JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

A strategy to quantitatively analyze histological data in the bone marrow is presented. Confocal microscopy of fluorescently labeled cells in tissue sections results in 2-dimensional images, which are automatically analyzed. Co-localization analyses of different cell types are compared to data from simulated images, giving quantitative information about cellular interactions.

Аннотация

Конфокальной микроскопии является методом выбора для анализа локализации нескольких типов клеток в пределах сложных тканей, таких как костный мозг. Тем не менее, анализ и количественная оценка клеточной локализации трудно, так как во многих случаях она опирается на ручном подсчете, тем самым принимая риск введения оценщик в зависимости от смещения и снижения надежности Interrater. Кроме того, часто бывает трудно судить о том, в совместной локализации двух клеток приводит из случайного позиционирования, особенно, когда типы клеток сильно различаются по частоте их появления. Здесь способ объективной количественной оценки клеточной совместной локализации в костном мозге вводится. Протокол описывает подготовку образца используется для получения гистологических срезов целых мышиных длинных костей в том числе костного мозга, а также протокол окрашивания и получение изображений высокого разрешения. Рабочий процесс анализа, охватывающих период от признания кроветворной и не-hematopoietic типы клеток в 2-мерных изображений мозга (2D) кости количественной оценки прямых контактов между этими клетками представлена. Это также включает в себя анализ окрестности, чтобы получить информацию о сотовой микросреды, окружающей определенный тип клеток. Для того, чтобы оценить, насколько совместная локализация двух типов клеток является лишь результатом случайного позиционирования клеток или отражает льготных ассоциации между клетками, инструмент моделирования, который предназначен для проверки этой гипотезы в случае гемопоэтических а также стромальных клеток, является используемый. Этот подход не ограничивается костного мозга, и может быть распространен на другие ткани, чтобы обеспечить воспроизводимое, количественный анализ гистологических данных.

Введение

В связи с недавним быстрым развитием технологий в микроскопии, в том числе оптических изображений, анализ клеток в контексте всей ткани становится все более доступным для иммунологов. Характеристика отдельных клеток в суспензии представляет собой ценный и незаменимый метод, чтобы понять, клеточной и молекулярной функции. Тем не менее, анализ клеток в их (микро) -anatomical окружающей среды имеет важное значение для понимания взаимодействия между различными типами клеток, которые сотрудничают в сложных процессах, таких как развитие иммунных реакций.

Хотя это относительно легко микроскописты, чтобы получить качественную информацию из изображений, она остается проблемой для количественной оценки этих данных, отчасти из-за того, что методы анализа в этой области являются отсталыми по сравнению с тем, что можно в приобретении изображений. Многие исследователи до сих пор полагаются на трудоемкого ручного подсчета клеток в их гистологии изображений,Таким образом, введение смещения между разными оценщиками и препятствуя репликации другими группами. Часто один представитель изображение выбрано, чтобы подчеркнуть заявление на сотовый позиции или совместной локализации в публикации, что делает его трудным для чтения, чтобы судить статистической значимости такого события.

Вместе с тем, что подробную информацию содержание данных изображения редко эксплуатируют это подчеркивает необходимость более объективной, быстрее и комплексный подход к анализу гистологических изображений.

Костный мозг комплекс тканей, которые берет на себя важных жизненных функций как орган кроветворения у взрослых позвоночных животных. Помимо того, что родина для гемопоэтических клеток 1,2 и играет важную роль в развитии В-лимфоцитов 3, он также выступает в качестве места, где иммунные реакции инициируются 4 и поддерживает Зрелые, рециркуляции В-клеток 5. Кроме того, его роль в поддержании Immunological памяти становятся все более ценится в последнее десятилетие, поскольку некоторые типы клеток, составляющих иммунной памяти были найдены проживать там 6-9.

Соотношение между комплексной ткани архитектуры костного мозга и его функций все еще остается неясным. В отличие от вторичных лимфоидных органов, которые организованы в макро-купе, таких как Т и В-клеточных зонах, костного мозга не хватает четкого макро-раздробленности. До сих пор различные отсеки в костном мозге определяются их близости к кости коры или в сосудистой. Важность различных групп населения резидентов стромальных клеток в костном мозге в течение ряда процессов, таких, как поддержка стволовых клеток, развитие В-клеток или поддержания популяциях клеток иммунной памяти (например, долгоживущие плазменные клетки (ПК), CD4 + и CD8 + Т-клетки памяти) четко указывает на то, что существует определенная степень микро-компартментализацией в костном мозге.

