אוטומטי כימות של תא המטופואטיות - אינטראקציות תא סטרומה בתמונות היסטולוגית של עצם Undecalcified

Summary

A strategy to quantitatively analyze histological data in the bone marrow is presented. Confocal microscopy of fluorescently labeled cells in tissue sections results in 2-dimensional images, which are automatically analyzed. Co-localization analyses of different cell types are compared to data from simulated images, giving quantitative information about cellular interactions.

Abstract

מיקרוסקופיה Confocal היא שיטת בחירה של הניתוח של לוקליזציה של סוגי תאים מרובים בתוך רקמות מורכבות כמו מוח העצם. עם זאת, הניתוח והכימות של לוקליזציה סלולרית הוא קשה, כמו במקרים רבים הוא מסתמך על ספירה ידנית, ובכך נושא בסיכון של החדרת הטיה מדרג תלוי והפחתת אמינות interrater. יתר על כן, לעתים קרובות קשה לשפוט אם שיתוף הלוקליזציה בין שני תאי תוצאות ממיקום אקראי, במיוחד כאשר סוגי תאים שונים מאוד בתדירות הופעתם. כאן, שיטה לכימות משוחדת של שיתוף לוקליזציה סלולרית במח העצם הוא הציג. הפרוטוקול מתאר את הכנת המדגם ששמשה לסעיפים היסטולוגית של עצמות ארוכות עכבריות כל כוללים מח העצם, כמו גם את הפרוטוקול מכתים ורכישה של תמונות ברזולוציה גבוהה. עבודה ניתוח פורש מההכרה בhematopoietic ולא hematסוגי תאי opoietic בתמונות מח 2 ממדי עצם (2D) לכימות של מגעים הישירים בין התאים אלה מוצגים. זה כולל גם ניתוח שכונה, כדי לקבל מידע על מייקרו-הסביבה הסלולרית המקיפה סוג תא מסוים. על מנת להעריך האם שיתוף לוקליזציה של שני סוגי תאים היא התוצאה בלבד של מיצוב תא אקראי או משקפת עמותות מועדפים בין התאים, כלי סימולציה אשר מתאים לבדיקת השערה זו במקרה של היווצרות הדם, כמו גם תאי סטרומה, הוא בשימוש. גישה זו אינה מוגבלת למוח העצם, וניתן להרחיב לרקמות אחרות, כדי לאפשר ניתוח לשחזור, כמותי של נתונים היסטולוגית.

Introduction

בשל ההתפתחויות האחרונות טכנולוגיות מהירות במיקרוסקופ, כוללים הדמיה אופטית, הניתוח של תאים בהקשר של כל הרקמה הפך לנגיש יותר ויותר לאימונולוגים. האפיון של תאים בודדים בהשעיה מייצג שיטת ערך והחיונית להבנת תפקוד תאי ומולקולרי. עם זאת, הניתוח של התאים בתוך סביבת -anatomical (מיקרו) שלהם הוא חיוני להבנת יחסי הגומלין בין סוגי תאים שונים המשתפים פעולה בתהליכים מורכבים כגון הפיתוח של מערכת חיסונית.

אמנם קל יחסית לmicroscopists להשיג מידע איכותי מתמונות, זה עדיין מהווה אתגר לכמת נתונים אלה, בין ההיתר בשל העובדה ששיטות ניתוח בתחום זה מפגרות מאחור בהשוואה למה שאפשרי ברכישת תמונה. חוקרים רבים עדיין מסתמכים על ספירת תאים ידנית בתמונות היסטולוגיה זמן רב,כך מציג הטיה בין מדרגים שונים ופוגע שכפול על ידי קבוצות אחרות. לעתים קרובות, תמונה אחת נציג נבחרה כדי להדגיש הצהרה על עמדה סלולרית או שיתוף לוקליזציה בפרסום, מה שהופך את זה קשה לקורא לשפוט את הרלוונטיות הסטטיסטיות של אירוע כזה.

יחד עם העובדה שתוכן המידע המלא של נתוני תמונה מנוצל לעתים רחוקות, זה מדגיש את הצורך בגישה יותר משוחדת, מהר יותר ומקיפה לנתח תמונות היסטולוגית.

