Automatizado Cuantificación de células hematopoyéticas - Interacciones de células del estroma en histológicas Imágenes de descalcificados Hueso

Resumen

A strategy to quantitatively analyze histological data in the bone marrow is presented. Confocal microscopy of fluorescently labeled cells in tissue sections results in 2-dimensional images, which are automatically analyzed. Co-localization analyses of different cell types are compared to data from simulated images, giving quantitative information about cellular interactions.

Resumen

La microscopía confocal es el método de elección para el análisis de la localización de múltiples tipos de células dentro de los tejidos complejos, tales como la médula ósea. Sin embargo, el análisis y la cuantificación de la localización celular es difícil, ya que en muchos casos se basa en el recuento manual, teniendo así el riesgo de introducir un sesgo rater-dependiente y la reducción de la fiabilidad entre. Por otra parte, a menudo es difícil juzgar si la co-localización entre dos células resultados de posicionamiento aleatorio, especialmente cuando los tipos de células se diferencian fuertemente en la frecuencia de su ocurrencia. Aquí, se introduce un método para la cuantificación insesgada de co-localización celular en la médula ósea. El protocolo describe la preparación de la muestra utilizado para obtener secciones histológicas de los huesos largos murinos enteros incluyendo la médula ósea, así como el protocolo de tinción y la adquisición de imágenes de alta resolución. Un flujo de trabajo de análisis que abarca desde el reconocimiento de hematopoyéticas y no hemattipos de células opoietic en imágenes de la médula ósea de 2 dimensiones (2D) a la cuantificación de los contactos directos entre esas células se presenta. Esto también incluye un análisis de vecindad, para obtener información sobre el microambiente celular que rodea a un determinado tipo de célula. Con el fin de evaluar si co-localización de dos tipos de células es el mero resultado de posicionamiento celular aleatoria o refleja asociaciones preferenciales entre las células, una herramienta de simulación que es adecuado para probar esta hipótesis en el caso de hematopoyéticas, así como las células del estroma, es se utiliza. Este enfoque no se limita a la médula ósea, y se puede ampliar a otros tejidos para permitir reproducible análisis, cuantitativa de los datos histológicos.

Introducción

Debido a los rápidos avances tecnológicos recientes en microscopía, incluyendo imágenes ópticas, el análisis de las células dentro del contexto de todo el tejido se ha convertido cada vez más accesible para los inmunólogos. La caracterización de las células individuales en suspensión representa un método valioso e indispensable para entender la función celular y molecular. Sin embargo, el análisis de las células dentro de su (micro) -anatomical medio ambiente es esencial para la comprensión de las interacciones entre los diversos tipos de células que colaboran en procesos complejos, tales como el desarrollo de respuestas inmunes.

Si bien es relativamente fácil para los microscopistas para obtener información cualitativa de las imágenes, sigue siendo un desafío para cuantificar estos datos, en parte debido al hecho de que los métodos de análisis en este campo se están quedando atrás en comparación con lo que es posible en la adquisición de imágenes. Muchos investigadores todavía dependen de tiempo de conteo manual de células en sus imágenes de histología,introduciendo así un sesgo entre los diferentes evaluadores y dificultando la replicación por otros grupos. A menudo, se elige una imagen representativa para subrayar una declaración sobre la posición celular o co-localización en una publicación, por lo que es difícil para el lector a juzgar la relevancia estadística de tal evento.

Junto con el hecho de que el contenido de la información completa de los datos de la imagen raramente explotado, esto pone de relieve la necesidad de un enfoque más imparcial, rápido y completo para analizar imágenes histológicas.

La médula ósea es un tejido complejo, que lleva en funciones vitales importantes como el órgano de la hematopoyesis en los vertebrados adultos. Además de ser el lugar de nacimiento de las células hematopoyéticas ^1,2 y jugar un papel importante en el desarrollo de linfocitos B ^3, que también actúa como un sitio donde se inician ⁴ reacciones inmunes y apoya, células B maduras recirculación ^5. Además, su papel en el mantenimiento imemoria mmunological cada vez más valorada en la última década, ya que se han encontrado varios tipos de células que constituyen la memoria inmune a residir allí ^6-9.