Эти наблюдения привели к концепции различных микроанатомической ниш, которые специализируются в определенных функциональных (STEM обслуживание клеток, развитие В-клеток на разных стадиях, и обслуживание иммунологической памяти) в костном мозге. Хотя там, кажется, определенная степень неоднородности среди ниш, которые выполняют разные функции, некоторые из факторов, произведенных стромальных клеток, таких как СХС-хемокинов лиганд 12 (CXCL12) или интерлейкина 7 (IL-7), являются важнейшими компонентами для некоторые из этих ниш 10. Визуализация и характеристика стромальных клеток в костном мозге затруднено из-за их морфологических особенностей с длинные, тонкие дендритные расширений формирования сети по всей костного мозга, а также отсутствие соответствующих маркеров для различения стромальных субпопуляций.

Это еще не ясно, в какой степени эти ниши имеют общие черты с точки зрения их клеточной и молекулярной Compositioп, и какие элементы оказывают определенную нишу уникальным. В дополнение к стромальных клеток, гемопоэтических типы клеток, как было показано, чтобы играть решающую роль в обеспечении определенные сигналы по меньшей мере, для некоторых из ниши. Очевидно, что сложность ниши состава требуется их анализ на месте, и это становится все более важным для иммунологов и гематологи, чтобы увеличить микроархитектуры костного мозга, например, путем анализа пространственных отношений между ее клеточных компонентов.

Здесь стратегия для количественной сотовой совместной локализации и окрестности отношения в костном мозге в автоматическом и непредвзято представлена. Подробное рабочий в том числе генерации химерных мышей, несущие флуоресцентные стромальных клеток и не-люминесцентные кроветворных клеток, подготовки гистологических срезов от undecalcified костей, приобретение конфокальных изображений, охватывающих всю кость, а также автоматизированного анализа изображений с сотовойо-локализация и его проверка / с дискриминацией со случайной позиционирования с помощью инструмента моделирования обеспечивается (рисунок 8).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Эксперименты на животных были утверждены соответствующими государственными комитетами по благосостоянию животных (Landesamt für Gesundheit унд Soziales Берлин) и были выполнены в соответствии с действующими принципами и правилами (лицензия животное эксперимент G0194 / 11).

1. Генерация Люминесцентная костного мозга химерных мышей

ПРИМЕЧАНИЕ: поколение люминесцентных костного мозга химерных мышей, чтобы визуализировать стромальных клеток костного мозга костей выполняется, как описано выше 9.

  1. Начните лечения Del-Cre х мышей ROSA-tdRFP (мышей, экспрессирующих тандем красный флуоресцентный белок (tdRFP) повсеместно 11-13), чтобы подготовить их для облучения. Кроме того, можно использовать любой другой штамм с вездесущей выражения флуоресцентного белка. Администрирование 1 мг / мл неомицина и 1 мг / мл витаминов (А, D3, Е, С) с питьевой водой два дня перед облучением.
  2. Облучают мышей дважды 3,8-серый с цезием-137 гамма-облучателя Wiтонкая интервал 3 ч. Для этого поместите мышей в облучения пирога клетке, подходящей для соответствующего излучателя.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При облучении мышей, наш институт не требует анестезии. Соблюдайте местные институциональной политики в отношении обезболивания при облучении. Лечить животных с 5 мг / кг карпрофена подкожно (SC) в день после облучения, если есть признаки боли.
  3. На следующий день, восстановить мышей путем внутривенной инъекции 3 × 10 6 клеток костного мозга, полученных из длинных костей мышей C57BL / 6 мышей-доноров в буфере передачи 9. Держите мышей на неомицин и витамины до 2 недель, и следить за их благополучие и вес в течение этого времени. Подождите, по крайней мере, 4 недели, чтобы для восстановления иммунной системы, прежде чем начать конкретные экспериментальные методы лечения (например, иммунизация) 9.
  4. Жертвоприношение мышей и разместить их на вскрытии борту, стерилизовать ноги с 70% этанола. Euthanizе мышей в соответствии с местными институциональной политики. Наш институт выполняет шейки дислокации.
  5. Используйте пинцет и ножницы, чтобы снять кожу с бедер. Удалить мышечной ткани, чтобы разоблачить бедренную кость. Luxate бедренной кости из тазобедренного и коленного сустава с помощью щипцов и ножниц. Будьте осторожны, чтобы не сломать или вырезать кость.
  6. Тщательно удалите остатки больших кусков мышечной ткани и хряща от кости с помощью ножниц. Удалить остатки мышечной ткани, протирая кость с лабораторией папиросной бумаги. Сбор очищенные кости в чашку Петри с фосфатным буферным солевым раствором (PBS).
  7. Исправить целые бедренных костей в 4% параформальдегида (PFA, электронная микроскопия класса) в течение 4 - 6 ч.
  8. Отменить PFA и инкубировать кости в 10% сахарозы в PBS O / N. На следующий день, инкубировать кости в 20% сахарозы o / n. На следующий день после, инкубировать кости в 30% сахарозы O / N.

