Automated quantification des cellules hématopoïétiques - Interactions cellulaires stromales dans les images histologiques de décalcifiées os

Résumé

A strategy to quantitatively analyze histological data in the bone marrow is presented. Confocal microscopy of fluorescently labeled cells in tissue sections results in 2-dimensional images, which are automatically analyzed. Co-localization analyses of different cell types are compared to data from simulated images, giving quantitative information about cellular interactions.

Résumé

La microscopie confocale est la méthode de choix pour l'analyse de la localisation des multiples types de cellules au sein des tissus complexes tels que la moelle osseuse. Cependant, l'analyse et la quantification de localisation cellulaire est difficile, comme dans de nombreux cas, il se appuie sur le comptage manuel, portant ainsi le risque d'introduire un biais de l'évaluateur-dépendante et réduire fiabilité inter. En outre, il est souvent difficile de juger si la co-localisation entre deux cellules résulte de positionnement aléatoire, en particulier lorsque des types de cellules diffèrent fortement de la fréquence de leur occurrence. Ici, un procédé de quantification non biaisée de la co-localisation cellulaire dans la moelle osseuse est introduite. Le protocole décrit la préparation de l'échantillon utilisé pour obtenir des coupes histologiques de entiers os longs murins y compris la moelle osseuse, ainsi que le protocole de coloration et l'acquisition d'images à haute résolution. Un flux de travail d'analyse allant de la reconnaissance de hématopoïétiques et non-hematopoietic types de cellules dans deux dimensions des images de moelle (2d) de l'os à la quantification des contacts directs entre les cellules est présentée. Cela inclut également une analyse de voisinage, afin d'obtenir des informations sur le microenvironnement cellulaire entourant un certain type de cellule. Afin d'évaluer si la co-localisation de deux types de cellules est la simple conséquence de positionnement cellulaire aléatoire ou reflète associations préférentielles entre les cellules, un outil de simulation qui permet de tester cette hypothèse dans le cas d'hématopoïétiques ainsi que des cellules stromales, est utilisé. Cette approche ne est pas limitée à la moelle osseuse, et peut être étendue à d'autres tissus pour permettre une analyse reproductible, quantitative des données histologiques.

Introduction

En raison des récents développements technologiques rapides dans la microscopie, y compris l'imagerie optique, l'analyse de cellules dans le contexte du tissu entier est devenu de plus en plus accessible pour les immunologistes. La caractérisation des cellules individuelles en suspension représente une méthode utile et indispensable pour comprendre la fonction cellulaire et moléculaire. Cependant, l'analyse des cellules au sein de leur (micro) -anatomical environnement est essentielle pour comprendre les interactions entre les différents types de cellules qui collaborent dans des processus complexes tels que le développement des réponses immunitaires.

Se il est relativement facile pour microscopistes pour obtenir des informations qualitatives à partir d'images, il reste un défi de quantifier ces données, en partie en raison du fait que les méthodes d'analyse dans ce domaine sont à la traîne par rapport à ce qui est possible dans l'acquisition de l'image. De nombreux chercheurs se appuient toujours sur de temps comptage cellulaire manuel dans leurs images d'histologie,introduisant ainsi un biais entre les différents évaluateurs et d'entraver la réplication par d'autres groupes. Souvent, une image représentative est choisie pour souligner une déclaration sur la position cellulaire ou co-localisation dans une publication, ce qui rend difficile pour le lecteur de juger de la pertinence statistique d'un tel événement.

Ensemble, avec le fait que le contenu de l'information complète de données d'image est rarement exploitée, ce qui souligne la nécessité d'une approche plus impartiale, rapide et complète pour analyser les images histologiques.