מח העצם הוא רקמה מורכבת, אשר לוקחת על פונקציות חיוניות חשובות כמו האיבר של hematopoiesis בבעלי חוליות מבוגרות. מלבד היותו מקום הולדתו לתאי hematopoietic ^1,2 ולשחק תפקיד חשוב בהתפתחות B לימפוציטים ^3, היא פועלת גם כאתר שבו תגובה חיסונית הם יזמו ⁴ ותומך, הסירקולציה המחודשת תאי B בוגרים ^5. בנוסף, תפקידה בשמירת iזיכרון mmunological הפך ממוערך יותר ויותר בעשור האחרון, כמספר סוגים של תאים המהווים זיכרון חיסוני נמצאו מתגוררים בי ^6-9.

בין הארכיטקטורה המורכבת הרקמה של מוח העצם ואת תפקידיו ביחס עדיין להישאר חמקמק. שלא כמו איברי הלימפה משניים, אשר מאורגנים במקרו-תאים כגון אזורי תא T ו- B, מח העצם חסר מאקרו-מידור ברור. עד כה תאים שונים במוח עצם מוגדרים על ידי קרבתם לקליפת מוח העצם או לכלי דם. החשיבות של אוכלוסיות תאי סטרומה תושב השונות במוח העצם עבור מספר התהליכים כגון תאי גזע תמיכה, פיתוח של תאי B או תחזוקה של אוכלוסיות תאי זיכרון חיסוניים (כגון תאי פלזמה חיים ארוכים (מחשבים), CD4 ⁺ ו CD8 ⁺ תאי T הזיכרון) עולה בבירור כי יש מידה מסוימת של מיקרו-מידור במח העצם.

תצפיות אלה הובילו לרעיון של נישות microanatomical שונות, אשר מתמחים בפונקציות מסוימות (גזע תחזוקת תא, פיתוח תאי B בשלבים שונים, ותחזוקה של זיכרון חיסוני) במח העצם. למרות שנראה שיש מידה מסוימת של הטרוגניות בין הנישות המשרתות פונקציות שונות, חלק מהגורמים המיוצרים על ידי תאי סטרומה, כגון יגנד CXC-chemokine 12 (CXCL12) או interleukin 7 (IL-7), הם מרכיבים חיוניים ל כמה נישות אלה ^10. ההדמיה והאפיון של תאי סטרומה במח העצם קשה בשל תכונות המורפולוגיות שלהם עם סיומות ארוכות, דקות דנדריטים יצירת רשת בכל רחבי מוח העצם, וחוסר הסמנים מתאימים להפלות תת-אוכלוסיות סטרומה.

זה עדיין לא ברור באיזו מידת הנישות הללו חולקות תכונות משותפות ביחס לCompositio התאי והמולקולרי שלהםn, ובו אלמנטים להפוך נישה מסוימת ייחודית. בנוסף לתאי סטרומה, סוגי hematopoietic תא הוכחו לשחק תפקיד מכריע במתן אותות מסוימים לפחות לחלק מהנישות. ברור, את המורכבות של הרכב הנישה דורשת הניתוח שלהם באתר, וזה הפך להיות חשוב יותר ויותר עבור אימונולוגים והמטולוגים כדי להתמקד על מייקרו-ארכיטקטורת מח עצם, למשל, על ידי ניתוח היחסים מרחביים בין המרכיבים התאיים שלה.

כאן, אסטרטגיה לכמת יחסי שיתוף לוקליזציה ושכונה סלולריים במח העצם בצורה אוטומטית ובלתי משוחדת מוצגת. עבודה מפורטת הכולל את הדור של עכברי chimeric, חסת תאי ניאון סטרומה ותאי hematopoietic לא פלורסנט, הכנת סעיפים היסטולוגית מעצמות undecalcified, רכישה של תמונות confocal מכסים את כל העצם, כמו גם ניתוח התמונה האוטומטית של ג הסלולריo-לוקליזציה והאימות / אפליתה ממיקום האקראי על ידי כלי סימולציה מסופקת (איור 8).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

הניסויים בבעלי החיים אושרו על ידי ועדות המדינה המתאימות לרווחת בעלי החיים (Landesamt für Gesundheit und Soziales, ברלין) ובוצעו בהתאם להנחיות ותקנות הנוכחיות (G0194 רישיון ניסוי בבעלי החיים / 11).