2. Cryosectioning Кости

Примечание: После 16 - 24 ч в 30% сахарозы, заморозить кости и cryosection их в соответствии с методом 14,15 ленты Kawamoto-х годов.

  1. Подготовьте большой стакан (2000 мл объема) с сухим льдом и ацетоном (примерно 2: 1 объему, например, 400 мл сухого льда и 200 мл ацетона) под вытяжкой. Нанесите небольшое стакан (150 - 250 мл объема) с гексаном внутри (30 - 50 мл приблизительно). Подождите смеси остыть (примерно 10 мин, пока иней на внешней стороне большой химический стакан, пока не появится).
  2. Заполните ¾ меченого cryomold с супер Cryoembedding среды (SCEM); Аккуратно положите кости внутри, пока они не будут полностью погружены, заботясь о том, чтобы они не касались края формы. При больших щипцов удерживать cryomold в стакан с нижней части пресс-формы только касалась поверхности гексана.
    1. Пусть внешние края SCEM замораживания (указывается непрозрачностью, это занимает около 15 сек). Затем полностью отказаться от плесени в гексане, и пусть это пожарнаяЭз за 1 - 2 мин. Выньте замороженную пробу и завернуть в целлофан, а затем алюминиевая фольга (для защиты образца от высыхания и, чтобы избежать попадания света). Хранить при -80 ° С до cryosectioning.
  3. Для cryosectioning бедренной кости с помощью стандартных микротомных и микротомных лезвия для твердых тканей.
  4. Установите температуру образца и лезвия микротома до -24 ° C. Пусть образец сидеть внутри микротоме течение примерно 15 мин перед разрезанием.
    1. Закрепите блок выборки к держателю образца металла с SCEM или оптимальная температура резания (ОКТ) среды. Регулировка ориентации блока, если это необходимо. Обрежьте образец, пока кости не полностью открыт и виден мозг. Отрегулируйте толщину профиля до 7 мкм (отбросить первый раздел).
    2. Закрепите кусок Kawamoto ленты клейкой стороной на верхней части блока выборок с помощью оленей кожаными деревянной лопаткой. Затем вырезать образец и превратить ленту таким образом, чтобы разделрасположенный на верхней стороне. Трансфер ленту предметное стекло с помощью щипцов. Закрепите ленту на предметное стекло скотчем.
  5. Пусть участки высохнуть в течение не менее 30 мин, и хранить их при температуре -80 ° С до использования. Храните неокрашенных и с неподключенными слайды в пластиковых коробок предметных стекол с прокладками между отдельными горками для того, чтобы избежать этого, они слипаются. Витражи и слайды можно хранить до недели в картонной папки слайд при 4 ° С.