La moelle osseuse est un tissu complexe, qui prend les fonctions vitales importantes comme l'organe de l'hématopoïèse chez les vertébrés adultes. En plus d'être le lieu de naissance pour les cellules hématopoïétiques ^1,2 et de jouer un rôle important dans le développement des lymphocytes B ^3, il agit également comme un site où les réactions immunitaires sont initiées ⁴ et soutient les cellules matures, recirculation B ^5. En outre, son rôle dans le maintien imémoire mmunological est devenu de plus en plus apprécié dans la dernière décennie, car plusieurs types de cellules constituant la mémoire immunitaire ont été trouvés d'y résider ^6-9.

La relation entre l'architecture tissulaire complexe de la moelle osseuse et de ses fonctions restent toujours insaisissables. Contrairement organes lymphoïdes secondaires, qui sont organisés en macro-compartiments tels que les zones de cellules T et B, la moelle osseuse n'a pas de macro-cloisonnement clair. Jusqu'à présent compartiments distincts dans la moelle osseuse sont définis par leur proximité par rapport au cortex de l'os ou de la vascularisation. L'importance des différentes populations de cellules stromales résident dans la moelle osseuse pour un certain nombre de procédés tels que l'appui des cellules souches, le développement des cellules B ou le maintien de populations de cellules de mémoire immunitaire (tels que les cellules de plasma à long terme (PC), CD4 ⁺ et Les cellules CD8 ⁺ T mémoires) indique clairement qu'il existe un certain degré de micro-compartimentation dans la moelle osseuse.

Ces observations ont conduit à la notion de niches micro-anatomiques distincts, qui sont spécialisés dans certaines fonctionnalités (STEM entretien des cellules, le développement des cellules B à divers stades, et l'entretien de la mémoire immunologique) dans la moelle osseuse. Bien qu'il semble y avoir un certain degré d'hétérogénéité entre les niches qui servent différentes fonctions, certains des facteurs produits par les cellules stromales, comme CXC chimiokine ligand 12 (CXCL12) ou l'interleukine 7 (IL-7), sont des éléments cruciaux pour plusieurs de ces niches ^10. La visualisation et la caractérisation de cellules stromales de la moelle osseuse est difficile en raison de leurs caractéristiques morphologiques avec de longues extensions dendritiques minces formant un réseau dans la moelle osseuse, et l'absence de marqueurs appropriés de discriminer les sous-populations stromales.

Il ne est pas encore clair dans quelle mesure ces niches ont des caractéristiques communes à l'égard de leur compositio cellulaire et moléculairen, et qui rendent éléments un certain créneau unique. En plus des cellules stromales, des types de cellules hématopoïétiques ont été montrés pour jouer un rôle crucial en fournissant certains signaux au moins pour une partie des créneaux. De toute évidence, la complexité de la composition de niche nécessite leur analyse in situ, et il est devenu de plus en plus important pour les immunologistes et hématologues de zoomer sur la microarchitecture de la moelle osseuse, par exemple, en analysant les relations spatiales entre ses composants cellulaires.

Ici, une stratégie visant à quantifier la co-localisation et de voisinage relations cellulaires dans la moelle osseuse d'une manière automatisée et impartiale est présenté. Un flux de travail détaillé incluant la génération de souris chimériques, l'hébergement cellules fluorescentes stromales et les cellules hématopoïétiques non-fluorescentes, à la préparation de coupes histologiques d'os non décalcifiées, l'acquisition d'images confocales couvrant l'ensemble de l'os, ainsi que l'analyse d'image automatisée de c cellulaireo-localisation et de sa validation / discrimination de positionnement aléatoire par un outil de simulation est fourni (figure 8).

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Protocole

Les expériences sur les animaux ont été approuvés par les commissions compétentes de l'État pour la protection des animaux (Landesamt für Gesundheit und Soziales, Berlin) et ont été réalisées conformément aux lignes directrices actuelles et les règlements (licence d'expérimentation animale G0194 / 11).

1. Production de souris fluorescent moelle osseuse chimériques

REMARQUE: La production de souris chimériques fluorescent de la moelle osseuse de visualiser les cellules stromales de la moelle osseuse est effectuée comme décrit ^ci-9.