1. דור של עכברים פלורסנט מח עצם כימרי

הערה: הדור של עכברי chimeric מח עצם ניאון לדמיין תאי סטרומה מח עצם מתבצעת כפי שתוארה קודם ^9.

1. התחל טיפול דל-Cre x עכברי ROSA-tdRFP (עכברים לבטא חלבון טנדם אדום ניאון (tdRFP) בכל מקום ^11-13) כדי להכין אותם לקרינה. לחלופין, להשתמש בכל זן אחר עם ביטוי בכל מקום של חלבון פלואורסצנטי. נהל 1 מ"ג / מיליליטר של נאומיצין ו1 מ"ג / מיליליטר של ויטמינים (A, D3, E, C) דרך מי שתיית יומיים לפני ההקרנה.
2. מכשיר את העכברים פעמיים עם 3.8 גריי עם wi-גמא irradiator צזיום-137דק מרווח של 3 שעות. לשם כך, למקם את העכברים בכלוב עוגת הקרנה מתאים לirradiator בהתאמה.
   הערה: להקרנה של עכברים, המכון שלנו אינו דורש הרדמה. עקוב מדיניות מוסדית מקומית בנוגע להרדמה להקרנה. לטפל בבעלי חיים עם 5 מ"ג / קילוגרם של תת-עורית carprofen (sc) ליום לאחר ההקרנה אם יש סימנים של כאב.
3. למחרת, מחדש עכברים על ידי הזרקה תוך ורידית של 3 x 10 ⁶ תאי מח עצם שהוכנו מעצמות של עכברי C57BL / 6 תורם רבים בהעברת חיץ ^9. שמור על העכברים בנאומיצין וויטמינים לתקופה של עד 2 שבועות ולעקוב אחר הרווחה והמשקל שלהם בתקופה זו. חכה לפחות 4 שבועות כדי לאפשר לכינון מחדש של מערכת החיסון לפני תחילת הטיפולים הניסיוניים מסוימים (לדוגמא, חיסון) ^9.
4. להקריב את העכברים ומניח אותם על קרש חיתוך, לעקר את הרגליים עם 70% אתנול. Euthanizעכברי דואר בהתאם למדיניות מוסדית מקומית. המכון שלנו מבצע נקע בצוואר הרחם.
5. שימוש במלקחיים ומספריים כדי להסיר את העור מהירכיים. הסרה של רקמת שריר לחשוף את עצם הירך. Luxate עצם הירך ממפרק הירך והברך באמצעות מלקחיים ומספריים. היזהר שלא לשבור או לחתוך את העצם.
6. מוציא בזהירות שנותרה חתיכות גדולות של רקמת שריר וסחוס מהעצם באמצעות מספריים. הסרה של רקמת שריר שנותרה על ידי שפשוף העצם בנייר טישו מעבדה. לאסוף את העצמות ניקו בצלחת פטרי עם ופר פוספט (PBS).
7. תקן את עצמות הירך שלמות בparaformaldehyde 4% (PFA, כיתה מיקרוסקופ אלקטרונים) ל4-6 שעות.
8. בטל PFA דגירה עצמות בסוכרוז 10% ב- PBS O / N. למחרת, דגירה העצמות ב -20% N / O סוכרוז. היום אחרי, דגירה העצמות בN / O סוכרוז 30%.

2. Cryosectioning של עצמות

הערה: לאחר 16-24 שעות בסוכרוז 30%, להקפיא את עצמות וcryosection אותם על פי שיטת הקלטת של Kawamoto ^14,15.

