Automated quantificazione di cellule ematopoietiche - Interazioni cellule stromali in istologici Immagini di Undecalcified Bone

Riepilogo

A strategy to quantitatively analyze histological data in the bone marrow is presented. Confocal microscopy of fluorescently labeled cells in tissue sections results in 2-dimensional images, which are automatically analyzed. Co-localization analyses of different cell types are compared to data from simulated images, giving quantitative information about cellular interactions.

Abstract

Microscopia confocale è il metodo di scelta per l'analisi della localizzazione di molteplici tipi di cellule all'interno dei tessuti complessi come il midollo osseo. Tuttavia, l'analisi e la quantificazione di localizzazione cellulare è difficile, come in molti casi si basa sul conteggio manuale, portando così il rischio di introdurre una polarizzazione rater-dipendente e riducendo l'affidabilità interrater. Inoltre, è spesso difficile giudicare se la co-localizzazione tra due celle risultati di posizionamento casuale, soprattutto quando tipi cellulari differiscono fortemente la frequenza del loro verificarsi. Qui, viene introdotto un metodo per la quantificazione obiettiva cellulari co-localizzazione nel midollo osseo. Il protocollo descrive la preparazione del campione utilizzato per ottenere sezioni istologiche di intere murini ossa lunghe, compreso il midollo osseo, così come il protocollo di colorazione e l'acquisizione di immagini ad alta risoluzione. Un flusso di lavoro di analisi che va dal riconoscimento di ematopoietiche e non-hemattipi di cellule opoietic in 2 dimensioni immagini midollo (2D) ossa alla quantificazione dei contatti diretti tra queste cellule è presentato. Questo include anche un'analisi quartiere, per ottenere informazioni sul microambiente cellulare che circonda un certo tipo di cellula. Per valutare se la co-localizzazione di due tipi di cellule è il semplice risultato del posizionamento cella casuale o riflette associazioni preferenziali tra le cellule, uno strumento di simulazione che è adatto per testare questa ipotesi nel caso di ematopoietiche e cellule stromali, è utilizzato. Questo approccio non è limitato al midollo osseo, e può essere estesa ad altri tessuti per consentire riproducibili, analisi quantitativa dei dati istologici.

Introduzione

A causa di recenti sviluppi tecnologici rapidi microscopio, tra cui imaging ottico, l'analisi di cellule nel contesto di tutto il tessuto è diventato sempre più accessibile per immunologi. La caratterizzazione di singole cellule in sospensione rappresenta un metodo prezioso e indispensabile per comprendere la funzione cellulare e molecolare. Tuttavia, l'analisi delle cellule all'interno del loro (micro) ambiente -anatomical è essenziale per la comprensione delle interazioni tra i vari tipi di cellule che collaborano in processi complessi come lo sviluppo delle risposte immunitarie.

Mentre è relativamente facile per microscopisti di ottenere informazioni qualitative da immagini, rimane una sfida per quantificare questi dati, in parte a causa del fatto che i metodi di analisi in questo campo sono in ritardo rispetto a quanto è possibile in acquisizione dell'immagine. Molti ricercatori si affidano ancora a conteggio manuale delle cellule nelle loro immagini istologici che richiede tempo,introducendo così una polarizzazione tra i diversi valutatori e ostacolare la replica da parte di altri gruppi. Spesso, una immagine rappresentativa viene scelto per sottolineare una dichiarazione sulla posizione di cellulare o di co-localizzazione in una pubblicazione, il che rende difficile per il lettore a giudicare la rilevanza statistica di un tale evento.

Insieme con il fatto che l'intero contenuto informazioni di dati dell'immagine è raramente sfruttata, questo sottolinea la necessità di un approccio più imparziale, veloce e completo per analizzare immagini istologiche.

Il midollo osseo è un tessuto complesso, che assume importanti funzioni vitali come organo di ematopoiesi in vertebrati adulti. Oltre ad essere il luogo di nascita di cellule ematopoietiche ^1,2 e giocando un ruolo importante nello sviluppo dei linfociti B ^3, agisce anche come un luogo in cui vengono avviate le reazioni immunitarie ⁴ e supporta, le cellule B mature ricircolo ^5. Inoltre, il suo ruolo nel mantenere imemoria mmunological è diventato sempre più apprezzato negli ultimi dieci anni, come sono stati trovati per soggiornarvi ^6-9 diversi tipi di cellule che costituiscono la memoria immunitaria.

