Bone mezzo condizionato: Preparazione e Bioassay

Riepilogo

Descriviamo qui come preparare a medio-bone condizionata (BCM) e testare la sua attività in vitro.

Abstract

Innesti ossei autologhi sono ampiamente utilizzati in chirurgia orale e maxillofacciale, ortopedia, traumatologia e. Innesti ossei autologhi non solo sostituire l'osso mancante, ma anche sostenere il complesso processo di rigenerazione ossea. Questo comportamento favorevole autoinnesti è attribuita a tre caratteristiche: osteoconduttività, osteogenicity e osteoinduttività. Tuttavia, c'è un altro aspetto: Bone Innesti rilasciare una miriade di molecole, tra cui i fattori di crescita, che può indirizzare le cellule mesenchimali coinvolte nella rigenerazione ossea. Le proprietà paracrini di innesti ossei possono essere studiati in vitro con l'uso del mezzo-bone condizionata (BCM). Qui vi presentiamo un protocollo su come preparare medie osso condizionata da nativo corticale maiale osso, e l'osso che ha subito trattamenti termici o demineralizzazione. Le celle possono essere direttamente esposti alla BCM o seminate su biomateriali, come membrane di collagene, precedentemente ammollati con BCM. Noi diamo esempi in vitro bioassays con cellule mesenchimali sull'espressione di TGF-β geni regolati. I protocolli presentati dovrebbero incoraggiare a rivelare ulteriormente gli effetti paracrini di innesti ossei durante la rigenerazione ossea e aprire un percorso per la ricerca traslazionale nel vasto campo della chirurgia ricostruttiva.

Introduzione

Osso autologo è ampiamente utilizzato per colmare difetti che si sono verificati in conseguenza di malformazioni, resezione chirurgica, chirurgia ricostruttiva trauma, e prima dell'impianto posizionamento ^1,2. Comprendere i principi biologici di come innesti ossei sostenere il processo di consolidamento del trapianto non è solo la chiave per capire il motivo per cui autologhi sono considerati il gold standard in chirurgia ricostruttiva, è anche bionico per la migliore progettazione di sostituti ossei ^3. Eppure, il consolidamento del trapianto è più veloce con osso autologo rispetto alle sostituti ossei ^4,5. Pertanto, è imperativo rivelare i meccanismi cellulari e molecolari che rendono osso autologo in modo efficace per sostenere la rigenerazione ossea.

Tre sono le caratteristiche da manuale di autoinnesti che sono considerati a sostenere il processo di consolidamento ^6,7. In primo luogo, osso autologo è osteoconduttivo, fornendo una guida per l'osso neoformato di crescerenel difetto. In secondo luogo, osso autologo è osteogenico, il che significa che contiene cellule mesenchimali che possono differenziarsi in osteoblasti ^8. In terzo luogo, osso autologo è osteoinduttiva come fattori di crescita come le proteine ​​morfogenetiche ossee sepolti nella matrice possono avviare il processo di endocondrale o addirittura la formazione di osso intramembranosa ^9. C'è un altro aspetto: frammenti ossei preparati al momento in possesso di una funzione paracrina sulla base delle osservazioni in vitro con "medio-bone condizionata" ^10-15. Inoltre l'impatto di mielopoiesi va detto ^16. Un termine simile "medio-matrice ossea demineralizzata condizionata" è già coniato nel 1996 e sostiene il concetto generale di una funzione paracrina di osso, anche se elaborati da demineralizzazione ^17. Per i nostri scopi, BCM può essere preparato da maiale fresca mandibole ^10,11. Analisi proteomica di BCM ha rivelato la composizione complessa, tra cui effetti di crescitaors e componenti della matrice extracellulare ^10, estendendo anche la conoscenza esistente sulla proteasoma di osso intero ^18,19. Così, BCM dovrebbe riflettere l'attività rilasciata di varie modifiche di innesti ossei in vitro.

Cosa accade quando le cellule mesenchimali, per esempio quelli isolati da frammenti ossei o da tessuto molle orale, sono esposti a BCM? In vitro, BCM riduce osteogenico e differenziazione adipogenico, e provoca un forte aumento di espressione IL11 ^11. Genomica microarray rivelato più geni da esprimere differenziale in cellule mesenchimali in risposta a BCM. Tra questi geni sono adrenomedullin (ADM), IL11, IL33, NADPH ossidasi 4 (NOX4), proteoglicani 4 (PRG4, o lubricin) e pentraxina 3 (PTX3) ^15. BCM ottenuto da frammenti ossei autoclave riuscito a cambiare l'espressione dei rispettivi geni ^14. BCM da frammenti ossei sottoposti a pastorizzazione e di congelamento è stato in grado dimodificare l'espressione genica ^14. Mezzo anche condizionata di matrice ossea demineralizzata (DBM-CM) cambia l'espressione di TGF-β-regolati geni ^20. È interessante notare che, membrane barriera di collagene usato per schermare i frammenti ossei dal tessuto molle circostante ^21,22, assorbiti dalle parti del BCM che sono responsabili per i cambiamenti nell'espressione genica ^23. Ricerca BCM può essere estesa ad altri tipi di cellule coinvolte nella rigenerazione ossea come osteoclasti riassorbono l'osso e le cellule endoteliali, per citarne alcuni. Nel complesso, i dati di accumulo in vitro forniscono la base scientifica per la progettazione di uno studio preclinico.

Il presente protocollo è duplice: in primo luogo, si mostra come preparare BCM. In secondo luogo, mostra come testare la sua attività biologica a base di cellule mesenchimali in vitro.