Сборник 3. Изображение

  1. Оттепель и пятен криосрезы в соответствии с общими протоколами иммунофлюоресценции 9. Включите ядерной пятно, например, 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндол дигидрохлорид (DAPI) для визуализации целостности тканей.
    Примечание: пятна, например, для ППП, чтобы визуализировать стромальных клеток (анти-RFP-биотин антитела и стрептавидин-Alexa Fluor 555), пятен эозинофилы с крысиным анти-крупного основного белка (MBP) антителом и анти-крысиного-Alexa Fluor 647 антитела В-клетки,с крыс анти-В220-Alexa Fluor 594 антитела и ПК с анти-κ-легкой цепи флуоресцеина-изо-тиоцианат (FITC) и анти-λ1 легкой цепи-FITC антител (Подробности процедуры окрашивания описаны в 9).
  2. Установите окрашенные срезы: положить одну каплю fluoromount на участке, а затем накройте # 1 стеклянной крышкой скольжения, в то время как тщательно избегая образования воздушных пузырьков. Впоследствии, выполните лазерного сканирования конфокальной микроскопии с помощью инструмента, оснащенного лазерных линий, подходящих для окрашивания.
  3. Для того, чтобы записывать изображения для автоматического анализа совместной локализации костного мозга гемопоэтических клеток с стромальных клеток с помощью инструмента Wimasis, применяются следующие настройки:
    1. Используйте 20X объектив и поле зрения 708,15 х 708,15 мкм. Для автоматизированного анализа, сохранить размер всех изображений в соответствии с 2048 х 2048 пикселя (ПВ), чтобы сохранить результаты сопоставимы.
    2. Запишите один канал для стромальных структур (например, 561 нм лазерный луч), один канал для ядер (например, DAPI, 405 нм) и дополнительные каналы для гемопоэтических клеток, представляющих интерес (например, 3 канала, 488/594/633 нм для эозинофилов, В-клетки и ПК).
    3. Запись изображений с помощью линии в среднем 4 16. В идеале, охватывают весь бедренной раздел по однократных соседних изображений. Кроме того, принимают без соседними кадрами из различных регионов костного мозга (диафизарной а также эпифиза).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не производить дублирование между соседними изображениями (во избежание повторного анализа клеток в пересекающихся областях).
  4. Сохранение изображений в формате файла изображения микроскопии. Проверьте и, при необходимости, отрегулировать контрастность для всех каналов в программном обеспечении просмотра изображений / анализа.
  5. Экспорт 3 .jpg файлов в файле изображении: один .jpg файл для канала DAPI (формат красный / зеленый / синий (RGB), ложные цвета кодируются в желтый), один .jpg файл для стромы канал (градаций серого) и один .jpg Файл, содержащийканалы для гемопоэтических клеток (максимум 3 канала, формат RGB, например, FITC (ПК, ложные цвета: зеленый) / Alexa Fluor 594 (В-клетки, ложные цвета: синий) / Alexa Fluor 647 (эозинофилы, ложные цвета: красный)) ,

4. Автоматизированный анализ изображения

  1. Используйте инструмент для анализа изображения для выполнения сегментации изображения, количественное совместной локализации и анализа окрестности (см обсуждения).
  2. При использовании инструменты Wimasis, выполните следующие действия:
    1. Загрузить наборы 3 .jpg файлов в изображение с таким же именем файла, за которым следует подчеркнуть и цифрой, указывающей тип изображения.
    2. Используйте _1 файла .jpg с кроветворных клеток, _2 файла .jpg для канала DAPI, _3 для файла .jpg для стромы канала. Например: Image1_1.jpg (гемопоэтические клетки), Image1_2.jpg (DAPI канал), и Image1_3.jpg (стромы канал). Загрузите изображения с помощью учетной записи клиента.
    3. Для клеток контактной количественноговыбрать сотовый контактную инструмент, нажав на соответствующее поле. Для клеток окрестности количественного выберите инструмент клеток окрестности и введите предпочитаемый радиус окрестности в мкм (который измеряется от края ячейки ").
    4. Скачать результаты.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Результаты представлены как файлов .jpg, показывая кроветворных клеток и стромы канал с границами обнаруженных объектов выделена, а также отдельных .csv файлов, содержащих измерения для каждого изображения, в дополнение к резюме .csv файл, который содержит данные для всех загруженных изображений.
  3. От контакта измерений определить частоту гемопоэтических клеток (красный, зеленый или синий клеток) в контакте с стромальных клеток, или частот красного, зеленого или синего клеток, контактирующих с другой кроветворных типов клеток (пример показан в представительных результатов , рисунок 4). Для того чтобы определить частоты, делить данного контакта импульсов в изображении,Общая подсчитанных клеток на изображении.
    1. Для экспериментов с отдельными мышей, подвести полный контакт подсчет всех изображений для отдельных мышей и разделить их по сумме общего количество клеток всех снимков.
  4. Из измерений округе, определить частоту красного, зеленого или синего клеток в выбранном расстоянии от стромальных клеток и / или частоты красного, зеленого или синего клеток в предпочтительном близости к другим типам кроветворных клеток, как описано выше в стадии (4,3 смотри также Представитель Результаты, рисунок 4).