1. Commencer à traiter Del-Cre x souris ROSA-tdRFP (souris exprimant la protéine fluorescente rouge tandem (de tdRFP) ubiquitaire ^11-13) pour les préparer à l'irradiation. Vous pouvez également utiliser toute autre souche avec l'expression ubiquitaire de la protéine fluorescente. Administrer 1 mg / ml de néomycine et de 1 mg / ml de vitamines (A, D3, E, C) via l'eau de boisson, deux jours avant l'irradiation.
2. Irradier souris deux fois avec 3,8 Gray avec une césium-137 gamma-irradiation wimince un intervalle de 3 heures. Pour cela, placez la souris dans une tarte cage d'irradiation approprié pour l'irradiateur respective.
   REMARQUE: Pour l'irradiation des souris, notre Institut ne nécessite pas d'anesthésie. Suivez politiques institutionnelles locales concernant l'anesthésie pour l'irradiation. Traiter les animaux avec 5 mg / kg par voie sous cutanée de carprofène (sc) par jour après l'irradiation se il ya des signes de douleur.
3. Le lendemain, la reconstitution des souris par une injection intraveineuse de 3 x 10 ⁶ cellules de moelle osseuse préparées à partir d'os longs de souris donneuses C57BL / 6 dans un tampon de transfert ^9. Gardez les souris sur la néomycine et vitamines pour un maximum de deux semaines et de surveiller leur bien-être et de poids pendant cette période. Attendez au moins quatre semaines pour permettre la reconstitution du système immunitaire avant de commencer les traitements expérimentaux spécifiques (par exemple, la vaccination) ^9.
4. Sacrifiez souris et placez-les sur une planche de dissection, stériliser les jambes avec 70% d'éthanol. Euthanizsouris e conformément aux politiques institutionnelles locales. Notre Institut effectue dislocation cervicale.
5. Utilisez une pince et des ciseaux pour enlever la peau des cuisses. Retirer le tissu musculaire pour exposer l'os fémoral. Luxer l'os fémoral de l'articulation de la hanche et du genou aide de pinces et ciseaux. Veillez à ne pas casser ou couper l'os.
6. Retirez délicatement reste de gros morceaux de tissu musculaire et le cartilage de l'os en utilisant des ciseaux. Retirer le tissu musculaire restant en frottant l'os avec du papier absorbant de laboratoire. Recueillir les ossements nettoyés dans une boîte de Pétri avec du tampon phosphate salin (PBS).
7. Fixer os fémoraux entières dans 4% de paraformaldehyde (PFA, microscopie électronique de qualité) pour 4 à 6 h.
8. Jeter PFA et incuber os de 10% de saccharose dans du PBS O / N. Le lendemain, incuber les os de 20% de saccharose O / N. Le lendemain, incuber les os de 30% de saccharose O / N.

2. Cryosectioning of Bones

NOTE: Après une6-24 h dans 30% de saccharose, de geler les os et les cryosection selon la méthode de la bande de Kawamoto ^14,15.