La relación entre el complejo de la arquitectura del tejido de la médula ósea y sus funciones siguen siendo difícil de alcanzar. A diferencia de los órganos linfoides secundarios, que se organizan en la macro-departamentos, tales como zonas de células T y B, la médula ósea carece de una clara macro-compartimentación. Hasta ahora distintos compartimentos en la médula ósea se definen por su proximidad a la corteza del hueso o de la vasculatura. La importancia de las distintas poblaciones de células del estroma residentes en la médula ósea por una serie de procesos tales como las células madre de apoyo, el desarrollo de las células B o el mantenimiento de las poblaciones de células de memoria inmunes (tales como células de plasma de larga vida (PCs), CD4 ⁺ y CD8 ⁺ células T de memoria) indica claramente que existe un cierto grado de micro-compartimentación en la médula ósea.

Estas observaciones han llevado al concepto de nichos microanatómicos distintas, que se especializan en ciertas funcionalidades (células madre de mantenimiento, desarrollo de las células B en varias etapas, y el mantenimiento de la memoria inmunológica) en la médula ósea. Aunque parece que hay un cierto grado de heterogeneidad entre los nichos que sirven para diferentes funciones, algunos de los factores producidos por las células del estroma, como-CXC quimiocinas ligando 12 (CXCL12) o interleucina 7 (IL-7), son componentes cruciales para varios de estos nichos ^10. La visualización y caracterización de células estromales en la médula ósea es difícil debido a sus características morfológicas con largos, las extensiones dendríticas delgada que forma una red a lo largo de la médula ósea, y la falta de marcadores apropiados para discriminar subpoblaciones estromales.

Aún no está claro hasta qué punto estos nichos tienen características comunes con respecto a su compositio celular y molecularn, y qué elementos hacen que un determinado nicho único. Además de las células del estroma, se ha demostrado tipos de células hematopoyéticas a desempeñar un papel crucial al proporcionar ciertas señales al menos para algunos de los nichos. Claramente, la complejidad de la composición nicho requiere su análisis in situ, y se ha convertido cada vez más importante para los inmunólogos y hematólogos para hacer un zoom en la microarquitectura ósea de hueso, por ejemplo, mediante el análisis de las relaciones espaciales entre sus componentes celulares.

Aquí, una estrategia para cuantificar las relaciones co-localización y vecinales celulares en la médula ósea de una forma automática e imparcial se presenta. Un flujo de trabajo detallada, incluyendo la generación de ratones quiméricos, que alberga las células fluorescentes del estroma y células hematopoyéticas no fluorescentes, la preparación de las secciones histológicas de los huesos sin descalcificar, adquisición de imágenes confocales que cubren todo el hueso, así como el análisis de imágenes automatizado de c celularo-localización y su validación / discriminación de colocación al azar por una herramienta de simulación se proporciona (Figura 8).

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Protocolo

Los experimentos con animales fueron aprobadas por los comités estatales apropiadas para el bienestar animal (Landesamt für Gesundheit und Soziales, Berlín) y se realizaron de acuerdo con las directrices y la normativa vigente (licencia experimento con animales G0194 / 11).

1. Generación de ratones quiméricos fluorescente de Médula Ósea

NOTA: La generación de la médula ósea fluorescente ratones quiméricos para visualizar las células estromales de médula ósea se realizó como se describió antes ^9.