Il rapporto tra l'architettura tissutale complesso del midollo osseo e delle sue funzioni rimangono ancora sfuggente. A differenza di organi linfoidi secondari, che sono organizzati in macro-comparti, come le zone delle cellule T e B, il midollo osseo non ha un chiaro macro-compartimentazione. Finora compartimenti distinti nel midollo osseo sono definite dalla loro vicinanza al corticale ossea o vascolare. L'importanza delle varie popolazioni cellulari stromali residenti nel midollo osseo per un certo numero di processi come le cellule staminali di supporto, sviluppo di cellule B o manutenzione di popolazioni di cellule immunitarie memoria (quali cellule plasmatiche lunga durata (PC), CD4 ⁺ e CD8 ⁺ cellule T di memoria) indica chiaramente che vi sia un certo grado di micro-compartimentalizzazione nel midollo osseo.

Queste osservazioni hanno portato al concetto di nicchie microanatomical distinte, che sono specializzati in alcune funzionalità (staminali mantenimento delle cellule, lo sviluppo delle cellule B in varie fasi, e il mantenimento della memoria immunologica) nel midollo osseo. Anche se sembra esserci una certa eterogeneità tra le nicchie che servono diverse funzioni, alcuni dei fattori prodotte dalle cellule stromali, quali CXC-chemochina legante 12 (CXCL12) o interleuchina 7 (IL-7), sono componenti essenziali per molte di queste nicchie ^10. La visualizzazione e la caratterizzazione delle cellule stromali del midollo osseo è difficile a causa delle loro caratteristiche morfologiche con lunghi, sottili estensioni dendritiche formando una rete attraverso il midollo osseo, e la mancanza di marcatori appropriati per discriminare sottopopolazioni stromali.

Non è ancora chiaro in quale misura queste nicchie condividono caratteristiche comuni rispetto alla loro compositio cellulare e molecolaren, e quali elementi rendono una certa nicchia unico. Oltre alle cellule stromali, tipi di cellule ematopoietiche hanno dimostrato di giocare un ruolo cruciale fornendo alcuni segnali almeno per alcune delle nicchie. Chiaramente, la complessità della composizione nicchia richiede loro analisi in situ, ed è diventato sempre più importante per immunologi e hematologists per ingrandire osseo microarchitettura ossea, ad esempio, analizzando le relazioni spaziali tra i suoi componenti cellulari.

Qui, una strategia per quantificare cellulari co-localizzazione e di vicinato relazioni nel midollo osseo in modo automatizzato e imparziale è presentato. Un flusso di lavoro dettagliate inclusa la generazione di topi chimerici, l'ospitare cellule fluorescenti stromali e cellule ematopoietiche non fluorescenti, preparazione di sezioni istologiche di ossa undecalcified, acquisizione di immagini confocali coprono l'intero osso, così come l'analisi delle immagini automatizzata di c cellulareo-localizzazione e la convalida / discriminazione dal posizionamento casuale per uno strumento di simulazione è fornito (Figura 8).

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Protocollo

Gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dai comitati statali appropriate per il benessere degli animali (Landesamt für Gesundheit und Soziales, Berlino) e sono stati eseguiti in conformità con le linee guida e le disposizioni vigenti (licenza esperimento animale G0194 / 11).

1. Generazione di topi fluorescente Midollo Osseo chimerici

NOTA: La generazione di midollo osseo fluorescente topi chimerici per visualizzare le cellule stromali del midollo osseo viene eseguita come descritto prima delle ^9.