1. הכן כוס גדולה (2,000 מיליליטר נפח) עם קרח יבש ואצטון (כ 2: 1 יחס נפח, למשל, 400 מיליליטר של קרח יבש 200 מ"ל ושל אצטון) מתחת למכסת מנוע קטר. מניחים כוס קטנה (150-250 מיליליטר נפח) עם הקסאן בפנים (30 - 50 מיליליטר כ). חכה לתערובת להתקרר (כ -10 דקות, עד שהכפור מופיע בצד החיצוני של הכוס הגדולה).
2. מלא ¾ של cryomold שכותרתו עם סופר Cryoembedding בינוני (SCEM); זהירות במקום עצמות בפנים עד שהם שקועים לחלוטין, דואגים שהם לא נוגעים בקצוות של העובש. עם מלקחיים גדולים להחזיק cryomold לתוך הכוס עם תחתית התבנית רק נגיעה במשטח של הקסאן.
   1. בואו קצוות החיצוניים של הקפאת SCEM (מסומנת באטימות, זה לוקח בערך 15 שניות). לאחר מכן שחרר באופן מלא את התבנית לתוך הקסאן ולתת לו freEze 1 - 2 דקות. קח את המדגם הקפוא ולעטוף בנייר צלופן ולאחר מכן רדיד אלומיניום (כדי להגן על המדגם מהתייבשות ולהימנע מחשיפה לאור). חנות ב -80 ° C עד cryosectioning.
3. לcryosectioning של עצמות הירך להשתמש להבי microtome וmicrotome סטנדרטיים לרקמות קשות.
4. הגדר את המדגם ולהב הטמפרטורה של microtome ל-24 מעלות צלזיוס. בואו המדגם לשבת בתוך microtome במשך כ -15 דקות לפני החיתוך.
   1. תקן את גוש המדגם לבעל מדגם מתכת עם SCEM או בינוני טמפרטורה אופטימלית חיתוך (אוקטובר). התאם את הכיוון של הבלוק במידת צורך. חתוך את הדגימה עד העצם נפתח במלואו והמח גלוי. התאם את עובי סעיף 7 מיקרומטר (להשליך את החלק הראשון).
   2. תקן את חתיכת סרט Kawamoto עם הצד הדביק בחלק העליון של בלוק המדגם בעזרת מרית עץ מכוסה עור צבי. בהמשך לכך, לחתוך את המדגם ולהפוך את הקלטת כך שהסעיף הואממוקם בצד העליון. העבר את הקלטת לזכוכית שקופית באמצעות מלקחיים. תקן את הקלטת לזכוכית השקופית עם סקוטש.
5. בואו סעיפים להתייבש לפחות 30 דקות ולאחסן אותם ב -80 ° C עד שימוש. אחסן שקופיות בלא כתם ובלתי משובצות בקופסות שקופיות פלסטיק עם מפרידי בין שקופיות בודדות על מנת למנוע שהם להישאר ביחד. שקופיות מוכתמות ורכוב ניתן לאחסן לתקופה של עד שבוע בקרטון תיקיות שקופיות ב 4 מעלות צלזיוס.