1. Comience el tratamiento Del-Cre x ratones ROSA-tdRFP (ratones que expresaban la proteína tándem rojo fluorescente (tdRFP) ubicua ^11-13) a fin de prepararlos para la irradiación. Como alternativa, utilice cualquier otra cepa con expresión ubicua de la proteína fluorescente. Administrar 1 mg / ml de neomicina y 1 mg / ml de vitaminas (A, D3, E, C) a través del agua potable de dos días antes de la irradiación.
2. Irradiar ratones dos veces con 3,8 gris con un irradiador gamma-wi Cesio-137delgada de un intervalo de 3 horas. Para ello, colocar los ratones en una jaula de tarta de la irradiación adecuada para el respectivo irradiador.
   NOTA: Para la irradiación de los ratones, nuestro Instituto no requiere anestesia. Siga las políticas institucionales locales con respecto a la anestesia para la irradiación. Tratar a los animales con 5 mg / kg por vía subcutánea de carprofeno (sc) por día después de la irradiación si hay signos de dolor.
3. El día siguiente, reconstituir ratones mediante una inyección intravenosa de 3 x 10 ⁶ células de médula ósea preparadas a partir de huesos largos de ratones C57BL / 6 ratones donantes en tampón de transferencia ^9. Mantenga los ratones en neomicina y vitaminas para un máximo de 2 semanas y un seguimiento de su bienestar y de peso durante este tiempo. Espere al menos 4 semanas para permitir la reconstitución del sistema inmunológico antes de iniciar los tratamientos experimentales específicas (por ejemplo, la inmunización) ^9.
4. Sacrificar los ratones y colocarlos en una tabla de disección, esterilizar las piernas con etanol al 70%. Euthanize ratones en conformidad con las políticas institucionales locales. Nuestro Instituto realiza dislocación cervical.
5. Utilice pinzas y tijeras para quitar la piel de los muslos. Quitar el tejido muscular para exponer el hueso femoral. Luxate el hueso femoral de la articulación de la cadera y la rodilla utilizando pinzas y tijeras. Tenga cuidado de no romper o cortar el hueso.
6. Para sacar el resto de grandes piezas de tejido muscular y el cartílago del hueso con unas tijeras. Quitar el tejido muscular restante por el roce de los huesos con papel de seda de laboratorio. Recoger los huesos limpios en una placa de Petri con tampón fosfato salino (PBS).
7. Fijar los huesos femorales enteros en 4% de paraformaldehído (PFA, electrón grado microscopía) de 4 - 6 horas.
8. Deseche PFA e incubar huesos en 10% de sacarosa en PBS O / N. El día siguiente, se incuban los huesos en 20% de sacarosa O / N. El día después, incubar los huesos en el 30% de sacarosa O / N.

2. cryosectioning de los Huesos

NOTA: Después de 16 - 24 h en 30% de sacarosa, congelar los huesos y cryosection de acuerdo con el método de cinta de Kawamoto ^14,15.

1. Preparar un vaso de precipitados grande (2000 ml de volumen) con hielo seco y acetona (aproximadamente 2: 1 relación de volumen, por ejemplo, 400 ml de hielo seco y 200 ml de acetona) bajo una campana de humos. Coloque un vaso pequeño (150 a 250 ml de volumen) con hexano en el interior (30 a 50 ml aproximadamente). Esperar a que la mezcla se enfríe (aproximadamente 10 min, hasta que aparezca escarcha en el exterior del vaso de precipitados grande).
2. Llenar ¾ partes de la criomolde etiquetado con Súper Cryoembedding Medio (SCEM); coloque cuidadosamente los huesos en el interior hasta que estén totalmente sumergidos, teniendo cuidado de que no se toquen los bordes del molde. Con grandes fórceps sostener el criomolde en el vaso de precipitados con la parte inferior del molde simplemente tocando la superficie del hexano.
   1. Deje que los bordes exteriores de la congelación SCEM (indicado por la opacidad, esto toma aproximadamente 15 segundos). A continuación, colocar totalmente el molde en el hexano y se deja freeze para 1 - 2 min. Saque la muestra congelada y envolver en papel celofán y luego papel de aluminio (para proteger la muestra se seque y para evitar la exposición a la luz). Conservar a -80 ° C hasta cryosectioning.
3. Para cryosectioning de huesos femorales utilizar un estándar de cuchillas de microtomo y micrótomo para tejidos duros.
4. Establecer la muestra y la cuchilla temperatura del micrótomo a -24 ° C. Deje que la muestra se sientan dentro del microtomo durante aproximadamente 15 minutos antes de cortar.
   1. Fijar el bloque de muestras para el soporte de la muestra de metal con SCEM o la temperatura óptima de corte (OCT) medio. Ajustar la orientación del bloque si es necesario. Recorte la muestra hasta que está totalmente abierta el hueso y la médula ósea es visible. Ajustar el espesor de corte de 7 mm (deseche la primera sección).
   2. Fije un trozo de cinta Kawamoto con el lado adhesivo en la parte superior del bloque de muestras usando una espátula de madera cubiertas de piel de ciervo. Posteriormente, cortar la muestra y gire la cinta de modo que la sección essituado en el lado superior. Transferir la cinta a un portaobjetos de vidrio utilizando fórceps. Fijar la cinta al portaobjetos de vidrio con cinta adhesiva.
5. Deje secciones se sequen durante al menos 30 minutos y se almacenan a -80 ° C hasta su uso. Guarde diapositivas sin teñir y sin montar en cajas de diapositivas de plástico con separadores entre diapositivas individuales con el fin de evitar que se peguen. Manchado y montados diapositivas se pueden almacenar durante un máximo de una semana en cartón carpetas de diapositivas a 4 ° C.

