العظام مكيفة المتوسطة: إعداد والأحيائي

Summary

وصفنا هنا كيفية إعداد المتوسطة مكيفة العظام (BCM) واختبار نشاطه في المختبر.

Abstract

وتستخدم على نطاق واسع ترقيع العظام ذاتي في الفم والوجه والفكين جراحة، طب العظام، والكسور. ترقيع العظام ذاتي ليس فقط استبدال العظام في عداد المفقودين، كما أنها تدعم عملية معقدة من تجديد العظام. ويعزى هذا السلوك مواتية لطعم ذاتي لخصائص ثلاثة: osteoconductivity، osteogenicity، وosteoinductivity. ومع ذلك، هناك جانب آخر: العظام ترقيع الافراج عن عدد لا يحصى من الجزيئات، بما في ذلك عوامل النمو، والتي يمكن أن تستهدف خلايا اللحمة المتوسطة العاملة في تجديد العظام. خصائص نظير الصماوي من ترقيع العظام يمكن دراستها في المختبر عن طريق استخدام المتوسطة مكيفة العظام (BCM). هنا نقدم بروتوكول بشأن كيفية إعداد المتوسطة مكيفة العظام من الأصلي القشرية خنزير العظام، والعظام التي خضعت المعالجة الحرارية أو التنقية. الخلايا يمكن أن يتعرض مباشرة لBCM أو المصنف على المواد الحيوية، مثل الأغشية الكولاجين، غارقة في السابق مع BCM. نعطي أمثلة لفي المختبر bioassaيس مع خلايا اللحمة المتوسطة على التعبير عن TGF-β الجينات تنظيمها. يجب على البروتوكولات المعروضة يشجع على مواصلة الكشف عن الآثار نظير الصماوي من ترقيع العظام أثناء تجديد العظام وفتح مسار للأبحاث متعدية في مجال واسع من الجراحة الترميمية.

Introduction

ويستخدم على نطاق واسع العظم ذاتي لسد العيوب التي حدثت نتيجة للتشوه، جراحة resective، والجراحة الترميمية الصدمة، وقبل الزرع وضع ^1،2. فهم المبادئ البيولوجية لكيفية دعم ترقيع العظام عملية الكسب غير المشروع التوحيد ليست المفتاح الوحيد لفهم لماذا تعتبر طعم ذاتي لتكون معيار الذهب في الجراحة الترميمية، بل هو أيضا الكترونية لتصميم محسن للبدائل العظام ^3. ومع ذلك، الكسب غير المشروع توحيد أسرع مع العظم ذاتي مقارنة بدائل العظام ^4،5. وبالتالي، لا بد من الكشف عن الآليات الجزيئية والخلوية التي تجعل العظام ذاتي فعالة جدا لدعم تجديد العظام.

هناك ثلاث خصائص الكتاب المدرسي لطعم ذاتي التي تعتبر لدعم ^6،7 عملية الدمج. الأول، هو العظم ذاتي عظمي، وتوفير التوجيه للالعظام التي شكلت حديثا في النموإلى الخلل. ثانيا، العظام ذاتي هو المكونة للعظم، وهذا يعني أنه يحتوي على خلايا اللحمة المتوسطة التي يمكن أن تفرق في بانيات ^8. الثالث، العظام ذاتي هو osteoinductive كما عوامل النمو مثل البروتينات مخلق العظام مدفون في المصفوفة يمكن الشروع في عملية داخل الغضروف أو حتى الغشائي تكوين العظام ^9. وهناك جانب آخر: رقائق العظام الطازجة عقد وظيفة نظير الصماوي استنادا إلى الملاحظات في المختبر مع "المتوسطة مكيفة العظام" ^10-15. كما أثر تكون النقويات تجدر الإشارة ^16. مصطلح مماثل "العظام المنزوعة المعادن مكيفة مصفوفة المتوسطة" التي صيغت بالفعل في 1996 ويدعم مفهوم شامل وظيفة نظير الصماوي من العظام، وحتى عندما يتم معالجتها من قبل التنقيه ^17. لأغراضنا، BCM يمكن إعداد من الخنزير الطازج الفك السفلي ^10،11. وكشفت التحليلات البروتين من BCM تكوين معقد، بما في ذلك حقيقة النموالأملاح ومكونات المصفوفة خارج الخلية ^10، وتمتد أيضا المعرفة القائمة على proteasome والعظام كله ^18،19. وبالتالي، يجب BCM تعكس النشاط التي تم إصدارها من تعديلات مختلفة من الطعوم العظمية في المختبر.