1. Inizia il trattamento di Del-Cre x topi ROSA-tdRFP (topi che esprimono la proteina tandem rosso fluorescente (tdRFP) ubiquitariamente ^11-13) per prepararli per irraggiamento. In alternativa, utilizzare qualsiasi altro ceppo con l'espressione ubiquitaria di proteina fluorescente. Somministrare 1 mg / ml di neomicina e 1 mg / ml di vitamine (A, D3, E, C) attraverso l'acqua potabile due giorni prima irradiazione.
2. Irradiare topi due volte con 3,8 grigio con un Cesio-137 gamma-irradiatore wisottile un intervallo di 3 ore. Per questo, posizionare topi in una gabbia torta irraggiamento adatto per il rispettivo irradiatore.
   NOTA: Per l'irradiazione dei topi, il nostro Istituto non richiede anestesia. Seguire le politiche istituzionali locali riguardanti l'anestesia per l'irradiazione. Trattare gli animali con 5 mg / kg per via sottocutanea di carprofen (sc) al giorno dopo l'irradiazione, se ci sono segni di dolore.
3. Il giorno successivo, ricostituire topi da una iniezione endovenosa di 3 x 10 ⁶ cellule di midollo osseo ottenuti da ossa lunghe di C57BL / 6 topi donatori nel buffer di trasferimento ^9. Mantenere i topi su neomicina e vitamine per un massimo di 2 settimane e monitorare il loro benessere e il peso durante questo periodo. Attendere almeno 4 settimane per consentire la ricostituzione del sistema immunitario prima di iniziare i trattamenti sperimentali specifici (ad esempio, l'immunizzazione) ^9.
4. Sacrificio topi e metterli su una tavola di dissezione, sterilizzare le gambe con il 70% di etanolo. Euthanize topi in conformità con le politiche istituzionali locali. Il nostro Istituto svolge dislocazione cervicale.
5. Utilizzare pinze e forbici per rimuovere la pelle dalle cosce. Rimuovere il tessuto muscolare per esporre l'osso femorale. Luxate l'osso femorale dal dell'anca e del ginocchio con pinze e forbici. Fare attenzione a non rompere o tagliare l'osso.
6. Rimuovere accuratamente restanti grandi pezzi di tessuto muscolare e la cartilagine dall'osso con le forbici. Rimuovere restante tessuto muscolare strofinando l'osso con la carta velina di laboratorio. Raccogliere le ossa pulite in una capsula di Petri con tampone fosfato (PBS).
7. Fissare intere ossa femorali in 4% paraformaldeide (PFA, microscopia elettronica-grade) per 4 - 6 ore.
8. Eliminare PFA e incubare le ossa nel 10% di saccarosio in PBS O / N. Il giorno successivo, incubare le ossa nel 20% di saccarosio O / N. Il giorno dopo, incubare le ossa di 30% di saccarosio O / N.

2. criosezionamento of Bones

NOTA: Dopo 16-24 ore nel 30% di saccarosio, congelare le ossa e cryosection loro secondo il metodo del nastro di Kawamoto ^14,15.

1. Preparare un grande bicchiere (2,000 ml volume) con ghiaccio secco e acetone (circa 2: 1 rapporto in volume, ad esempio, 400 ml di ghiaccio secco e 200 ml di acetone) sotto una cappa aspirante. Mettere un piccolo bicchiere (150-250 ml di volume) con esano interna (30 - 50 ml circa). Attendere la miscela si raffreddi (circa 10 min, fino a visualizzare gelo all'esterno della grande becher).
2. Riempire ¾ della cryomold marcato con Super Cryoembedding Medium (SCEM); posizionare con cura le ossa dentro fino a quando non sono completamente immersi, facendo attenzione che non si tocchino i bordi dello stampo. Con grandi pinze tenere la cryomold nel becher con il fondo dello stampo sfiora la superficie del esano.
   1. Sia i bordi esterni del congelamento SCEM (indicato da opacità, questo richiede circa 15 sec). Poi rilasciare completamente lo stampo in esano e lasciarlo freEze 1 - 2 min. Estrarre il campione congelato e avvolgere nel cellophane e poi un foglio di alluminio (per proteggere il campione dalla disidratazione e per evitare l'esposizione alla luce). Conservare a -80 ° C fino criosezionamento.
3. Per criosezionamento delle ossa femorali utilizzare uno standard di lame microtomo e microtomo per tessuti duri.
4. Impostare la temperatura del campione e la lama del microtomo a -24 ° C. Lasciate riposare il campione all'interno del microtomo per circa 15 minuti prima del taglio.
   1. Fissare il blocco campione al porta-campioni di metallo con SCEM o la temperatura ottimale di taglio (OCT) medio. Regolare l'orientamento del blocco se necessario. Tagliare il campione fino all'osso è completamente aperta e il midollo è visibile. Regolare lo spessore della sezione di 7 micron (scartare la prima sezione).
   2. Fissare un pezzo di nastro Kawamoto con la parte adesiva sulla parte superiore del blocco campione utilizzando una spatola di legno cervi rivestita in cuoio. Successivamente, tagliare il campione e ruotare il nastro in modo che la sezioneposizionato sul lato superiore. Trasferire il nastro di un vetrino con pinze. Fissare il nastro al vetro scorrevole con scotch.
5. Lasciate sezioni asciutti per almeno 30 minuti e conservare a -80 ° C fino al loro utilizzo. Conservare vetrini non colorati e montati in scatole di diapositive di plastica con distanziali tra singole diapositive in modo da evitare che si attaccano insieme. Macchiato e montati diapositive possono essere conservati fino a una settimana in cartone cartelle di diapositive a 4 ° C.