3. Imagen de la colección

1. Descongele y cryosections mancha de acuerdo con los protocolos de inmunofluorescencia comunes ^9. Incluir un tinte nuclear, por ejemplo, 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol dihidrocloruro (DAPI) para visualizar la integridad del tejido.
   NOTA: Mancha, por ejemplo, para RFP para visualizar las células del estroma (anti-RFP-biotina de anticuerpos y estreptavidina-Alexa Fluor 555), la mancha con eosinófilos de rata anti-proteína básica mayor (MBP) y anticuerpo anti-rata-Alexa Fluor 647 anticuerpo , células Bcon la rata anti-B220-Alexa Fluor 594 anticuerpos y PCs con luz anti-κ cadena fluoresceína iso-tiocianato (FITC) y anticuerpos anti-λ1 cadena-FITC luz (detalles del procedimiento de tinción se describen en ^9).
2. Montar las secciones teñidas: poner una gota de Fluoromount en la sección y luego cubra con una cubierta de vidrio antideslizante # 1, al tiempo que evita cuidadosamente la formación de burbujas de aire. Posteriormente, realice láser confocal de microscopía de barrido con un instrumento equipado con líneas de láser adecuados para la tinción.
3. Para grabar imágenes para el análisis de co-localización automatizada de las células hematopoyéticas de la médula ósea con células del estroma con la función Wimasis, aplicar los siguientes ajustes:
   1. Utilice una lente objetivo de 20X y un campo de visión de 708,15 x 708,15 m. Para el análisis automatizado, mantener el tamaño de todas las imágenes consistentes en 2048 x 2048 píxeles (px) con el fin de mantener los resultados comparables.
   2. Grabar un canal para las estructuras del estroma (por ejemplo, 561 nm línea de láser), un canal para núcleos (por ejemplo, DAPI, 405 nm) y los canales adicionales para las células hematopoyéticas de interés (por ejemplo, 3 canales, 488/594/633 nm para eosinófilos, células B y PCs).
   3. Grabar imágenes mediante línea con un promedio de 4 ^16. Lo ideal sería que cubren toda la sección femoral tomando imágenes adyacentes individuales. Otra opción es tomar imágenes no adyacentes de varias regiones de la médula ósea (diáfisis y epífisis).
      NOTA: Tenga cuidado de no producir solapamientos entre las imágenes adyacentes (para evitar el análisis repetido de las células en las áreas de solapamiento).
4. Guarde las imágenes en un formato de archivo de imagen de microscopía. Compruebe y, si es necesario, ajustar el contraste para todos los canales en el software Visor de imágenes / análisis.
5. Exportación 3 archivos .jpg por archivo imagen: un archivo .jpg para el canal DAPI (formato de color rojo / verde / azul (RGB), falso color codificado en amarillo), un archivo .jpg para el canal de estroma (escala de grises) y una .jpg archivo que contienelos canales de células hematopoyéticas (3 canales máximo, en formato RGB, por ejemplo, FITC (PCs, falso color: verde) / (células Alexa Fluor 594 B, falso color: azul) / Alexa Fluor 647 (eosinófilos, falso color: rojo)) .