1. Préparer un grand bécher (2000 ml de volume) avec de la glace sèche et d'acétone (environ 2: 1 ratio de volume, par exemple, 400 ml de glace sèche et 200 ml d'acétone) sous une hotte. Placez un petit gobelet (150 à 250 ml de volume) avec de l'hexane à l'intérieur (30 à 50 ml environ). Attendre que le mélange refroidir (environ 10 min, jusqu'à ce que le gel se affiche sur le côté extérieur du grand bêcher).
2. Remplissez les ¾ de la cryomoule marqué avec Super Cryoembedding moyen (SCEM); placer soigneusement les os à l'intérieur jusqu'à ce qu'ils soient totalement immergés, en prenant soin qu'ils ne touchent pas les bords du moule. Avec de grandes pinces tenir le cryomoule dans le bécher avec le fond du moule vient de toucher la surface de l'hexane.
   1. Laissez les bords extérieurs du gel de SCEM (indiqué par l'opacité, cela prend environ 15 secondes). Puis déposez pleinement le moule dans l'hexane et laissez-freEze pour 1-2 min. Sortez l'échantillon congelé et envelopper dans du cellophane, puis une feuille d'aluminium (pour protéger l'échantillon de sécher et d'éviter l'exposition à la lumière). Conserver à -80 ° C jusqu'à cryosectioning.
3. Pour cryosectioning des os fémoraux utiliser un lames de microtome et microtome standard pour les tissus durs.
4. Réglez la température de l'échantillon et la lame du microtome à -24 ° C. Laissez l'échantillon se asseoir à l'intérieur du microtome pendant environ 15 minutes avant de couper.
   1. Fixer le bloc d'échantillons au titulaire de l'échantillon métallique avec SCEM ou la température de coupe optimale (OCT) moyen. Ajuster l'orientation du bloc si nécessaire. Couper l'échantillon jusqu'à l'os est complètement ouvert et la moelle est visible. Réglez l'épaisseur de coupe à 7 pm (jeter la première section).
   2. Correction d'un morceau de ruban adhésif Kawamoto avec le côté collant sur le dessus du bloc de l'échantillon à l'aide d'une spatule en bois recouvert de cuir cerfs. Par la suite, couper l'échantillon et tourner la bande de sorte que la section estpositionnée sur le côté supérieur. Transférer la bande à une lame de verre en utilisant une pince. Fixer la bande à la lame de verre avec du ruban adhésif Scotch.
5. Laissez sections sécher pendant au moins 30 min et de les stocker à -80 ° C jusqu'à l'utilisation. Stocker les lames non colorées et non montés dans des boîtes de diapositives en plastique avec entretoises entre les diapositives simples afin d'éviter qu'elles collent ensemble. Lames colorées et montées peuvent être stockés pendant jusqu'à une semaine en carton dossiers de diapositives à 4 ° C.

Collection 3. Image

1. Décongeler et cryosections tache selon des protocoles communs d'immunofluorescence ^neuf. Inclure un colorant nucléaire, par exemple, 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole dihydrochlorure (DAPI) pour visualiser l'intégrité des tissus.
   REMARQUE: Teinté, par exemple, pour DP de visualiser les cellules stromales (anti-DP-biotine anticorps et la streptavidine-Alexa Fluor 555), les éosinophiles de tache avec de rat anti-protéine basique majeure (MBP) anticorps et anti-rat-Alexa Fluor 647 anticorps , les cellules Bavec de rat anti-B220-Alexa Fluor 594 anticorps et PC avec la lumière anti-κ chaîne fluorescéine-isothiocyanate (FITC) et des anticorps anti-chaîne λ1-FITC lumineuse (détails de la procédure de coloration sont décrits dans ^9).
2. Montez coupes colorées: mettre une goutte de Fluoromount sur la section, puis couvrir avec un couvercle en verre feuillet n ° 1, tout en évitant soigneusement la formation de bulles d'air. Par la suite, effectuer microscopie confocale à balayage laser avec un instrument équipé de lignes laser appropriés pour la coloration.
3. Pour enregistrer des images pour l'analyse automatisée co-localisation de cellules hématopoïétiques de la moelle osseuse avec des cellules stromales en utilisant l'outil Wimasis, appliquer les paramètres suivants:
   1. Utilisez un objectif 20X et un champ de vision de 708,15 x 708,15 um. Pour l'analyse automatisée, garder la taille de toutes les images cohérentes à 2048 x 2048 pixels (px) afin de maintenir les résultats comparables.
   2. Enregistrer une chaîne pour les structures stromales (par exemple, 561 ligne laser nm), un canal pour les noyaux (par exemple, DAPI, 405 nm) et des canaux supplémentaires pour les cellules hématopoïétiques d'intérêt (par exemple, trois canaux, 488/594/633 nm pour les éosinophiles, les lymphocytes B et les PC).
   3. Enregistrez les images en utilisant la ligne moyenne 4 ^16. Idéalement, couvrent toute la section fémorale en prenant des images adjacentes simples. Sinon, prendre des photos non adjacentes de différentes régions de la moelle osseuse (diaphysaire ainsi que l'épiphyse).
      REMARQUE: Veillez à ne pas produire des chevauchements entre les images adjacentes (pour éviter les analyses répétées de cellules dans les zones de chevauchement).
4. Enregistrez les images dans un format microscopie fichier image. Vérifier et, si nécessaire, régler le contraste pour tous les canaux dans le logiciel d'affichage / d'analyse.
5. Export 3 fichiers .jpg par fichier image: un fichier .jpg pour le canal DAPI (rouge / vert / bleu (RVB) de format, fausses couleurs codées en jaune), un fichier .jpg pour le canal de stroma (niveaux de gris) et un .jpg fichier contenantles canaux de cellules hématopoïétiques (3 canaux maximales, le format RGB, par exemple, FITC (PC, fausse couleur: vert) / Alexa Fluor 594 (cellules B, fausses couleurs: bleu) / Alexa Fluor 647 (éosinophiles, fausses couleurs: rouge)) .