3. Immagine Collection

1. Scongelare e criosezioni macchia secondo protocolli di immunofluorescenza comuni ^9. Includere una macchia nucleare, ad esempio, 4 ', 6-diamidino-2-fenilindolo dicloridrato (DAPI) per visualizzare l'integrità dei tessuti.
   NOTA: Mordente, per esempio, per RFP di visualizzare le cellule stromali (anti-RFP-biotina anticorpi e streptavidina Alexa Fluor 555), eosinofili macchia con topo anti-principale proteina di base (MBP) e anticorpi anti-rat-Alexa Fluor 647 anticorpi cellule B,con il ratto anti-B220-Alexa Fluor 594 anticorpi e PC con la luce anti-κ catena fluoresceina-iso-tiocianato (FITC) e anticorpi catena-FITC luce anti-λ1 (dettagli della procedura di colorazione sono descritti in ^9).
2. Montare sezioni colorate: mettere una goccia di Fluoromount sulla sezione e poi coprire con un # 1 copertura in vetro antiscivolo, evitando accuratamente la formazione di bolle d'aria. Successivamente, effettuare microscopio confocale a scansione laser con uno strumento equipaggiato con linee laser adatti per la colorazione.
3. Al fine di registrare le immagini per l'analisi automatizzata di co-localizzazione di cellule ematopoietiche del midollo osseo con cellule stromali utilizzando lo strumento Wimasis, applicare le seguenti impostazioni:
   1. Utilizzare una lente obiettivo 20X e un campo visivo di 708,15 x 708,15 micron. Per l'analisi automatizzata, mantenere le dimensioni di tutte le immagini coerenti a 2.048 x 2.048 pixel (px) per mantenere i risultati comparabili.
   2. Registra un canale per strutture stromali (es, 561 linea laser nm), un canale per nuclei (ad esempio, DAPI, 405 nm) e canali aggiuntivi per le cellule ematopoietiche di interesse (ad esempio, 3 canali, 488/594/633 nm per eosinofili, cellule B e PC).
   3. Registrare le immagini utilizzando la linea media di 4 ^16. Idealmente, coprono l'intera sezione femorale prendendo immagini adiacenti singoli. In alternativa, scattare foto non adiacenti provenienti da varie regioni del midollo osseo (diafisario e epifisi).
      NOTA: Fare attenzione a non produrre sovrapposizioni tra immagini adiacenti (per evitare analisi ripetute delle cellule nelle zone di sovrapposizione).
4. Salvare le immagini in un formato di file immagine al microscopio. Controllare e, se necessario, regolare il contrasto per tutti i canali del software immagine viewer / analisi.
5. Export 3 file .jpg per file immagine: un file .jpg per il canale DAPI (formato rosso / verde / blu (RGB), falso codice colore in giallo), un file .jpg per il canale stroma (scala di grigi) e uno .jpg file contenentei canali di cellule ematopoietiche (3 canali al massimo, formato RGB, ad esempio, FITC (PC, falsi colori: verde) / Alexa Fluor 594 (cellule B, falsi colori: blu) / Alexa Fluor 647 (eosinofili, falsi colori: rosso)) .