4. Automatizado de Análisis de Imágenes

1. Utilice una herramienta de análisis de imagen para realizar la segmentación de imágenes, la cuantificación de co-localización y análisis de vecindad (ver Discusión).
2. Si el uso de las herramientas Wimasis, haga lo siguiente:
   1. Sube las series de 3 archivos .jpg por imagen con el mismo nombre de archivo seguido de un subrayado y un número que indica el tipo de la imagen.
   2. Utilice _1 para el archivo .jpg con células hematopoyéticas, _2 para el archivo .jpg para el canal DAPI, _3 para el archivo .jpg para el canal de estroma. Por ejemplo: Image1_1.jpg (células hematopoyéticas), Image1_2.jpg (canal DAPI), y Image1_3.jpg (canal estroma). Sube las imágenes a través de la cuenta del cliente.
   3. Para contacto celular cuantificaciónelegir la herramienta de contacto celular haciendo clic en el campo respectivo. Para la cuantificación proximidades celular, elija la herramienta proximidades celular y entrar en el radio de proximidad preferido en micras (que se mide a partir de los bordes de las células).
   4. Descargue los resultados.
      NOTA: Los resultados se proporcionan como archivos .jpg que muestran las células hematopoyéticas y el canal de estroma con los límites de los objetos detectados resaltado, así como archivos .csv individuales que contienen las mediciones para cada imagen, además de un resumen .csv que contiene los datos de todas las imágenes subidas.
3. Desde el contacto mediciones determinan la frecuencia de células hematopoyéticas (rojo, verde o azul células) en contacto con las células del estroma, o las frecuencias de las células rojas, verdes o azules en contacto los otros tipos de células hematopoyéticas (un ejemplo se muestra en resultados representativos , la Figura 4). Con el fin de determinar las frecuencias, dividir los recuentos de contacto dados por imagen porla cuenta total de células por imagen.
   1. Para los experimentos con ratones individuales, resumir los recuentos de contacto totales de todas las imágenes para los ratones individuales y dividirlos por la suma de los recuentos de células totales de todas las imágenes.
4. De las mediciones alrededores, determinar la frecuencia de las células rojas, verdes o azules dentro de la distancia seleccionada a partir de células estromales y / o las frecuencias de las células rojas, verdes o azules en la proximidad preferido a los otros tipos de células hematopoyéticas tal como se describe en el paso 4.3 ( véase también resultados representativos, Figura 4).