4. Analyse d'image automatisé

1. Utilisez un outil d'analyse d'image pour effectuer la segmentation d'images, quantification de co-localisation et l'analyse de voisinage (voir Discussion).
2. Si vous utilisez les outils Wimasis, procédez comme suit:
   1. Téléchargez les ensembles de trois fichiers .jpg par image avec le même nom de fichier suivi par un soulignement et un numéro indiquant le type de l'image.
   2. Utilisez _1 pour le fichier .jpg avec des cellules hématopoïétiques, _2 pour le fichier .jpg pour le canal DAPI, _3 pour le fichier .jpg pour le canal de stroma. Par exemple: Image1_1.jpg (cellules hématopoïétiques), Image1_2.jpg (canal DAPI), et Image1_3.jpg (canal de stroma). Télécharge les images via le compte client.
   3. En cas de contact de la cellule de quantificationchoisissez l'outil de contact de cellule en cliquant sur le champ correspondant. Pour voisinage cellulaire quantification, choisissez l'outil de voisinage cellulaire et entrer dans le rayon de voisinage préféré dans um (qui est mesurée à partir des bords des cellules).
   4. Télécharger les résultats.
      REMARQUE: Les résultats sont fournis sous forme de fichiers .jpg montrant les cellules hématopoïétiques et le canal de stroma avec les limites des objets détectés en surbrillance, ainsi que les fichiers .csv uniques contenant les mesures pour chaque image, en plus d'un résumé .csv fichier contient les données de tous les images téléchargées.
3. De le contact mesures déterminent la fréquence des cellules hématopoïétiques (rouge, vert, ou cellules bleues) en contact avec les cellules stromales, ou les fréquences de cellules rouges, verts ou bleus en contact avec les autres types de cellules hématopoïétiques (un exemple est illustré dans Les résultats représentatifs , Figure 4). Afin de déterminer les fréquences, diviser les chefs d'accusation de contact donnés par image parla cellule totale compte par image.
   1. Pour les expériences avec des souris individuelles, résumer les chefs d'accusation de contact total de toutes les images pour les souris simples et de les diviser par la somme des chiffres totaux de cellules de toutes les images.
4. A partir des mesures de voisinage, déterminer la fréquence des cellules rouge, verte ou bleue à l'intérieur de la distance sélectionnée à partir de cellules stromales et / ou les fréquences des globules rouges, vertes ou bleues dans le voisinage le plus pratique pour les autres types de cellules hématopoïétiques comme décrit à l'étape 4.3 ( voir aussi Les résultats représentatifs, figure 4).