4. Automated Image Analysis

1. Utilizzare uno strumento di analisi di immagine per eseguire la segmentazione di immagini, la quantificazione di co-localizzazione e dintorni analisi (vedi Discussione).
2. Se si utilizzano gli strumenti Wimasis, procedere come segue:
   1. Caricare i set di 3 file .jpg per immagine con lo stesso nome del file seguito da una sottolineatura e da un numero che indica il tipo di immagine.
   2. Utilizzare _1 per il file jpg con le cellule ematopoietiche, _2 per il file .jpg per il canale DAPI, _3 per il file .jpg per il canale stroma. Per esempio: Image1_1.jpg (cellule ematopoietiche), Image1_2.jpg (canale DAPI), e Image1_3.jpg (canale stroma). Carica le immagini attraverso il conto cliente.
   3. Per contatti cell quantificazionescegliere lo strumento di contatto delle cellule cliccando sul rispettivo campo. Per vicinanze cellule quantificazione, scegliere lo strumento vicinanze cellulare e inserire il raggio vicinanze preferito in micron (che si misura dai bordi delle celle).
   4. Scarica i risultati.
      NOTA: I risultati sono forniti come file jpg mostrano le cellule ematopoietiche e il canale stroma i confini degli oggetti rilevati evidenziati, così come file .csv singoli contenenti le misurazioni per ogni immagine, in aggiunta a una sintesi .csv che contiene i dati relativi a tutte le immagini caricate.
3. Dal contatto misurazioni determinano la frequenza di cellule ematopoietiche (rosso, verde, blu) o cellule a contatto con le cellule stromali, o le frequenze di globuli rossi, verdi, blu o contattando gli altri tipi di cellule ematopoietiche (un esempio è mostrato nella Rappresentante dei risultati , Figura 4). Per determinare le frequenze, dividere i dati di contatto conteggi per immagine dala cella totale conta per immagine.
   1. Per gli esperimenti con singoli topi, riassumere i conteggi totali contatto di tutte le immagini da singoli topi e dividere la somma della conta delle cellule totali di tutte le immagini.
4. Dalle misurazioni vicinanze, determinare la frequenza di cellule rosse, verde o blu all'interno della distanza selezionata da cellule stromali e / o le frequenze di globuli rossi, verdi o blu in prossimità preferito agli altri tipi di cellule ematopoietiche come descritto al punto 4.3 ( vedi anche Rappresentante dei risultati, Figura 4).