5. Simulación de Random Médula Ósea Posicionamiento

1. Antes de ejecutar las simulaciones de posicionamiento celular al azar en la médula ósea imágenes histológicas analizadas, preparar los siguientes archivos de antemano: los archivos .csv individuales proporcionados por la herramienta de contacto celular, los archivos .jpg originales para el canal DAPI y los archivos .jpg originales para el canal de estroma.
2. Para llevar a cabosimulaciones por lotes en una serie de imágenes (por ejemplo, todas las imágenes de una sección femoral), recogen todos los archivos .jpg originales (_1, _2 y _3) y los archivos .csv individuales correspondientes en una carpeta.
   NOTA: La herramienta de simulación para el posicionamiento de células de médula ósea al azar está disponible bajo petición.
3. Inicie la herramienta de simulación, marque la casilla "Auto-carga de datos de imagen".
   NOTA: El programa leerá los recuentos de células y el tamaño medio de celda del archivo .csv automáticamente. Estos valores se muestran en las casillas de "número de teléfono" y "AVG tamaño Cell" (Figura 5).
4. Introduzca la etiqueta común para los archivos .csv, es decir, el factor común en sus nombres. Introduce el número de conjuntos de imágenes que se deben utilizar para la simulación en modo batch.
5. Cargue el archivo .jpg generada a partir del canal estroma (con el nombre de archivo que termina _3).
6. Introduzca los ajustes para la generación de la máscara del canal DAPI:
   1. Marque la casilla "? Aplicar máscara "Establecer el umbral para la conversión de la imagen DAPI en una máscara binaria de 10 (rango de 0 - 255).
   2. Marque la casilla "8 bits?" Marque la casilla "Dilatar?" Y establecer el grado de dilatación de 5 px. Marque la casilla "w / erosión?".
   3. Introduzca el valor deseado para el radio de proximidad (radio de vecindad) utilizado para el análisis de las imágenes simuladas. Para una imagen de 708,15 x 708,15 m con un tamaño de 2048 x 2048 px (píxel de escala xy: 0,346 micras), 29 px corresponden a 10 micras.
7. Marque la casilla "Use Otsu?", Para usar el algoritmo de Otsu ¹⁷ para la detección automática de las estructuras del estroma.
   NOTA: Este es el mismo algoritmo que se utiliza por la herramienta de contacto y alrededores. Utilizando el mismo algoritmo de segmentación de imágenes en el análisis automatizado de la imagen grabada y la imagen simulada es crucial con el fin de mantener los datos comparable.
8. Introduzca los ajustes para las células hematopoyéticas, que are simula como formas circulares.
   NOTA: Los números de células de glóbulos rojos, verdes, y azules se cargan directamente desde el archivo .csv (véase también el paso 5.6).
   1. Utilice la herramienta de simulación para calcular el diámetro medio en px de glóbulos rojos, verdes y azules. Determinar el área promedio de una sola célula como el área total de cada tipo de célula en la imagen en px dividido por el recuento total de células por imagen. Utilice el área de promedio para calcular el radio de un disco utilizando la fórmula. El doble de la radio para determinar el diámetro promedio.
9. Medir la distribución de tamaño de las células de los tipos celulares analizados con cualquier software de análisis de imágenes que incluye funciones de segmentación de objetos. Determinar σ para todos los tipos de células hematopoyéticas ⁽¹⁸ y Figura 5B).
   NOTA: Puesto que las distribuciones de tamaño celular de las células grabadas no son determinados por el análisis de imágenes automatizado, utilizar una distribución gaussiana como una aproximación de las distribuciones reales. La anchura de tél curva de distribución es descrito por σ y puede ser muy diferente para diversos tipos de células. (Para más detalles, véase la figura 5B).
   1. A partir de estas mediciones, determinar el "corte de tamaño de celda": el diámetro en px que describe el objeto más pequeño todavía reconocida como una célula completa por la herramienta de análisis de imagen.
10. Introduzca los parámetros en los cuadros de la interfaz gráfica de usuario (Figura 5).
    1. Introduzca el tamaño de la celda de corte, es decir, el tamaño de celda mínimo permitido en la simulación, como un diámetro en px.
    2. Introduzca σ en px para la simulación de la distribución de tamaño de celda para los glóbulos rojos, verdes, y azules (del paso 5.9).
    3. Marque la casilla "Eliminar" en la subsección "Las células en la máscara". Con esta configuración, el programa se eligió una nueva posición para una célula si se solapa con al menos un píxel con una zona prohibida de la máscara. Marque la casilla "Evitar solapamiento celular? ̶1; en la "exclusión de la célula" subsección.
    4. Introduzca la distancia mínima permitida entre los centros de dos células en px.
       NOTA: La distancia mínima debe ser determinado a partir de las imágenes grabadas. Erróneamente distancias mínimas medidas conducirán a resultados sesgados / artificiales para la comparación de las imágenes grabadas y simulados.
    5. Ajuste el área máxima de superposición a 100% si el solapamiento se define por la distancia mínima de centro a centro.
    6. Ajuste la herramienta de simulación para 1000 repeticiones.
    7. Marque la casilla "células de guardado automático?" Para guardar las coordenadas de los objetos simulados para todas las repeticiones de cada imagen de la hornada como archivos .rect (formato de texto). Marque la casilla "imágenes de guardado automático?" Para guardar un archivo .tiff para cada imagen simulada. Introduzca una etiqueta común para los archivos guardados.
       NOTA: El "? Células de guardado automático" opción reduce el tiempo de funcionamiento de simulación y el tamaño total de datos, en comparación con al guardar el real ima simuladages. Los archivos .rect guardar las coordenadas de las células simuladas como rectángulos y por lo tanto se pueden convertir en imágenes simuladas si es necesario.
11. Inicie la simulación haciendo clic en "simulación Ejecutar".
    NOTA: La herramienta de simulación genera automáticamente un archivo .csv para los 1.000 simulaciones de cada imagen, incluidos los recuentos de contacto medias y recuentos alrededores de glóbulos rojos, verdes y azules con los glóbulos rojos, verdes, azules, y del estroma para cada conjunto de simulaciones repetidas . Además, para todos estos valores, se proporcionan los promedios de las 1.000 simulaciones con desviación estándar (STD) y el error estándar de la media (SEM).
12. Determine el promedio de frecuencias de contacto y frecuencias alrededores de un conjunto de 1.000 imágenes simuladas. Para ello, se divide el contacto media y cuenta alrededores por el recuento de células grabado por imagen. Comparar las frecuencias de los resultados del análisis de co-localización automatizada de la imagen grabada.
13. Aplicar Stati adecuadasmétodos stical en función del análisis de ¹⁹ (para la figura 7, se utilizó un Wilcoxon de dos colas firmado rank test).

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Resultados

Cortar cryosections de hueso sin descalcificar con el método de la cinta Kawamoto permite todo el hueso a cortar como una sección intacta, con la médula ósea de la región endóstica todavía unido al hueso mineralizado, tanto en la diáfisis, así como en las áreas epifisarias con su alta densidad del hueso trabecular (Figura 1). Tinción nuclear de las secciones revela que aunque pequeñas grietas en la preparación no se pueden evitar totalmente, la estructura de los sinusoides y arterias, así ...