אוסף 3. תמונה

1. להפשיר וcryosections כתם על פי פרוטוקולי immunofluorescence נפוצים ^9. כולל כתם גרעיני, למשל, 4, dihydrochloride '6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) כדי לחזות שלמות רקמות.
   הערה: כתם, למשל, לRFP לדמיין תאי סטרומה (אנטי-RFP ביוטין נוגדנים וstreptavidin-Alexa פלואוריד 555), אאוזינופילים כתם עם חלבון בסיסי נוגדן אנטי-עכברוש גדול (MBP) ואנטי-עכברוש-אלקסה פלואוריד 647 נוגדן , תאי Bעם נוגדן אנטי-עכברוש B220-Alexa פלואוריד 594 ומחשבים עם השרשרת והעמסת-iso-thiocyanate אנטי-κ אור (FITC) ונוגדני שרשרת-FITC אור אנטי-λ1 (פירוט שיטת הצביעה מתוארות ^ב9).
2. הר קטעים צבעוניים: לשים טיפה אחת של Fluoromount על הסעיף ואז לכסות עם כיסוי הזכוכית להחליק # 1, תוך הימנעות ההיווצרות של בועות אוויר בזהירות. בהמשך לכך, לבצע מיקרוסקופיה confocal סריקת לייזר עם מכשיר מצויד בקווי לייזר מתאימים לצביעה.
3. כדי להקליט תמונות לניתוח שיתוף לוקליזציה אוטומטית של תאי hematopoietic מח עצם עם תאי סטרומה שימוש באפשרות Wimasis, להחיל את ההגדרות הבאות:
   1. השתמש בעדשה אובייקטיבית 20X ושדה ראייה של 708.15 x 708.15 מיקרומטר. לניתוח אוטומטי, לשמור על הגודל של כל התמונות עולות בקנה אחד ב2,048 x 2,048 פיקסל (px) על מנת לשמור על התוצאות דומות.
   2. להקליט ערוץ אחד למבני סטרומה (למשל, קו 561 nm לייזר), ערוץ אחד לגרעינים (למשל, DAPI, 405 ננומטר) וערוצים נוספים לתאי hematopoietic של עניין (למשל, 3 ערוצים, 488/594/633 ננומטר עבור אאוזינופילים, תאי B ומחשבים).
   3. תמונות שיא באמצעות קו עם ממוצע של 4 ^16. באופן אידיאלי, לכסות את כל סעיף הירך על ידי לקיחת תמונות סמוכות בודדות. לחלופין, לקחת תמונות שאינן סמוכות מאזורים שונים במח העצם (diaphyseal כמו גם epiphyseal).
      הערה: היזהר שלא לייצר חפיפה בין תמונות סמוכות (כדי למנוע ניתוח חוזר ונשנה של תאים באזורים החופפים).
4. שמור את התמונות בפורמט קובץ תמונה מיקרוסקופית. בדוק ואם יש צורך, להתאים ניגוד לכל הערוצים בתוכנת הצופה / ניתוח תמונה.
5. יצוא 3 קבצי jpg לקובץ תמונה: קובץ .jpg אחד עבור ערוץ DAPI (אדום הפורמט / ירוק / כחול (RGB), צבע שווא המקודד בצבע צהוב), קובץ .jpg אחד עבור ערוץ סטרומה (גווני אפור) ו.jpg אחד קובץ המכילהערוצים לתאי hematopoietic (מקסימום 3 ערוצים, בפורמט RGB, למשל, FITC (מחשבים, צבע שווא: ירוק) / Alexa פלואוריד 594 (תאי B, צבע שווא: כחול) / (אאוזינופילים, צבע אלקסה פלואוריד 647 שווא: אדום)) .

4. ניתוח תמונה אוטומטית

1. השתמש בכלי ניתוח תמונה כדי לבצע פילוח תמונה, כימות של שיתוף לוקליזציה וניתוח שכונה (ראה דיון).
2. אם אתם משתמשים בכלי Wimasis, בצע את הפעולות הבאות:
   1. העלה קבוצות של 3 קבצי jpg לכל תמונה עם אותו שם הקובץ ואחריו קו תחתון ומספר המציין את הסוג של התמונה.
   2. השתמש _1 לקובץ .jpg עם תאי דם, _2 עבור קובץ .jpg לערוץ DAPI, _3 לקובץ .jpg לערוץ סטרומה. לדוגמא: Image1_1.jpg (תאי hematopoietic), Image1_2.jpg (ערוץ DAPI), וImage1_3.jpg (ערוץ סטרומה). להעלות את התמונות באמצעות חשבון הלקוח.
   3. לכימותי קשר תאלבחור את הקשר עם תא הכלי על ידי לחיצה על השדה המתאים. לכימות סביבת תא, לבחור את כלי קרבת תא ולהיכנס לרדיוס העדיף הסביבה במיקרומטר (הנמדד מקצוות של התאים).
   4. הורד את התוצאות.
      הערה: קובץ ה- csv התוצאות מסופקות כקבצי jpg מראים את תאי hematopoietic וערוץ stroma עם הגבולות של האובייקטים מזוהים מודגש, כמו גם קבצי ה- csv יחיד המכילים את המידות לכל תמונה, בנוסף לסיכום ש מכיל את הנתונים עבור כל התמונות שהועלו.
3. ממגע מדידות לקבוע את התדירות של תאי hematopoietic (אדום, ירוקים, או בתאים כחולים) במגע עם תאי סטרומה, או התדרים של תאים אדומים, ירוקים, כחולים או פנייה לסוגי תאי hematopoietic האחרים (למשל מוצגים בנציגי תוצאות , איור 4). על מנת לקבוע את התדרים, לחלק את קשר הספירות נתנו לכל תמונה על ידיהתא הכולל סופר לכל תמונה.
   1. בניסויים עם עכברים בודדים, לסכם את קשר הספירה הכוללת של כל התמונות לעכברים בודדים ולחלק אותם בסכום של ספירת תאים כוללת של כל התמונות.
4. ממדידות הסביבה, לקבוע את התדירות של תאים אדומים, ירוקים או כחולים בתוך המרחק שנבחר מתאי סטרומה ו / או התדרים של תאים אדומים, ירוקים או כחולים בקרבה העדיפה סוגי תאים האחרים hematopoietic כמתואר בשלב 4.3 ( ראה גם נציגים תוצאות, איור 4).