5. Моделирование случайных костного мозга позиционирования

  1. Перед выполнением моделирования позиционирования случайной клеток на анализируемом костного мозга гистологических изображений, подготовить следующие файлы в заранее: отдельные CSV-файлы, предоставляемые сотового контактной инструмента, оригинальные файлы .jpg для канала DAPI и оригинальные файлы .jpg для стромы канала.
  2. Для того чтобы выполнитьпакетные моделирование на серии изображений (например, все изображения с одной бедренной секции), собрать все исходные файлы .jpg (_1, _2 и _3) и соответствующие отдельные CSV-файлы в одной папке.
    ПРИМЕЧАНИЕ: инструмент моделирования для позиционирования клеток случайным костного мозга может быть предоставлена ​​по запросу.
  3. Запустите программу моделирования, установите флажок "данных изображения Auto-Load".
    ПРИМЕЧАНИЕ: программа будет читать количества клеток, а средний размер клеток из файла .csv автоматически. Эти значения отображаются в коробках "по номеру сотового" и "размер ячейки AVG" (рис 5А).
  4. Введите общий тег для CSV-файлов, то есть общий фактор в их именах. Введите число наборов изображений, которые должны быть использованы для моделирования в пакетном режиме.
  5. Загрузите файл .jpg, полученные от стромы канал (имя файла оканчивающееся _3).
  6. Введите параметры для генерации маски из канала DAPI:
    1. Установите флажок "? Нанесите маску "Установите порог для преобразования изображения DAPI в двоичной маски 10 (диапазон 0 - 255).
    2. Установите флажок "8-бит?" Флажок "Разбавить?" И установите класс расширения до 5 пикселей. Установите флажок "W / эрозии?".
    3. Введите желаемое значение радиуса окрестности (радиуса окрестности), используемого для анализа смоделированных изображений. Для картинки 708,15 х 708,15 мкм с размером 2048 х 2048 точек (пикселей масштабирования ху: 0,346 мкм), 29 точек соответствуют 10 мкм.
  7. Отметьте "Использовать Оцу?", Чтобы использовать алгоритм Оцу в 17 для автоматического обнаружения стромальных структур.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это тот же алгоритм, который используется контактной и окрестности инструмента. Используя тот же алгоритм сегментации изображения в автоматизированного анализа записанного изображения и моделируемой изображения имеет решающее значение для того, чтобы сохранить данные сопоставимы.
  8. Введите параметры для гемопоэтических клеток, которые Arе моделируется как круглых форм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: число клеток красного, зеленого и синего клеток непосредственно загружаются из файла .csv (см также шаг 5,6).
    1. Используйте инструмент моделирования для расчета среднего диаметра в РХ красных, зеленых и синих клеток. Определить среднюю площадь одной ячейки в качестве общей площади каждого типа клеток в изображении в пикселей, деленное на общее число клеток на изображении. Используйте среднюю площадь для расчета радиуса диска с помощью формулы. Двойной радиус, чтобы определить средний диаметр.
  9. Измерьте распределение пор по размеру анализируемых типов клеток с любым программным обеспечением для анализа изображений, который включает в себя функции объекта сегментации. Определить σ для всех гемопоэтических типах клеток (18 и рис 5B).
    Примечание: Поскольку распределение по размерам клеток записанных клеток определяется не автоматизированного анализа изображений, использовать распределение Гаусса в качестве аппроксимации реальных распределений. Ширина тОн кривая распределения описывается σ и могут быть совершенно разными в различных типах клеток. (Для получения дополнительной информации см рис 5B).
    1. Из этих измерений, определяют "размер ячейки среза": диаметр в PX, который описывает наименьший объект по-прежнему признается в качестве полного клетки с помощью инструмента анализа изображений.