5. Simulation de Random moelle osseuse Positionnement

1. Avant d'exécuter les simulations de positionnement cellulaire aléatoire sur la moelle osseuse images histologiques analysés, préparer les fichiers suivants à l'avance: les fichiers .csv simples fournies par l'outil de contact de la cellule, les fichiers .jpg d'origine pour le canal DAPI et les fichiers .jpg d'origine pour le canal de stroma.
2. Pour effectuersimulations de lots sur une série d'images (par exemple, toutes les images d'une section fémorale), recueillent tous les fichiers .jpg d'origine (_1, _2 et _3) et les fichiers .csv simples correspondants dans un seul dossier.
   REMARQUE: L'outil de simulation pour le positionnement des cellules de moelle osseuse aléatoire est disponible sur demande.
3. Lancer l'outil de simulation, cochez la case "Auto-charge données d'image".
   NOTE: Le programme va lire les numérations cellulaires et taille moyenne des cellules à partir du fichier .csv automatiquement. Ces valeurs sont affichées dans les boîtes pour "Le nombre de cellules" et "AVG de taille de la cellule" (figure 5A).
4. Entrez le tag commun pour les fichiers .csv, ce est à dire, le facteur commun dans leurs noms. Entrez le nombre de séries d'images qui devraient être utilisés pour la simulation en mode batch.
5. Chargez le fichier .jpg généré par le canal de stroma (avec nom de fichier se terminant _3).
6. Entrez les paramètres pour générer le masque du canal DAPI:
   1. Cochez la case "? Appliquer le masque "Régler le seuil pour convertir l'image DAPI dans un masque binaire à 10 (plage de 0 à 255).
   2. Cochez la case "8-bit?" Cochez la case "Homothétie?" Et réglez la note de la dilatation à 5 px. Cochez la case "w / érosion?".
   3. Entrer la valeur désirée pour le rayon de voisinage (rayon de voisinage) utilisés pour l'analyse des images simulées. Pour une image de 708,15 x 708,15 um avec une taille de 2048 x 2048 px (pixel échelle xy: 0,346 um), 29 px correspond à 10 um.
7. Cochez la case "Utiliser Otsu?" Pour utiliser l'algorithme de Otsu ¹⁷ pour la détection automatique des structures stromales.
   NOTE: Ce est le même algorithme qui est utilisé par l'outil de contact et environs. Utilisant le même algorithme de segmentation d'image dans l'analyse automatisée de l'image enregistrée et l'image simulée est crucial afin de conserver les données comparables.
8. Entrez les paramètres de cellules hématopoïétiques, laquelle Are simulé formes circulaires.
   REMARQUE: Les numéros de cellulaires pour les cellules rouges, verts et bleus sont chargés directement à partir du fichier .csv (voir aussi l'étape 5.6).
   1. Utilisation de l'outil de simulation pour calculer le diamètre moyen des cellules px rouge, vert et bleu. Déterminer la surface moyenne d'une cellule unique que la surface totale de chaque type de cellule dans l'image px divisé par le nombre total de cellules par image. Utilisez la zone moyenne pour calculer le rayon d'un disque à l'aide de la formule. Double du rayon de déterminer le diamètre moyen.
9. Mesurer la distribution de la taille des cellules des types de cellules analysées avec un logiciel d'analyse d'image qui comprend des fonctions de segmentation d'objets. Déterminer σ pour tous les types de cellules hématopoïétiques ⁽¹⁸ et la figure 5B).
