuis e (a partir do passo 5.9).
    3. Marque a caixa "Excluir" na subseção "Células em Mask". Com essa configuração, o programa escolheu uma nova posição para uma célula se confunde-se com pelo menos um pixel com uma área de no-go da máscara. Marque a caixa "evitar a sobreposição celular? ̶1; na subseção "exclusão Cell".
    4. Introduza a distância mínima permitida entre os centros das duas células em px.
       NOTA: A distância mínima deve ser determinada a partir das imagens gravadas. Injustamente distâncias mínimas medidas conduzirão a resultados artificiais / tendenciosas para a comparação das imagens gravadas e simulados.
    5. Definir a área máxima de sobreposição de 100%, se a sobreposição é definida pela distância mínima de centro a centro.
    6. Defina a ferramenta de simulação para 1.000 repetições.
    7. Marque a caixa "células de salvamento automático?" Para salvar as coordenadas dos objetos simulados para todas as repetições de cada imagem do lote como arquivos .rect (formato de texto). Marque a caixa "imagens de salvamento automático?" Para salvar um arquivo .tiff para cada imagem simulada. Digite uma tag comum para os arquivos salvos.
       NOTA: O "? Células de salvamento automático" opção reduz simulação executando tempo e tamanho total de dados, em comparação com quando salvar o real simulado images. Os arquivos .rect salvar as coordenadas das células simuladas como rectângulos e pode, assim, ser convertidos em imagens simuladas, se necessário.
11. Inicie a simulação clicando em "simulação Run".
    NOTA: A ferramenta de simulação gera automaticamente um arquivo .csv para os 1.000 simulações de cada imagem, incluindo as contagens de contacto média e contagens arredores de glóbulos vermelhos, verdes e azuis com as células vermelhas, verdes, azuis, e do estroma para cada conjunto de simulações repetidas . Além disso, para todos estes valores, as médias dos 1.000 simulações com desvio-padrão (STD) e erro padrão da média (SEM) são fornecidos.
12. Determinar a frequências de contacto e freqüências arredores de um conjunto de 1.000 imagens simuladas média. Para isso, divida o contato média e conta arredores pela contagem de células gravado por imagem. Comparar as frequências com os resultados da análise de co-localização automática da imagem gravada.
13. Aplicar stati adequadasmétodos stical dependendo da análise de ¹⁹ (para a Figura 7, foi utilizado um Wilcoxon bicaudal assinado teste de classificação).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Resultados

Cortando criocortes de osso descalcificada com o método de Kawamoto fita permite que todo o osso a ser cortado como uma secção intacta, com a medula óssea da região endosteal ainda ligado ao osso mineralizado, tanto na diáfise, bem como nas áreas da epífise com a sua alta densidade do osso trabecular (Figura 1). A coloração nuclear das secções revela que, apesar de pequenas fendas na preparação não pode ser totalmente evitado, a estrutura das artérias e sinusóides, bem como a rede retic...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussão

Apesar dos avanços nos métodos de imagem óptica modernos, a análise dos dados histológico ainda é muitas vezes dificultada pela falta de ferramentas adequadas e métodos de quantificação, ou por análises tendenciosas que se concentram em uma pequena área de interesse. A abordagem sinérgica aqui apresentada combina análise de imagem cobrindo toda a região de medula óssea, a segmentação automatizada e detecção de objectos de vários tipos de células hematopoiéticas e estromais, análise de co-localiza?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Neomycin	Sigma	N6386 SIGMA	Neomycin trisulfate salt hydrate, EU hazard code: GHS08
Ursovit AD3EC	Serumwerke Bernburg		1 ml contains: 50.000 I.E. retinyl palmitate, 5.000 I.E. cholecalciferol, 30 mg tocopheryl acetate, 100 mg ascorbic acid, 1 mg sorbic acid, 200 mg polyoxyl 35 castor oil, 0,5 mg propyl gallate
Transfer buffer (100 ml PBS, 1 ml 1 M HEPES, 50 U/ml penicillin/streptomycin)	Sigma	P4333, H3375
4-Hydroxy-3-nitrophenylacetyl hapten conjugated to chicken gamma globulin
Chicken gamma globulin (CGG) 100 mg	Rockland	D602-0100
20% Paraformaldehyde solution (EM-grade)	Science Services	15713	EU hazard codes: GHS02, GHS05, GHS07, GHS08
D(+)-sucrose	Carl Roth	4621.1
Dry ice
Acetone	Sigma-Aldrich	179124 SIGMA-ALDRICH	EU hazard codes: GHS02, GHS07
Hexane	Sigma-Aldrich	208752 SIGMA-ALDRICH	EU hazard codes: GHS02, GHS07, GHS08, GHS09
Tissue-Tek cryomolds (standard)	Sakura	4557	25 x 20 x 5 mm
Tissue-Tek O.C.T.	Sakura	4583
Kawamoto's SCEM embedding medium	Section-Lab, JP
Kawamoto's cryosection preparation kit	Section-Lab, JP
Kawamoto's cryofilm type 2C(9)	Section-Lab, JP
Microtome blade MX35 premier plus, low profile	Thermo Scientific	3052835	L X W: 80 x 8 mm (31.5 x 3.13"), thickness: 0.25 mm (0.01")
Polyclonal rabbit anti-RFP antibody, biotinylated	Rockland	600-406-379
Alexa Fluor 555 streptavidin	Life Technologies	S-32355
Rat anti-MBP	J. and N. Lee		available from: J. and N. Lee, Mayo Clinic, Scottsdale, AZ , U.S.A., clone MT-14.7
Goat anti-rat-Alexa Fluor 647	Life Technologies	A-21247
Rat anti-B220 - Alexa Fluor 594			produced and coupled in-house (DRFZ), clone RA3.6B2, Alexa Fluor 594 from Life Technologies
Mouse anti-l1 light chain -FITC			produced and coupled in-house (DRFZ), clone LS136
Rat anti-k light chain - FITC			produced and coupled in-house (DRFZ), clone 187.1
DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)	Sigma	D9542 SIGMA
Fluorescent mounting medium	DAKO	S3023
Cover slips (24 x 24 x 0.13-0.16 mm)	Carl Roth	H875.2
Superfrost slides glasses (75 x 25 mm)	VWR	48311-703
Laser scanning confocal microscope			equipped with laser lines of 405, 488, 561, 594, 633 nm and a 20X/0.8 NA air objective lens. We used a Zeiss LSM710 and Zen 2010 Version 6.0 software.
Automated image analysis tools for bone marrow	Wimasis, Munich		The cell contact tool and cell vicinity tool will be made available by Wimasis upon request.
VC2012 runtime	Microsoft		free download
Simulation tool for random cell positioning			available from us, upon request
Image analysis software with image segmentation functions			We used Volocity (Perkin Elmer) for measuring cell size distributions of hematopoietic cell types in bone marrow (Figure 5). Alternatives are Definiens Image Analysis (Definiens) or Cell Profiler (free download)
Fiji image analysis software			free download. Fiji was used by trained raters for manual cell count (Figure 3).