Protocollo

1. BCM Preparazione

1. Ottenere mandibole maiale dal macellaio locale più fresco possibile. Mettere le mandibole su una superficie stabile e rilasciare un lembo a spessore completo con particolare attenzione a non lasciare alcuna tessuti molli o periostio attaccato all'osso. Lavorare in un ambiente pulito senza la necessità di lavorare sotto cappa a flusso.
2. Una volta che un lembo a spessore completo viene rilasciato, utilizzare un raschietto osso per raccogliere i frammenti ossei dal lato vestibolare. Si prega di notare che il raschietto osso deve essere forte. Maneggiare con forza il raschietto osso e con lunghi movimenti raccogliere l'osso. Eliminare frammenti ossei più piccoli che 1 mm.
   1. Per mantenere frammenti ossei nativi, inserire direttamente i frammenti ossei in piatti di plastica di 10cm di diametro medio Modified Eagle Dulbecco (DMEM) supplementato con 1% antibiotici e antimicotici, non consentendo loro di asciugarsi.
   2. Per valutare l'impatto di trattamento termico, frammenti ossei soggette alla pastorizzazione per 30 minuti a 80 ° C oautoclave per 20 minuti a 121 ° C.
   3. Per valutare l'impatto di demineralizzazione, agitare frammenti ossei in 1 M HCl per 4-6 ore a 4 ° C e lavare ripetutamente con terreno di coltura fino a pH neutro.
3. Inserire un totale di 5 g di schegge ossee per 10 ml DMEM fresco supplementato con 1% di antibiotici e antimicotici in un nuovo piatto di plastica.
4. Porre le capsule in plastica in atmosfera umidificata a 37 ° C per 24 ore. Poi, vendemmia BCM. Centrifugare il BCM a 200 g per 10 minuti per rimuovere i detriti, filtrarlo sterile (0,2 nm), e mantenere aliquote congelate a -80 ° C.
5. Scongelare il BCM azione immediatamente prima dell'uso ed evitare ripetuti cicli di congelamento e scongelamento.
6. Per gli esperimenti indicati, immergere membrane di collagene con terreno BCM o privo di siero per 1 ora a temperatura ambiente. Lavare vigorosamente le membrane con PBS e metterli in piastre da 96 pozzetti. Le membrane Wet sono seminati con le cellule.
7. Processo di preparazione BCM è riassunto in Figura 1.

2. Bioassays Sulla base di cellule mesenchimali

1. Cellule mesenchimali umane seme (per esempio cellule ossee, gengivale e fibroblasti legamento periodontale) in un 12-pozzetti con una concentrazione di 30.000 cellule / cm ^2. Per seminare le cellule utilizzano terreno di coltura costituito da DMEM, siero fetale bovino al 10% e antibiotici. Lasciate che le cellule si attaccano alla piastra O / N.
2. Eliminare il terreno di coltura e lavare le cellule con PBS pre-riscaldato a 37 ° C. Stimolare le cellule aggiungendo pre-riscaldato terreno privo di siero coltura con e senza il 20% BCM. Collocare le celle in atmosfera umidificata a 37 ° C per 24 ore.
3. Eliminare il terreno di coltura, lavare le cellule con PBS preriscaldata ed estrarre l'RNA secondo il vostro protocollo preferito.
4. Regolare la concentrazione di RNA in modo da avere la stessa quantità di RNA in ciascun campione. Preparare cDNA ed eseguire una qRT-PCR per analizzare i geni selezionati utilizzando i primers riportati in Tabella 1.
   NOTA: Queste sono le diluizioni di ogni componente: 2x SYBR verdi, 20x primer forward, 20x primer reverse, 5x acqua DD sterile, 5x cDNA. Il qRT-PCR viene eseguita in 40 cicli di 95 ° C 15 sec e 60 ° C 1 min.
5. Calcolare i livelli di espressione relativi normalizzando al gene housekeeping GAPDH utilizzando il metodo Δ (ΔCt) dove ΔCT è bersaglio CT - CT GAPDH e Δ (ΔCT) è ΔCT stimolata - ΔCT controllo.
6. Dopo questo controllo di qualità, aggiungere BCM al terreno di coltura per stimolare tutti i tipi di cellule, incluse le cellule mesenchimali, cellule ematopoietiche o cellule endoteliali.

Risultati

Bone media condizionata è preparato da freschi frammenti ossei suina. Panoramica generale del processo per preparare BCM e utilizzare biomateriali in combinazione con BCM è mostrato in Figura 1 e Figura 2 rispettivamente. Durante la preparazione BCM, è importante ottenere grandi frammenti ossei con movimenti lunghi come brevi movimenti o molto piccoli frammenti ossei può influenzare la qualità del BCM finale. Qualità di BCM può essere controllata analizzando l'espressione gen...

Discussione

Medio-Bone condizionata riflette l'attività rilasciata di innesti ossei durante le prime fasi di rigenerazione ossea. Il protocollo qui descritto può essere adattato per studiare la risposta di diversi tipi di cellule coinvolte nella rigenerazione ossea. Inoltre, il protocollo può essere utilizzato per preparare medium condizionato da riempitivi osso o osso trasformati. I metodi sono facili da eseguire e si basano su un concetto semplice: i fattori rilasciati da varie all'osso autologo ed elaborati. Capire co...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pig Mandibles	Local bucher
Bone Scraper	Hu-Friedy	PPBUSE2/36
Antibiotics & Antimicotics	All life Technologies	15240-062
Collagen Membranes (Bio-Gide)	Geistlich
Fetal Calf Serum	Invitrogen Corporation	16030074
DMEM	Invitrogen Corporation	21885-025
High Pure RNA Isolation Kit	Roche	11828665001
Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit	Roche	4379012001
Primers	Microsynth
SYBR Green (for Q-RT-PCR)	Roche	4673484001
PBS	Roche	11666789001