5. סימולציה של אקראי מח עצם מיקום

1. לפני ביצוע הסימולציות של מיצוב תא אקראי על תמונות היסטולוגית מח העצם ניתחו, להכין את הקבצים הבאים מראש: קבצי ה- csv יחידים הניתנים על ידי הכלי ליצירת קשר הסלולרי, הקבצים המקוריים .jpg לערוץ DAPI וקבצי jpg המקוריים לערוץ סטרומה.
2. על מנת לבצעסימולציות אצווה על סדרה של תמונות (לדוגמא, את כל התמונות מסעיף אחד הירך), לאסוף את כל הקבצים המקוריים .jpg (_1, _2 ו_3) וקבצי ה- csv אחת המתאים בתיקייה אחת.
   הערה: כלי הסימולציה למיקום תא במח עצם אקראי הינה זמינה לפי בקשה.
3. התחל כלי הסימולציה, סמן את התיבה "נתוני תמונה אוטומטי עומס".
   הערה: התכנית תקרא את ספירת התאים וגודל תא ממוצע מקובץ csv באופן אוטומטי. ערכים אלה מוצגים בתיבות עבור "מספר תא" ו "AVG גודל תא" (איור 5 א).
4. הזן את התג המשותף לקבצי csv, כלומר, הגורם המשותף בשמות שלהם. הזן את מספר סטי תמונה שאמורה לשמש עבור סימולציה מצב אצווה.
5. טען את קובץ .jpg שנוצר מערוץ סטרומה (עם _3 שם הקובץ שהסתיים).
6. הזן את ההגדרות ליצירת המסכה מערוץ DAPI:
   1. סמן את התיבה "? למרוח את המסכה "קבע את הסף להמרת תמונת DAPI למסכת ינארי עד 10 (טווח 0-255).
   2. סמן את התיבה "8 סיביות?" סמן את התיבה "להתרחב?" ולהגדיר את הכיתה של התרחבות עד 5 px. סמן את התיבה "w / שחיקה?".
   3. הזן את הערך הרצוי לרדיוס הסביבה (רדיוס שכונה) שימש לניתוח של התמונות מדומה. לדמותו של 708.15 x 708.15 מיקרומטר עם גודל של 2,048 x 2,048 פיקסלים (XY דרוג פיקסל: .346 מיקרומטר), 29 px מתאים עד 10 מיקרומטר.
7. תיבת סימון "השתמש Otsu?" להשתמש האלגוריתם של Otsu ¹⁷ לזיהוי אוטומטי של מבני סטרומה.
   הערה: זהה אותו האלגוריתם המשמש את הכלי ליצירת קשר וקרבה. השימוש באותו האלגוריתם סגמנטציה בניתוח האוטומטי של התמונה המוקלטת והתמונה מדומה הוא חיוני על מנת לשמור את נתוני השוואה.
8. הזן את ההגדרות לתאי דם, אשר arדואר מדומה כצורות מעגליות.
   הערה: המספרים הסלולריים לתאים אדומים, ירוק וכחול נטענות ישירות מקובץ csv (ראה גם צעד 5.6).
   1. השתמש בכלי הסימולציה לחישוב הקוטר הממוצע בpx של תאים אדומים, ירוק וכחול. לקבוע את השטח הממוצע של תא בודד כפי שהשטח הכולל של כל סוג תא בתמונה בpx מחולק בספירת התאים הכוללת לכל תמונה. השתמש בשטח הממוצע לחשב את הרדיוס של דיסק באמצעות הנוסחה. להכפיל את הרדיוס כדי לקבוע את הקוטר הממוצע.
9. מדוד את התפלגות גודל תא של הסוגים ניתחו תא עם כל תוכנת ניתוח תמונה הכוללת פונקציות פילוח אובייקט. לקבוע σ לכל סוגי תאי hematopoietic ⁽¹⁸ ואיור 5).
   הערה: מאחר שהפצות גודל תא של התאים הרשומים אינן נקבעו על ידי ניתוח תמונה האוטומטי, להשתמש הפצת גאוס כקירוב להפצות אמיתיות. הרוחב של tהוא עקומת ההתפלגות מתוארת על ידי σ ויכולה להיות שונה לגמרי לסוגי תאים שונים. (לפרטים, ראה איור 5).