5. Simulazione di Random Midollo Osseo Posizionamento

1. Prima di eseguire le simulazioni di posizionamento cellulare casuale sul midollo osseo immagini istologiche analizzate, preparare i seguenti file in anticipo: i file .csv singoli forniti dallo strumento di contatto delle cellule, i file .jpg originali per il canale DAPI ei file .jpg originali per il canale stromale.
2. Per effettuaresimulazioni lotti su una serie di immagini (ad esempio, tutte le immagini di una sezione femorale), raccolgono tutti i file originali .jpg (_1, _2 e _3) ei relativi file .csv singoli in una cartella.
   NOTA: Lo strumento di simulazione per il posizionamento di cellule di midollo osseo casuale è disponibile su richiesta.
3. Avviare lo strumento di simulazione, selezionare la casella "Auto-load dati di immagine".
   NOTA: Il programma leggerà i conteggi cellulari e dimensione media delle cellule dal file .csv automaticamente. Questi valori vengono visualizzati nelle caselle per "numero Cell" e "size cellulare AVG" (Figura 5A).
4. Inserisci il tag comune per i file .csv, cioè, il fattore comune nei loro nomi. Inserire il numero di set di immagini che dovrebbero essere utilizzati per la simulazione in modalità batch.
5. Caricare il file .jpg generato dal canale stroma (con il nome del file che termina _3).
6. Immettere le impostazioni per la generazione la maschera dal canale DAPI:
   1. Seleziona la casella "? Applicare maschera "Impostare la soglia per convertire l'immagine DAPI in una maschera binaria a 10 (gamma 0 - 255).
   2. Seleziona la casella "8-bit?" Seleziona la casella "Dilatare?" E impostare il grado di dilatazione di 5 px. Seleziona la casella "w / erosione?".
   3. Inserire il valore desiderato per il raggio vicinanze (raggio quartiere) utilizzati per l'analisi delle immagini simulate. Per un'immagine di 708,15 x 708,15 micron con una dimensione di 2.048 x 2.048 px (pixel scala xy: 0,346 micron), 29 px corrisponde a 10 micron.
7. Casella "Usa Otsu?", Per usare l'algoritmo di Otsu ¹⁷ per il rilevamento automatico delle strutture stromali.
   NOTA: Questo è lo stesso algoritmo utilizzato dallo strumento di contatto e dintorni. Utilizzando lo stesso algoritmo di segmentazione di immagini in analisi automatizzata dell'immagine registrata e l'immagine simulata è cruciale per mantenere i dati comparabili.
8. Immettere le impostazioni per le cellule ematopoietiche, che are simulato come forme circolari.
   NOTA: I numeri di cellulari per i globuli rossi, verdi e blu sono direttamente caricate dal file .csv (vedi anche punto 5.6).
   1. Utilizzare lo strumento di simulazione per calcolare il diametro medio in px dei globuli rossi, verdi e blu. Determinare la superficie media di una singola cella, la superficie complessiva di ogni tipo di cellula nell'immagine px diviso per il numero totale di cellule per immagine. Utilizzare l'area media per calcolare il raggio del disco usando la formula. Raddoppiare la distanza per determinare il diametro medio.
9. Misurare la distribuzione delle dimensioni delle cellule dei tipi di cellule analizzate con qualsiasi software di analisi delle immagini che include funzioni di segmentazione degli oggetti. Determinare σ per tutti i tipi di cellule ematopoietiche ⁽¹⁸ e Figura 5B).
   NOTA: Poiché le distribuzioni dimensionali cella delle celle registrati non sono determinati dalla analisi di immagine automatica, utilizzare una distribuzione gaussiana come approssimazione delle distribuzioni reali. La larghezza di tegli curva di distribuzione è descritto da σ e può essere molto diverso per i vari tipi di cellule. (Per i dettagli, vedere la Figura 5B).
   1. Da queste misurazioni, determinare il "dimensioni della cella cutoff": il diametro in px che descrive l'oggetto più piccolo ancora riconosciuta come cella completo con lo strumento di analisi dell'immagine.
10. Immettere i parametri nelle rispettive caselle sull'interfaccia utente grafica (Figura 5A).
    1. Inserire la dimensione della cella tagliato, cioè, la dimensione minima consentita celle nella simulazione, come diametro px.
    2. Inserire σ in px per la simulazione della distribuzione delle dimensioni delle cellule per cellule rosse, verde e blu (dal punto 5.9).
    3. Seleziona la casella "Elimina" nella sottosezione "Celle in Maschera". Con questa impostazione, il programma sceglierà una nuova posizione per una cella se si sovrappone con almeno un pixel con una zona no-go della maschera. Seleziona la casella "evitare sovrapposizioni cellulare? ̶1; nella sottosezione "esclusione Cell".
    4. Inserire la distanza minima consentita tra i centri di due cellule in px.
       NOTA: La distanza minima deve essere determinato dalle immagini registrate. Erroneamente distanze minime misurate porteranno a / risultati artificiali parziali per il confronto delle immagini registrate e simulati.
    5. Impostare la massima area di sovrapposizione al 100% se la sovrapposizione è definita dalla distanza minima da centro a centro.
    6. Impostare lo strumento di simulazione a 1.000 ripetizioni.
    7. Selezionare la casella "cellule di salvataggio automatico?" Per salvare le coordinate degli oggetti simulati per tutte le ripetizioni di ogni immagine del lotto come file .rect (in formato testo). Selezionare la casella "immagini di salvataggio automatico?" Per salvare un file TIFF per ciascuna immagine simulata. Immettere un tag comune per i file salvati.
       NOTA: Il "? Cellule di salvataggio automatico" opzione riduce la simulazione in esecuzione il tempo e la dimensione complessiva dei dati, rispetto a quando si salva l'attuale simulato imaGES. I file .rect memorizzare le coordinate delle celle simulati come rettangoli e possono quindi essere convertiti in immagini simulate se necessario.
11. Avviare la simulazione facendo clic su "Esegui simulazione".
    NOTA: Lo strumento di simulazione genera automaticamente un file .csv per 1.000 simulazioni di ogni immagine, compresi i conti di contatto medi e conta vicinanze di globuli rossi, verdi e blu con globuli rossi, verdi, blu, e stromali per ogni serie di simulazioni ripetute . Inoltre, per tutti questi valori, vengono forniti medie dei 1.000 simulazioni con deviazione standard (STD) e l'errore standard della media (SEM).
12. Determinare la media frequenza di contatto e le frequenze vicinanze di un gruppo di 1.000 immagini simulate. Per questo, dividere il contatto media e conta vicinanze del conteggio delle cellule registrate per immagine. Confrontare le frequenze ai risultati dell'analisi co-localizzazione automatizzata dell'immagine registrata.
13. Applicare STATI appropriateMetodi stical funzione dell'analisi del ¹⁹ (per la figura 7, abbiamo usato un Wilcoxon a due code firmato rank test).

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Risultati

Taglio criosezioni di osso undecalcified con il metodo del nastro Kawamoto permette l'osso intero da tagliare come sezione intatta, con midollo osseo della regione endosseo ancora attaccato all'osso mineralizzato, sia nella diafisi nonché nelle zone epifisarie con la loro alta densità trabecolare ossea (Figura 1). Colorazione nucleare delle sezioni rivela che anche se piccole crepe nel preparato non possono essere completamente evitati, la struttura delle sinusoidi e arterie e la rete reticola...