ماذا يحدث عندما تتعرض الخلايا الوسيطة، على سبيل المثال تلك المعزولة من رقائق العظام أو من الأنسجة اللينة عن طريق الفم، لBCM؟ في المختبر، BCM يقلل المكونة للعظم والتمايز مكون الشحم، ويثير زيادة ملحوظة في عدد IL11 التعبير ^11. الجينوم كشف ميكروأري واسعة أكثر من الجينات أن أعرب تفاضلي في خلايا اللحمة المتوسطة ردا على BCM. من بين هذه الجينات هي adrenomedullin (ADM)، IL11، IL33، NADPH أوكسيديز 4 (NOX4)، بروتيوغليكان 4 (PRG4، أو lubricin) وpentraxin 3 (PTX3) ^15. BCM تم الحصول عليها من رقائق العظام تعقيمها فشلت في تغيير تعبير عن الجينات المعنية ^14. كان BCM من رقائق العظام التي خضعت البسترة وتجميد قادرة علىتغيير التعبير الجيني ^14. متوسطة مكيفة أيضا مصفوفة العظام المنزوعة (DBM-CM) يتغير التعبير عن TGF-β تنظيم الجينات ^20. ومن المثير للاهتمام، والأغشية حاجز الكولاجين تستخدم لحماية رقائق العظام من الأنسجة الرخوة المحيطة ^21،22، كثف تلك الأجزاء من BCM التي هي المسؤولة عن التغيرات في التعبير الجيني ^23. ويمكن تمديد البحوث BCM إلى أنواع الخلايا الأخرى المشاركة في تجديد العظام مثل الآكلة-resorbing العظام والخلايا البطانية، على سبيل المثال لا الحصر. وبصفة عامة فإن البيانات في المختبر تراكم الأساس العلمي لتصميم دراسة ما قبل السريرية.

هذا البروتوكول ذو شقين: أولا، لكنه يظهر كيفية تحضير BCM. ثانيا، فإنه يظهر كيفية اختبار النشاط البيولوجي التي تقوم على خلايا اللحمة المتوسطة في المختبر.

Protocol

1. إعداد BCM

1. الحصول على الفك السفلي الخنازير من جزار المحلية الطازجة قدر الإمكان. وضع الفك السفلي على سطح ثابت والافراج عن سمك رفرف كامل اهتماما خاصا بعدم مغادرة أي نوع من الأنسجة الرخوة أو السمحاق تعلق على العظام. العمل في بيئة نظيفة دون الحاجة للعمل تحت غطاء تدفق.
2. مرة واحدة يتم تحريرها سمك رفرف كامل، واستخدام مكشطة العظام لحصاد رقائق العظام من الجانب الشدق. يرجى ملاحظة أن مكشطة العظام يجب أن تكون حادة. التعامل بحزم مكشطة العظام ومع الحركات الطويلة بجمع العظام. تجاهل رقائق العظام الصغيرة التي 1MM.
   1. للحفاظ على رقائق العظام الأم، وضع مباشرة رقائق العظام في أطباق بلاستيكية من 10CM قطر مع متوسط ​​Dulbecco لتعديل النسر (DMEM) تستكمل مع 1٪ المضادات الحيوية وantimycotics عدم السماح لهم لتجف.
   2. لتقييم تأثير المعالجة الحرارية، ورقائق العظام عرضة للبسترة لمدة 30 دقيقة في 80 ° C أوالأوتوكلاف لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة 121 مئوية.
   3. لتقييم تأثير التنقيه، يهز رقائق العظام في 1 M HCL لمدة 4-6 ساعة عند 4 درجات مئوية، ويغسل مرارا مع مستنبت حتى الرقم الهيدروجيني محايدة.
3. وضع ما مجموعه 5 غرام من رقائق العظام في 10 مل DMEM جديدة تستكمل مع 1٪ المضادات الحيوية وantimycotics في طبق بلاستيكي جديد.
4. وضع أطباق بلاستيكية في جو مرطب عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. ثم، والحصاد BCM. الطرد المركزي BCM في 200 x ج لمدة 10 دقيقة لإزالة الحطام، تصفية أنه معقم (0.2 نانومتر)، والحفاظ على قسامات في المجمد -80 ° C.
5. ذوبان الجليد في الأوراق المالية BCM فورا قبل الاستخدام وتجنب دورات متكررة من تجميد والذوبان.
6. لإجراء التجارب المشار إليها، نقع الأغشية الكولاجين مع مليار متر مكعب أو المصل خالية متوسطة لمدة 1 ساعة على RT. يغسل بقوة الأغشية مع برنامج تلفزيوني ووضعها في 96 لوحات جيدة. هي المصنفة الأغشية الرطبة مع الخلايا.
7. تتلخص عملية إعداد BCM في الشكل 1.