   1. ממדידות אלה, לקבוע את "הפסקת גודל תא": הקוטר בpx המתאר את האובייקט הקטן ביותר עדיין מוכר כתא שלם על ידי כלי ניתוח תמונה.
10. הזן פרמטרים בתיבות המתאימות בממשק המשתמש הגרפי (איור 5 א ').
    1. הזן את גודל התא מנותק, כלומר, גודל התא המינימאלי מוותר בסימולציה, כקוטר בpx.
    2. הזן σ בpx לסימולציה של התפלגות גודל התא לתאים אדומים, ירוק וכחול (משלב 5.9).
    3. סמן את התיבה "מחק" בסעיף קטן "תאים במסכה". עם הגדרה זו, התכנית בחרה תפקיד חדש לתא אם זה חופף עם פיקסל אחד לפחות בשטח לא ללכת של המסכה. סמן את התיבה "הימנע מחפיפה סלולארי? ̶1; ב" הדרת התא "סעיף קטן.
    4. הזן את המרחק המינימאלי המוותר בין המרכזים של שני תאים בpx.
       הערה: המרחק המינימאלי צריכה להיקבע מהתמונות שתועדו. שלא בצדק מרחקים מינימליים נמדדו יובילו לתוצאות מוטות / מלאכותיות להשוואה של תמונות שתועדו ומדומה.
    5. הגדר את השטח המרבי של חפיפה עד 100% אם החפיפה מוגדרת על ידי המרחק המינימאלי ממרכז למרכז.
    6. הגדר את כלי סימולציה ל1,000 חזרות.
    7. סמן את התיבה "תאי שמירה אוטומטית?" כדי לשמור את הקואורדינטות של האובייקטים מדומים לכל החזרות של כל תמונה של המנה כקבצי .rect (פורמט טקסט). סמן את התיבה "שמירה אוטומטית של התמונות?" לשמור קובץ .tiff עבור כל תמונה מדומה. הזן תג משותף לקבצים שנשמרו.
       הערה: "? תאי שמירה אוטומטית" אפשרות מפחיתה סימולציה זמן ריצה וגודל נתונים כולל, בהשוואה לעת שמירת ima המדומה בפועלGES. קבצי .rect להציל את הקואורדינטות של התאים מדומים כמלבנים ולכן ניתן להמיר את תמונות מדומה במידת הצורך.
11. התחל הסימולציה על ידי לחיצה על "סימולציה הפעלה".
    הערה: כלי הסימולציה יוצרת באופן אוטומטי קובץ csv ל1,000 סימולציות של כל תמונה, כוללים ספירה הממוצעת קשר וספירת קרבה לתאים אדומים, ירוק וכחול עם תאים אדומים, ירוקים, כחולים, וסטרומה לכל סט של סימולציות חוזרות ונשנות . בנוסף, לכל הערכים הללו, ממוצעים של הסימולציות 1000 עם סטיית תקן (STD) וסטיית התקן של ממוצע (SEM) מסופקים.
12. לקבוע את תדרי קשר ותדרי קרבת סט אחד של 1,000 תמונות מדומה הממוצע. לשם כך, לחלק את הקשר ממוצע וספירת סביבה על ידי ספירת התאים נרשמו לכל תמונה. השווה את התדרים לתוצאות ניתוח שיתוף הלוקליזציה האוטומטית של התמונה המוקלטת.
13. החל stati המתאיםשיטות stical בהתאם לניתוח ¹⁹ (לאיור 7, השתמשנו Wilcoxon שני זנב חתם מבחן דרגה).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

חיתוך cryosections של עצם undecalcified עם שיטת קלטת Kawamoto מאפשר כל העצם להיחתך כסעיף בשלמות, עם מח העצם של אזור endosteal עדיין מחובר לעצם mineralized, הן בdiaphysis כמו גם באזורי epiphyseal עימם צפיפות גבוהה של עצם trabecular (איור 1). הכתמה גרעינית של הסעיפים עולה, כי למרות שלא ניתן להימנע מסדקים...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