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Discussione

Nonostante i progressi in moderni metodi di imaging ottico, l'analisi dei dati istologica è ancora spesso ostacolato dalla mancanza di strumenti di quantificazione ei modi, o da analisi parziali che si concentrano su una piccola area di interesse. L'approccio sinergico qui presentato combina analisi dell'immagine che copre l'intera regione di midollo osseo, la segmentazione automatica e rilevamento di oggetti di diversi tipi di cellule ematopoietiche e stromali, analisi co-localizzazione, ed infine uno ...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Neomycin	Sigma	N6386 SIGMA	Neomycin trisulfate salt hydrate, EU hazard code: GHS08
Ursovit AD3EC	Serumwerke Bernburg		1 ml contains: 50.000 I.E. retinyl palmitate, 5.000 I.E. cholecalciferol, 30 mg tocopheryl acetate, 100 mg ascorbic acid, 1 mg sorbic acid, 200 mg polyoxyl 35 castor oil, 0,5 mg propyl gallate
Transfer buffer (100 ml PBS, 1 ml 1 M HEPES, 50 U/ml penicillin/streptomycin)	Sigma	P4333, H3375
4-Hydroxy-3-nitrophenylacetyl hapten conjugated to chicken gamma globulin
Chicken gamma globulin (CGG) 100 mg	Rockland	D602-0100
20% Paraformaldehyde solution (EM-grade)	Science Services	15713	EU hazard codes: GHS02, GHS05, GHS07, GHS08
D(+)-sucrose	Carl Roth	4621.1
Dry ice
Acetone	Sigma-Aldrich	179124 SIGMA-ALDRICH	EU hazard codes: GHS02, GHS07
Hexane	Sigma-Aldrich	208752 SIGMA-ALDRICH	EU hazard codes: GHS02, GHS07, GHS08, GHS09
Tissue-Tek cryomolds (standard)	Sakura	4557	25 x 20 x 5 mm
Tissue-Tek O.C.T.	Sakura	4583
Kawamoto's SCEM embedding medium	Section-Lab, JP
Kawamoto's cryosection preparation kit	Section-Lab, JP
Kawamoto's cryofilm type 2C(9)	Section-Lab, JP
Microtome blade MX35 premier plus, low profile	Thermo Scientific	3052835	L X W: 80 x 8 mm (31.5 x 3.13"), thickness: 0.25 mm (0.01")
Polyclonal rabbit anti-RFP antibody, biotinylated	Rockland	600-406-379
Alexa Fluor 555 streptavidin	Life Technologies	S-32355
Rat anti-MBP	J. and N. Lee		available from: J. and N. Lee, Mayo Clinic, Scottsdale, AZ , U.S.A., clone MT-14.7
Goat anti-rat-Alexa Fluor 647	Life Technologies	A-21247
Rat anti-B220 - Alexa Fluor 594			produced and coupled in-house (DRFZ), clone RA3.6B2, Alexa Fluor 594 from Life Technologies
Mouse anti-l1 light chain -FITC			produced and coupled in-house (DRFZ), clone LS136
Rat anti-k light chain - FITC			produced and coupled in-house (DRFZ), clone 187.1
DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)	Sigma	D9542 SIGMA
Fluorescent mounting medium	DAKO	S3023
Cover slips (24 x 24 x 0.13-0.16 mm)	Carl Roth	H875.2
Superfrost slides glasses (75 x 25 mm)	VWR	48311-703
Laser scanning confocal microscope			equipped with laser lines of 405, 488, 561, 594, 633 nm and a 20X/0.8 NA air objective lens. We used a Zeiss LSM710 and Zen 2010 Version 6.0 software.
Automated image analysis tools for bone marrow	Wimasis, Munich		The cell contact tool and cell vicinity tool will be made available by Wimasis upon request.
VC2012 runtime	Microsoft		free download
Simulation tool for random cell positioning			available from us, upon request
Image analysis software with image segmentation functions			We used Volocity (Perkin Elmer) for measuring cell size distributions of hematopoietic cell types in bone marrow (Figure 5). Alternatives are Definiens Image Analysis (Definiens) or Cell Profiler (free download)
Fiji image analysis software			free download. Fiji was used by trained raters for manual cell count (Figure 3).