2. اختبارات بيولوجية استنادا إلى خلايا اللحمة المتوسطة

1. خلايا اللحمة المتوسطة الإنسان البذور (على سبيل المثال خلايا العظام، واللثة والخلايا الليفية الرباط اللثة) في لوحة 12-جيدا مع تركيز 30000 خلية / سم ^2. البذور الخلايا تستخدم متوسطة النمو التي تتكون من DMEM، و 10٪ مصل العجل الجنين والمضادات الحيوية. السماح للخلايا نعلق على لوحة O / N.
2. تجاهل مستنبت وغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني قبل تحسنت عند 37 درجة مئوية. تحفيز الخلايا عن طريق إضافة قبل تحسنت المصل خالية مستنبت مع وبدون 20٪ BCM. وضع الخلايا في جو مرطب عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
3. تجاهل مستنبت، وشطف الخلايا مع برنامج تلفزيوني قبل تحسنت واستخراج الحمض النووي الريبي وفقا لبروتوكول المفضل لديك.
4. ضبط تركيز الحمض النووي الريبي من أجل الحصول على نفس الكمية من الحمض النووي الريبي في كل عينة. إعداد cDNAs وإجراء QRT-PCR لتحليل الجينات المحددة باستخدام بادئات هو مبين في الجدول 1.
   ملاحظة: هذه هي التخفيفات من كل مكون: 2X SYBR الأخضر، 20X التمهيدي إلى الأمام، 20X التمهيدي العكس، 5X المياه DD العقيمة، 5X كدنا]. يتم تنفيذ QRT-PCR في 40 دورات من 95 درجة مئوية 15 ثانية و 60 ° C 1 دقيقة.
5. حساب مستويات التعبير النسبية التي تطبيع إلى GAPDH الجينات التدبير المنزلي باستخدام طريقة Δ (ΔCt) حيث ΔCT هو الهدف CT - CT GAPDH وΔ (ΔCT) هو ΔCT حفز - ΔCT السيطرة.
6. بعد ذلك مراقبة الجودة، إضافة BCM إلى مستنبت لتحفيز جميع أنواع الخلايا بما في ذلك خلايا اللحمة المتوسطة، الخلايا المكونة للدم أو الخلايا البطانية.

النتائج

يتم إعداد العظام مكيفة المتوسطة من رقائق العظام الخنزير الطازج. يظهر محة عامة عن عملية لإعداد BCM واستخدام المواد الحيوية في تركيبة مع BCM في الشكل 1 والشكل 2 على التوالي. أثناء إعداد BCM، فمن المهم الحصول على رقائق العظام كبيرة مع الحركات طالما حركات قصيرة أو رقا...

Discussion

مكيفة العظام المتوسطة يعكس النشاط التي تم إصدارها من ترقيع العظام خلال المراحل الأولى من تجديد العظام. بروتوكول الموصوفة هنا يمكن تكييفها لدراسة استجابة من أنواع مختلفة من الخلايا المشاركة في تجديد العظام. وعلاوة على ذلك، فإن بروتوكول يمكن استخدامها لإعداد المتوسط...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pig Mandibles	Local bucher
Bone Scraper	Hu-Friedy	PPBUSE2/36
Antibiotics & Antimicotics	All life Technologies	15240-062
Collagen Membranes (Bio-Gide)	Geistlich
Fetal Calf Serum	Invitrogen Corporation	16030074
DMEM	Invitrogen Corporation	21885-025
High Pure RNA Isolation Kit	Roche	11828665001
Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit	Roche	4379012001
Primers	Microsynth
SYBR Green (for Q-RT-PCR)	Roche	4673484001
PBS	Roche	11666789001