למרות ההתקדמות בשיטות הדמיה אופטיות מודרניות, הניתוח של נתונים היסטולוגית עדיין לעתים קרובות הפריע חוסר הכלים המתאימים כימות ושיטות, או על ידי ניתוח מוטה המתמקדים באזור קטן של עניין. הגישה סינרגיסטי מוצגת כאן משלבת ניתוח תמונה המכסה את האזור כולו מח עצם, פילוח אוטומ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Neomycin	Sigma	N6386 SIGMA	Neomycin trisulfate salt hydrate, EU hazard code: GHS08
Ursovit AD3EC	Serumwerke Bernburg		1 ml contains: 50.000 I.E. retinyl palmitate, 5.000 I.E. cholecalciferol, 30 mg tocopheryl acetate, 100 mg ascorbic acid, 1 mg sorbic acid, 200 mg polyoxyl 35 castor oil, 0,5 mg propyl gallate
Transfer buffer (100 ml PBS, 1 ml 1 M HEPES, 50 U/ml penicillin/streptomycin)	Sigma	P4333, H3375
4-Hydroxy-3-nitrophenylacetyl hapten conjugated to chicken gamma globulin
Chicken gamma globulin (CGG) 100 mg	Rockland	D602-0100
20% Paraformaldehyde solution (EM-grade)	Science Services	15713	EU hazard codes: GHS02, GHS05, GHS07, GHS08
D(+)-sucrose	Carl Roth	4621.1
Dry ice
Acetone	Sigma-Aldrich	179124 SIGMA-ALDRICH	EU hazard codes: GHS02, GHS07
Hexane	Sigma-Aldrich	208752 SIGMA-ALDRICH	EU hazard codes: GHS02, GHS07, GHS08, GHS09
Tissue-Tek cryomolds (standard)	Sakura	4557	25 x 20 x 5 mm
Tissue-Tek O.C.T.	Sakura	4583
Kawamoto's SCEM embedding medium	Section-Lab, JP
Kawamoto's cryosection preparation kit	Section-Lab, JP
Kawamoto's cryofilm type 2C(9)	Section-Lab, JP
Microtome blade MX35 premier plus, low profile	Thermo Scientific	3052835	L X W: 80 x 8 mm (31.5 x 3.13"), thickness: 0.25 mm (0.01")
Polyclonal rabbit anti-RFP antibody, biotinylated	Rockland	600-406-379
Alexa Fluor 555 streptavidin	Life Technologies	S-32355
Rat anti-MBP	J. and N. Lee		available from: J. and N. Lee, Mayo Clinic, Scottsdale, AZ , U.S.A., clone MT-14.7
Goat anti-rat-Alexa Fluor 647	Life Technologies	A-21247
Rat anti-B220 - Alexa Fluor 594			produced and coupled in-house (DRFZ), clone RA3.6B2, Alexa Fluor 594 from Life Technologies
Mouse anti-l1 light chain -FITC			produced and coupled in-house (DRFZ), clone LS136
Rat anti-k light chain - FITC			produced and coupled in-house (DRFZ), clone 187.1
DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)	Sigma	D9542 SIGMA
Fluorescent mounting medium	DAKO	S3023
Cover slips (24 x 24 x 0.13-0.16 mm)	Carl Roth	H875.2
Superfrost slides glasses (75 x 25 mm)	VWR	48311-703
Laser scanning confocal microscope			equipped with laser lines of 405, 488, 561, 594, 633 nm and a 20X/0.8 NA air objective lens. We used a Zeiss LSM710 and Zen 2010 Version 6.0 software.
Automated image analysis tools for bone marrow	Wimasis, Munich		The cell contact tool and cell vicinity tool will be made available by Wimasis upon request.
VC2012 runtime	Microsoft		free download
Simulation tool for random cell positioning			available from us, upon request
Image analysis software with image segmentation functions			We used Volocity (Perkin Elmer) for measuring cell size distributions of hematopoietic cell types in bone marrow (Figure 5). Alternatives are Definiens Image Analysis (Definiens) or Cell Profiler (free download)
Fiji image analysis software			free download. Fiji was used by trained raters for manual cell count (Figure 3).