  10. Введите параметры в соответствующих полях на графическом пользовательском интерфейсе (рис 5А).
    1. Введите размер ячейки отрезать, то есть минимальный размер ячейки позволило при моделировании, как диаметр в пикселей.
    2. Введите σ в PX для моделирования распределения по размерам клеток для красного, зеленого и синего клеток (из шага 5.9).
    3. Установите флажок "Удалить" в подразделе "Ячейки в маске". С помощью этой установки, программа выберет новую позицию для ячейки, перекрывает ли он, по крайней мере на один пиксель с запретной зоной маски. Установите флажок "Избегайте клеток перекрытия? ̶1; В подразделе "Cell исключения".
    4. Введите допустимое минимальное расстояние между центрами двух клеток в пикселей.
      ПРИМЕЧАНИЕ: минимальное расстояние должно быть определено из записанных изображений. Неправильно измеренные минимальные расстояния приведет к необъективным / искусственные результатов для сравнения записанных и смоделированные изображения.
    5. Установите максимальную площадь перекрытия до 100%, если перекрытие определяется минимальным расстоянием от центра до центра.
    6. Установите инструмент моделирования для 1000 повторений.
    7. Установите флажок "Авто клетки?", Чтобы сохранить координаты моделируемых объектов для всех повторений каждого образа партии как .rect файлов (текстовый формат). Установите флажок "Авто изображения?", Чтобы сохранить файл .tiff для каждого моделируемого изображения. Введите общий тег для сохраненных файлов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: "? Автосохранения клетки" опция снижает моделирования рабочего времени и общий размер данных, по сравнению с тем, когда сохранения текущего имитации ИмаГЭС. В .rect файлы сохранить координаты моделируемых клеток, прямоугольников, и, если это необходимо, таким образом, могут быть преобразованы в моделируемых изображений.
  11. Запустите моделирование, щелкнув на "Run моделирования".
    ПРИМЕЧАНИЕ: инструмент моделирования автоматически генерирует файл .csv для 1000 моделирования каждого изображения, в том числе средних контактных пунктам и окрестности пунктам для красного, зеленого и синего клеток с красными, зелеными, синими и стромальных клеток для каждого набора повторяющихся моделирования , Кроме того, для всех этих значений, средние значения 1000 моделирования со стандартным отклонением (STD) и стандартной ошибки среднего (SEM) предоставляются.
  12. Определить среднее контактное частоты и окрестности частоты одного набора 1000 смоделированных изображений. Для этого разделите среднюю контакт и окрестности рассчитывает на записанном количества клеток каждого изображения. Сравните частоты результатам автоматизированного анализа совместной локализации записанного изображения.
  13. Применение надлежащих Статиstical методы в зависимости от анализа 19 (для рис 7, мы использовали двусторонний Уилкоксона тест ранга).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Режущие криосрезах из undecalcified кости методом ленточного Kawamoto позволяет весь костный быть сокращены в интактной части, при этом костного мозга эндостальной области все еще прикреплен к минерализованной костной ткани, как в диафизе, а также в районах с эпифизарными их Высокая плотность г...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Несмотря на прогресс в современных оптических методов визуализации, анализа гистологических данных по-прежнему часто затруднено из-за отсутствия надлежащих инструментов количественного и методов, или предвзятых анализов, которые сосредоточены на небольшом участке. Синергетический...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Juan Escribano Navarro is affiliated with Wimasis GmbH, Munich, Germany. The other authors have no conflicts of interest to declare.