   REMARQUE: Étant donné que les distributions de taille de cellule des cellules enregistrées ne sont pas déterminées par l'analyse d'images automatisée, en utilisant une distribution gaussienne comme une approximation des distributions réelles. La largeur de la tcourbe de distribution il est décrit par σ et peut être très différente pour les différents types de cellules. (Pour plus de détails, voir la figure 5B).
   1. A partir de ces mesures, déterminer le "seuil de taille de cellule": le diamètre en px qui décrit le plus petit objet encore reconnu comme une cellule complète par l'outil d'analyse d'image.
10. Entrer des paramètres dans les boîtes respectives sur l'interface utilisateur graphique (figure 5A).
    1. Entrer la taille de la cellule coupée, ce est à dire, la taille de cellule minimum autorisée dans la simulation, comme un diamètre px.
    2. Entrée en px σ pour la simulation de la distribution de taille de cellule pour des cellules rouge, verte et bleue de l'étape (5.9).
    3. Cochez la case "Supprimer" dans le paragraphe "Les cellules de masque". Avec ce réglage, le programme choisira une nouvelle position pour une cellule se il chevauche au moins un pixel d'une zone de non-du masque. Cochez la case "éviter les chevauchements cellulaire? ̶1; dans le paragraphe "l'exclusion de cellule".
    4. Entrez la distance minimale autorisée entre les centres des deux cellules en px.
       REMARQUE: La distance minimale doit être déterminée à partir des images enregistrées. Tort distances minimales mesurées mèneront à des résultats biaisés / artificiel pour la comparaison d'images enregistrées et simulées.
    5. Définir la zone de chevauchement maximal de 100% si le chevauchement est définie par la distance minimale de centre à centre.
    6. Régler l'outil de simulation pour 1000 répétitions.
    7. Cochez la case "cellules Autosave?" Pour enregistrer les coordonnées des objets simulés pour toutes les répétitions de chaque image du lot en tant que fichiers .rect (format texte). Cochez la case "des images de sauvegarde automatique?" Pour enregistrer un fichier .tiff pour chaque image simulée. Entrez une étiquette commune pour les fichiers enregistrés.
       REMARQUE: Le "? Cellules Autosave" option réduit la simulation temps de fonctionnement et la taille globale de données, par rapport à lors de l'enregistrement de la réelle simulée images. Les fichiers .rect enregistrer les coordonnées des cellules simulées par des rectangles et peuvent donc être convertis en images simulées si nécessaire.
11. Lancer la simulation en cliquant sur «simulation Exécuter".
    REMARQUE: L'outil de simulation génère automatiquement un fichier .csv pour les 1 000 simulations de chaque image, y compris les chefs d'accusation de contact moyennes et les chiffres de environs pour les globules rouges, verts et bleus avec des cellules rouges, vertes, bleues, et stromales pour chaque ensemble de simulations répétées . De plus, pour toutes ces valeurs, moyennes des 1 000 simulations avec déviation standard (STD) et l'erreur standard de la moyenne (SEM) sont fournis.
12. Déterminer la moyenne des fréquences de contact et les fréquences de voisinage d'un ensemble de 1000 images simulées. Pour cela, diviser le contact moyen et compte de voisinage par le nombre de cellules enregistrées par image. Comparer les fréquences des résultats de l'analyse de co-localisation automatique de l'image enregistrée.
13. Appliquer stati appropriéesméthodes stical fonction de l'analyse ¹⁹ (de la figure 7, nous avons utilisé un Wilcoxon bilatéral signé test de rang).