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Discusión

A pesar de los avances en los métodos modernos de imagen óptica, el análisis de los datos histológicos se sigue a menudo obstaculizada por la falta de herramientas de cuantificación y métodos adecuados, o por los análisis parciales que se centran en una pequeña área de interés. El enfoque sinérgico se presenta aquí combina análisis de imagen que cubre la región entera de la médula ósea, la segmentación automática y reconocimiento de objetos de diversos tipos de células hematopoyéticas y del estroma, ...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Neomycin	Sigma	N6386 SIGMA	Neomycin trisulfate salt hydrate, EU hazard code: GHS08
Ursovit AD3EC	Serumwerke Bernburg		1 ml contains: 50.000 I.E. retinyl palmitate, 5.000 I.E. cholecalciferol, 30 mg tocopheryl acetate, 100 mg ascorbic acid, 1 mg sorbic acid, 200 mg polyoxyl 35 castor oil, 0,5 mg propyl gallate
Transfer buffer (100 ml PBS, 1 ml 1 M HEPES, 50 U/ml penicillin/streptomycin)	Sigma	P4333, H3375
4-Hydroxy-3-nitrophenylacetyl hapten conjugated to chicken gamma globulin
Chicken gamma globulin (CGG) 100 mg	Rockland	D602-0100
20% Paraformaldehyde solution (EM-grade)	Science Services	15713	EU hazard codes: GHS02, GHS05, GHS07, GHS08
D(+)-sucrose	Carl Roth	4621.1
Dry ice
Acetone	Sigma-Aldrich	179124 SIGMA-ALDRICH	EU hazard codes: GHS02, GHS07
Hexane	Sigma-Aldrich	208752 SIGMA-ALDRICH	EU hazard codes: GHS02, GHS07, GHS08, GHS09
Tissue-Tek cryomolds (standard)	Sakura	4557	25 x 20 x 5 mm
Tissue-Tek O.C.T.	Sakura	4583
Kawamoto's SCEM embedding medium	Section-Lab, JP
Kawamoto's cryosection preparation kit	Section-Lab, JP
Kawamoto's cryofilm type 2C(9)	Section-Lab, JP
Microtome blade MX35 premier plus, low profile	Thermo Scientific	3052835	L X W: 80 x 8 mm (31.5 x 3.13"), thickness: 0.25 mm (0.01")
Polyclonal rabbit anti-RFP antibody, biotinylated	Rockland	600-406-379
Alexa Fluor 555 streptavidin	Life Technologies	S-32355
Rat anti-MBP	J. and N. Lee		available from: J. and N. Lee, Mayo Clinic, Scottsdale, AZ , U.S.A., clone MT-14.7
Goat anti-rat-Alexa Fluor 647	Life Technologies	A-21247
Rat anti-B220 - Alexa Fluor 594			produced and coupled in-house (DRFZ), clone RA3.6B2, Alexa Fluor 594 from Life Technologies
Mouse anti-l1 light chain -FITC			produced and coupled in-house (DRFZ), clone LS136
Rat anti-k light chain - FITC			produced and coupled in-house (DRFZ), clone 187.1
DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)	Sigma	D9542 SIGMA
Fluorescent mounting medium	DAKO	S3023
Cover slips (24 x 24 x 0.13-0.16 mm)	Carl Roth	H875.2
Superfrost slides glasses (75 x 25 mm)	VWR	48311-703
Laser scanning confocal microscope			equipped with laser lines of 405, 488, 561, 594, 633 nm and a 20X/0.8 NA air objective lens. We used a Zeiss LSM710 and Zen 2010 Version 6.0 software.
Automated image analysis tools for bone marrow	Wimasis, Munich		The cell contact tool and cell vicinity tool will be made available by Wimasis upon request.
VC2012 runtime	Microsoft		free download
Simulation tool for random cell positioning			available from us, upon request
Image analysis software with image segmentation functions			We used Volocity (Perkin Elmer) for measuring cell size distributions of hematopoietic cell types in bone marrow (Figure 5). Alternatives are Definiens Image Analysis (Definiens) or Cell Profiler (free download)
Fiji image analysis software			free download. Fiji was used by trained raters for manual cell count (Figure 3).