Благодарности

Мы благодарим Андреаса Радбрух за ценные обсуждения. Мы благодарны Сабине Gruczek, Патрик Thiemann и Мануэла Ohde за помощь по уходу за животными и Роберт Гюнтер для превосходного технической помощи. Мы благодарим наших квалифицированных рейтинговых агентств Лаура Эме, Jannike Байат-Sarmadi, Каролин Поллок, Катрин Рот, Флоренция паче и Катарина Рог для оценки образцов гистологии и Рэнди Линдквист для корректуры рукописи. Мы благодарим J. Н. Ли, Mayo Clinic, Скоттсдейл, Аризона, США для MBP-специфических антител.

Эта работа была поддержана DFG HA5354 / 4-1, Джими-базовую сеть DFG о предоставлении гранта для прижизненной микроскопии и TRR130 / TP17 и DFG ДЛЯ 2165 (HA5354 / 6-1) на AEHSZ при поддержке Международного Макса Планка Школа инфекционных болезней и иммунологии (IMPRS-IDI), Берлин.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Neomycinfigure-materials-94 SigmaN6386 SIGMANeomycin trisulfate salt hydrate, EU hazard code: GHS08
Ursovit AD3ECSerumwerke Bernburg1 ml contains: 50.000 I.E. retinyl palmitate, 5.000 I.E. cholecalciferol, 30 mg tocopheryl acetate, 100 mg ascorbic acid, 1 mg sorbic acid, 200 mg polyoxyl 35 castor oil, 0,5 mg propyl gallate
Transfer buffer (100 ml PBS, 1 ml 1 M HEPES, 50 U/ml penicillin/streptomycin)figure-materials-648 SigmaP4333, H3375
4-Hydroxy-3-nitrophenylacetyl hapten conjugated to chicken gamma globulin
Chicken gamma globulin (CGG) 100 mgfigure-materials-955 RocklandD602-0100
20% Paraformaldehyde solution (EM-grade)Science Services15713EU hazard codes: GHS02, GHS05, GHS07, GHS08
D(+)-sucrosefigure-materials-1266 Carl Roth4621.1
Dry ice
Acetonefigure-materials-1477 Sigma-Aldrich179124 SIGMA-ALDRICHEU hazard codes: GHS02, GHS07
Hexanefigure-materials-1682 Sigma-Aldrich208752 SIGMA-ALDRICHEU hazard codes: GHS02, GHS07, GHS08, GHS09
Tissue-Tek cryomolds (standard)figure-materials-1922 Sakura455725 x 20 x 5 mm
Tissue-Tek O.C.T.figure-materials-2096 Sakura4583
Kawamoto's SCEM embedding mediumfigure-materials-2280 Section-Lab, JP
Kawamoto's cryosection preparation kit figure-materials-2481 Section-Lab, JP
Kawamoto's cryofilm type 2C(9)figure-materials-2668 Section-Lab, JP
Microtome blade MX35 premier plus, low profilefigure-materials-2870 Thermo Scientific3052835L X W: 80 x 8 mm (31.5 x 3.13"), thickness: 0.25 mm (0.01")
Polyclonal rabbit anti-RFP antibody, biotinylatedfigure-materials-3139 Rockland600-406-379
Alexa Fluor 555 streptavidinfigure-materials-3327 Life TechnologiesS-32355
Rat anti-MBPJ. and N. Leeavailable from: J. and N. Lee, Mayo Clinic, Scottsdale, AZ , U.S.A., clone MT-14.7
Goat anti-rat-Alexa Fluor 647figure-materials-3673 Life TechnologiesA-21247
Rat anti-B220 - Alexa Fluor 594produced and coupled in-house (DRFZ), clone RA3.6B2, Alexa Fluor 594 from Life Technologies
Mouse anti-l1 light chain -FITCproduced and coupled in-house (DRFZ), clone LS136
Rat anti-k light chain - FITCproduced and coupled in-house (DRFZ), clone 187.1
DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)figure-materials-4307 SigmaD9542 SIGMA
Fluorescent mounting mediumfigure-materials-4479 DAKOS3023
Cover slips (24 x 24 x 0.13-0.16 mm)figure-materials-4657 Carl RothH875.2
Superfrost slides glasses (75 x 25 mm)figure-materials-4838 VWR48311-703
Laser scanning confocal microscopeequipped with laser lines of 405, 488, 561, 594, 633 nm and a 20X/0.8 NA air objective lens. We used a Zeiss LSM710 and Zen 2010 Version 6.0 software.
Automated image analysis tools for bone marrowfigure-materials-5256 Wimasis, MunichThe cell contact tool and cell vicinity tool will be made available by Wimasis upon request.
VC2012 runtimeMicrosoftfree download
Simulation tool for random cell positioningavailable from us, upon request
Image analysis software with image segmentation functionsWe used Volocity (Perkin Elmer) for measuring cell size distributions of hematopoietic cell types in bone marrow (Figure 5). Alternatives are Definiens Image Analysis (Definiens) or Cell Profiler (free download)
Fiji image analysis software free download. Fiji was used by trained raters for manual cell count (Figure 3).