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Résultats

Cryosections d'os non décalcifié de coupe avec la méthode de la bande Kawamoto permet à l'ensemble de l'os à couper en tant que partie intacte, avec de la moelle osseuse de la région endo-osseux encore attaché à l'os minéralisé, à la fois dans la diaphyse, ainsi que dans les zones de épiphysaires avec leur forte densité de l'os trabéculaire (Figure 1). Coloration nucléaire des sections révèle que, bien que de petites fissures dans la préparation ne peuvent pas être...

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Discussion

Malgré les progrès dans les méthodes modernes d'imagerie optique, l'analyse des données histologiques est encore souvent entravé par le manque d'outils de quantification appropriés et des méthodes, ou par des analyses biaisées qui se concentrent sur une petite zone d'intérêt. L'approche synergique présenté ici combine l'analyse d'image couvrant la région de la moelle osseuse entière, la segmentation automatique et la reconnaissance d'objets de divers types de cellules hémat...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Neomycin	Sigma	N6386 SIGMA	Neomycin trisulfate salt hydrate, EU hazard code: GHS08
Ursovit AD3EC	Serumwerke Bernburg		1 ml contains: 50.000 I.E. retinyl palmitate, 5.000 I.E. cholecalciferol, 30 mg tocopheryl acetate, 100 mg ascorbic acid, 1 mg sorbic acid, 200 mg polyoxyl 35 castor oil, 0,5 mg propyl gallate
Transfer buffer (100 ml PBS, 1 ml 1 M HEPES, 50 U/ml penicillin/streptomycin)	Sigma	P4333, H3375
4-Hydroxy-3-nitrophenylacetyl hapten conjugated to chicken gamma globulin
Chicken gamma globulin (CGG) 100 mg	Rockland	D602-0100
20% Paraformaldehyde solution (EM-grade)	Science Services	15713	EU hazard codes: GHS02, GHS05, GHS07, GHS08
D(+)-sucrose	Carl Roth	4621.1
Dry ice
Acetone	Sigma-Aldrich	179124 SIGMA-ALDRICH	EU hazard codes: GHS02, GHS07
Hexane	Sigma-Aldrich	208752 SIGMA-ALDRICH	EU hazard codes: GHS02, GHS07, GHS08, GHS09
Tissue-Tek cryomolds (standard)	Sakura	4557	25 x 20 x 5 mm
Tissue-Tek O.C.T.	Sakura	4583
Kawamoto's SCEM embedding medium	Section-Lab, JP
Kawamoto's cryosection preparation kit	Section-Lab, JP
Kawamoto's cryofilm type 2C(9)	Section-Lab, JP
Microtome blade MX35 premier plus, low profile	Thermo Scientific	3052835	L X W: 80 x 8 mm (31.5 x 3.13"), thickness: 0.25 mm (0.01")
Polyclonal rabbit anti-RFP antibody, biotinylated	Rockland	600-406-379
Alexa Fluor 555 streptavidin	Life Technologies	S-32355
Rat anti-MBP	J. and N. Lee		available from: J. and N. Lee, Mayo Clinic, Scottsdale, AZ , U.S.A., clone MT-14.7
Goat anti-rat-Alexa Fluor 647	Life Technologies	A-21247
Rat anti-B220 - Alexa Fluor 594			produced and coupled in-house (DRFZ), clone RA3.6B2, Alexa Fluor 594 from Life Technologies
Mouse anti-l1 light chain -FITC			produced and coupled in-house (DRFZ), clone LS136
Rat anti-k light chain - FITC			produced and coupled in-house (DRFZ), clone 187.1
DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)	Sigma	D9542 SIGMA
Fluorescent mounting medium	DAKO	S3023
Cover slips (24 x 24 x 0.13-0.16 mm)	Carl Roth	H875.2
Superfrost slides glasses (75 x 25 mm)	VWR	48311-703
Laser scanning confocal microscope			equipped with laser lines of 405, 488, 561, 594, 633 nm and a 20X/0.8 NA air objective lens. We used a Zeiss LSM710 and Zen 2010 Version 6.0 software.
Automated image analysis tools for bone marrow	Wimasis, Munich		The cell contact tool and cell vicinity tool will be made available by Wimasis upon request.
VC2012 runtime	Microsoft		free download
Simulation tool for random cell positioning			available from us, upon request
Image analysis software with image segmentation functions			We used Volocity (Perkin Elmer) for measuring cell size distributions of hematopoietic cell types in bone marrow (Figure 5). Alternatives are Definiens Image Analysis (Definiens) or Cell Profiler (free download)
Fiji image analysis software			free download. Fiji was used by trained raters for manual cell count (Figure 3).