Ссылки

  1. Kunisaki, Y., Frenette, P. S. The secrets of the bone marrow niche: Enigmatic niche brings challenge for HSC expansion. Nat Med. 18, 864-865 (2012).
  2. Morrison, S. J., Scadden, D. T. The bone marrow niche for haematopoietic stem cells. Nature. 505, 327-334 (2014).
  3. Tokoyoda, K., Egawa, T., Sugiyama, T., Choi, B. I., Nagasawa, T. Cellular niches controlling B lymphocyte behavior within bone marrow during development. Immunity. 20, 707-718 (2004).
  4. Cariappa, A., et al. Perisinusoidal B cells in the bone marrow participate in T-independent responses to blood-borne microbes. Immunity. 23, 397-407 (2005).
  5. Sapoznikov, A., et al. Perivascular clusters of dendritic cells provide critical survival signals to B cells in bone marrow niches. Nat Immunol. 9, 388-395 (2008).
  6. Tokoyoda, K., et al. Professional memory CD4+ T lymphocytes preferentially reside and rest in the bone marrow. Immunity. 30, 721-730 (2009).
  7. Mazo, I. B., et al. Bone marrow is a major reservoir and site of recruitment for central memory CD8+ T cells. Immunity. 22, 259-270 (2005).
  8. Lin, G. H., et al. Contribution of 4-1BBL on radioresistant cells in providing survival signals through 4-1BB expressed on CD8(+) memory T cells in the bone marrow. Eur J Immunol. 42, 2861-2874 (2012).
  9. Zehentmeier, S., et al. Static and dynamic components synergize to form a stable survival niche for bone marrow plasma cells. Eur J Immunol. 44, 2306-2317 (2014).
  10. Nagasawa, T. Microenvironmental niches in the bone marrow required for B-cell development. Nat Rev Immunol. 6, 107-116 (2006).
  11. Luche, H., Weber, O., Nageswara Rao, T., Blum, C., Fehling, H. J. Faithful activation of an extra-bright red fluorescent protein in 'knock-in' Cre-reporter mice ideally suited for lineage tracing studies. Eur J Immunol. 37, 43-53 (2007).
  12. Schwenk, F., Baron, U., Rajewsky, K. A cre-transgenic mouse strain for the ubiquitous deletion of loxP-flanked gene segments including deletion in germ cells. Nucleic Acids Res. 23, 5080-5081 (1995).
  13. Kawamoto, T. Use of a new adhesive film for the preparation of multi-purpose fresh-frozen sections from hard tissues, whole-animals, insects and plants. Arch Histol Cytol. 66, 123-143 (2003).
  14. Kawamoto, T., Kawamoto, K. Preparation of thin frozen sections from nonfixed and undecalcified hard tissues using Kawamot's film method. Arch Histol Cytol. 1130 (2012), 149-164 (2012).
  15. Smith, C. L., et al. Basic confocal microscopy. Current protocols in neuroscience / editorial board, Jacqueline N. Crawley ... [et al.]. 2 (Unit 2.2), (2001).
  16. Otsu, N. A threshold selection method from gray-level histograms. IEEE Trans. Sys., Man., Cyber. 9, 62-66 (1979).
  17. Hughes, I., Hase, T. Measurements and Their Uncertainties: A Practical Guide To Modern Error Analysis. , Oxford University Press. Oxford, UK. (2010).
  18. Quinn, G. P., Keough, M. J. Experimental Design and Data Analysis for Biologists. , Cambridge University Press. Cambridge, UK. (2002).
  19. Kiel, M. J., Morrison, S. J. Uncertainty in the niches that maintain haematopoietic stem cells. Nat Rev Immunol. 8, 290-301 (2008).
  20. MacQueen, J. B. Some Methods for classification and Analysis of Multivariate Observations. Proceedings of 5th Berkeley Symposium on Mathematical Statistics and Probability Vol. 1. 1965 Jun 21-Jul 18, Statistical Laboratory of the University of California, Berkeley, , University of California Press. Berkeley, CA. 666(1967).
  21. Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450, 56-62 (2007).
  22. Jarjour, M., et al. Fate mapping reveals origin and dynamics of lymph node follicular dendritic cells. J Exp Med. 211, 1109-1122 (2014).
  23. Gerner, M. Y., Kastenmuller, W., Ifrim, I., Kabat, J., Germain, R. N. Histo-cytometry: a method for highly multiplex quantitative tissue imaging analysis applied to dendritic cell subset microanatomy in lymph nodes. Immunity. 37, 364-376 (2012).
  24. Moreau, H. D., et al. Dynamic in situ cytometry uncovers T cell receptor signaling during immunological synapses and kinapses in vivo. Immunity. 37, 351-363 (2012).
  25. Siffrin, V., et al. In vivo imaging of partially reversible th17 cell-induced neuronal dysfunction in the course of encephalomyelitis. Immunity. 33, 424-436 (2010).
  26. Shen, Q., et al. Adult SVZ stem cells lie in a vascular niche: a quantitative analysis of niche cell-cell interactions. Cell Stem Cell. 3, 289-300 (2008).
  27. Danielsson, P. E. Euclidian distance mapping. Computer Graphics and Image Processing. 14, 21(1980).
  28. Tellier, J., Kallies, A. Finding a home for plasma cells - a niche to survive. Eur J Immunol. , (2014).
  29. Winter, O., et al. Megakaryocytes constitute a functional component of a plasma cell niche in the bone marrow. Blood. 116, 1867-1875 (2010).
  30. Rozanski, C. H., et al. Sustained antibody responses depend on CD28 function in bone marrow-resident plasma cells. J Exp Med. 208, 1435-1446 (2011).
  31. Rodriguez Gomez, M., et al. Basophils support the survival of plasma cells in mice. J Immunol. 185, 7180-7185 (2010).
  32. Belnoue, E., et al. Homing and adhesion patterns determine the cellular composition of the bone marrow plasma cell niche. J Immunol. 188, 1283-1291 (2012).
  33. Kohler, A., et al. G-CSF-mediated thrombopoietin release triggers neutrophil motility and mobilization from bone marrow via induction of Cxcr2 ligands. Blood. 117, 4349-4357 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

98cryosectioning

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены