Kemik koşullu ortam: Hazırlama ve Biyo-

Özet

Biz kemik klimalı ortam (BCM) hazırlamak ve in vitro faaliyetlerini testi nasıl burada açıklamak.

Özet

Otolog kemik greftleri yaygın ağız ve çene cerrahisi, ortopedi, travmatoloji ve kullanılmaktadır. Otolog kemik greftleri tek eksik kemik yerini, aynı zamanda kemik rejenerasyonu karmaşık sürecini desteklemek. Otogreftlerde Bu olumlu davranış üç özelliklerine atfedilen: osteoconductivity, osteogenicity ve Osteoindüktivite. Ancak, başka bir yönü vardır: Kemik kemik rejenerasyonu yer mezenkimal hücreler hedefleyebilir büyüme faktörleri de dahil olmak üzere moleküller, sayısız serbest greft. kemik greftleri parakrin özellikleri kemik koşullu ortam (BCM) kullanılması ile in vitro olarak incelenebilir. Burada ısıl işlem veya demineralizasyonuna uygulanan bir yerel domuz kortikal kemikten kemik klimalı ortam hazırlamak için nasıl protokolü ve kemik sunuyoruz. Hücreler doğrudan BCM maruz ya da kolajen membranların, daha önce BCM ile ıslatılmış olarak biyomalzemeler, üzerine numaralı seribaşı olabilir. Biz in vitro bioassa için örnekler verirTGF-β ayarlı genlerin ifadesi üzerindeki mezenkimal hücreler ys. sunulan protokoller ayrıca kemik rejenerasyonu esnasında kemik grefti parakrin etkileri ortaya koymak ve rekonstrüktif cerrahi geniş alanda translasyonel araştırma için bir yol açmak için teşvik etmelidir.

Giriş

Otolog kemik yaygın bir malformasyon sonucu, rezektif cerrahi, rekonstrüktif travma cerrahisi, ve önceki implant yerleştirme ^1,2 olarak meydana gelen kusurları köprü için kullanılır. Kemik greftleri greft konsolidasyon sürecini destekleyen nasıl biyolojik prensiplerini anlamak otogreftleri rekonstrüktif cerrahi altın standart olarak kabul edilir anlamak için tek anahtar değil, aynı zamanda kemik yerine kullanılan ³ geliştirilmiş tasarımı Biyonik olduğunu. Yine, greft konsolidasyon hızlı otolog kemik kemik ^{4,5 'yerine} göre olduğunu. Böylece, kemik rejenerasyonu desteklemek için çok etkili otolog kemik yapmak moleküler ve hücresel mekanizmaları ortaya çıkarmak için zorunludur.

Konsolidasyon süreci ^6,7 desteklemek için kabul edilen otogreftlerde üç ders kitabı özellikleri vardır. İlk olarak, otolog kemik büyümesi yeni oluşan kemik için rehberlik sağlayarak, osteokondüktif olduğunudefekt içine. İkincisi, otolog kemik o osteoblast ⁸ ayırt edebilirsiniz mezenkimal hücreler içerdiğini, yani osteojenik olduğunu. Matris içinde Gömülmüş kemik morfogenetik proteinleri gibi büyüme faktörleri endochondral hatta intramembranöz kemik oluşumu ⁹ sürecini başlatabilir gibi Üçüncüsü, otolog kemik osteoindüktif olduğunu. Başka bir yönü var: taze hazırlanmış kemik fiş "kemik klimalı ortamda" ^10-15 ile in vitro gözlemlere dayalı bir parakrin fonksiyon tutun. Ayrıca miyelopoezle etkisi ¹⁶ söz edilmelidir. "Demineralize kemik matriks klimalı ortam" Benzer bir terim zaten demineralizasyon ¹⁷ tarafından işlenen bile, 1996 yılında icat ve kemik parakrin fonksiyon genel konsepti destekliyor edildi. Bizim amaçlarımız için, BCM ^10,11 altçeneleri taze domuz hazırlanabilir. BCM proteomik analizler büyüme aslında da dahil olmak üzere, karmaşık kompozisyon ortayaors ve hücre dışı matris ¹⁰ bileşenleri, aynı zamanda bütün kemik ^18,19 proteazomun üzerinde mevcut bilgi uzanan. Böylece, BCM in vitro kemik grefti çeşitli değişiklikler yayımlanan aktivitesini yansıtmalıdır.

Mezenkimal hücreler, örneğin kemik cips veya oral yumuşak dokusundan izole olanlar için, BCM? In vitro maruz kaldığında ne olur, BCM osteojenik ve adipojenik farklılaşma azaltır ve IL11 ifade ¹¹ güçlü bir artış kışkırtır. Genom mikrodizi diferansiyel BCM tepki olarak mezenşimsel hücrelerde ifade edilmesi daha fazla gen ortaya çıkardı. Bu genler arasında adrenomedüllin (ADM) vardır, IL11, IL33, NADPH oksidaz 4 (NOX4), proteoglikan 4 (PRG4 veya lubricin) ve 3 (PTX3) ¹⁵ pentraksin. Otoklava kemik cips elde edilen BCM ilgili genlerin ¹⁴ ifadesini değiştirmek için başarısız oldu. Pastörizasyon uygulanan ve donma kemik cips BCM başardıGen ekspresyonu ¹⁴ değiştirin. Minerali alınmış kemik matrisi (DBM-cm) da koşullandırılmış ortam, TGF-β-ayarlı genlerin ²⁰ ekspresyonunu değiştirir. İlginçtir, çevredeki yumuşak doku ^21,22 kemik yongaları korumak için kullanılan kollajen bariyer membranlar, gen ifadesi ²³ değişikliklerden sorumlu olan BCM bu parçaların adsorbe. BCM, araştırma birkaç isim, örneğin kemik erimesi ile ilgili osteoklastı ve endotelyal hücreler gibi kemik rejenerasyonu yer alan diğer hücre tipleri için genişletilebilir. Genel olarak, biriken in vitro veriler bir klinik öncesi çalışmanın tasarımı için bilimsel temelini oluşturmaktadır.

Mevcut protokol iki yönlüdür: Birincisi, BCM hazırlamak için nasıl gösterir. İkinci olarak, bu in vitro mezenkimal hücreler göre biyolojik etkinliğini test etmek için nasıl kullanılacağını gösterir.

Protokol

1. BCM Hazırlık

1. Mümkün olduğunca taze yerel kasap domuz çene kemiklerini edinin. Sağlam bir yüzeye yerleştirin altçeneleri ve tam kalınlıkta flep herhangi bir yumuşak doku bırakın veya kemiğe bağlı periost değil özel dikkat bırakın. Akış kaputu altında çalışmak gerek kalmadan temiz bir ortamda çalışın.
2. Tam kalınlıkta flep yayımlandıktan sonra, bukkal taraftan kemik cips hasat kemik kazıyıcı kullanın. Kemik kazıyıcı keskin olması gerektiğini lütfen unutmayınız. Sıkıca kemik kazıyıcı Kulp ve uzun hareketler kemik toplamak ile. Daha küçük o 1mm kemik cips atın.
   1. Doğal kemik parçası muhafaza edilmesi için,% 1 antibiyotik ve bunları kurumasına izin vermeden antimikotik ile takviye edilmiş Dulbecco Modified Eagle ortamı (DMEM) olan 10 cm çaplı plastik tabaklar doğrudan kemik parçası yerleştirin.
   2. Isıl işlem etkisini değerlendirmek için, söz konusu kemik cipsi, 80 ° C'de 30 dakika boyunca pastörizasyon ya da121 ° C'de 20 dakika süreyle otoklav.
   3. , Mineralden arındırma etkisini değerlendirmek, 4 ° C'de 4-6 saat boyunca 1 M HCI kemik yongaları çalkalayın ve pH nötr olana kadar, kültür ortamı ile tekrar tekrar yıkamak için.
3. Yeni bir plastik çanak içine% 1 antibiyotik ve antimikotik ile desteklenmiş 10 ml taze DMEM başına kemik yongaları 5 g toplam yerleştirin.
4. 24 saat boyunca 37 ° C'de nemli bir atmosferde plastik tabaklar yerleştirin. Sonra, hasat BCM. Santrifüj, artığın ayrılması steril (0.2 mil) filtre ve -80 ° C'de dondurulur alikotları tutmak için 10 dakika boyunca 200 x g'de BCM.
5. Kullanımdan hemen önce, BCM stok çözülme ve dondurma ve eritme tekrar döngülerinden kaçınmak.
6. Belirtilen deneyler için, oda sıcaklığında, 1 saat süre ile, BCM ya da serum içermeyen ortam ile kolajen zarları ıslatın. PBS ile kuvvetli bir şekilde membranlar yıkayın ve 96 gözlü levhalar içine yerleştirin. Islak membranlar hücreleri ile tohumlanır.
7. BCM hazırlık süreci Şekil 1'de özetlenmiştir.

Mezenkimal Hücreler dayanarak 2. biyolojik tayinler

1. / ^Cm2 30,000 hücrelik bir konsantrasyonda olan bir 12-çukurlu plaka içinde (örneğin, kemik hücreleri, diş eti ve periodontal ligament fibroblastlar için) Tohum insan mezenkimal hücreler. Hücreler DMEM oluşan büyüme ortamı,% 10 fetal buzağı serumu ve antibiyotiklerin kullanımı tohum. Hücreler plaka O / N eklemek edelim.
2. Kültür ortamı atılır ve 37 ° C'de önceden ısıtılmış hücrelerin PBS ile yıkayın. Ve% 20 BCM olmayan önceden ısıtılmış serum içermeyen kültür ortamı eklenerek hücrelerini uyarır. 24 saat boyunca 37 ° C'de nemli bir atmosferde hücreleri yerleştirin.
3. , Kültür ortamı atın önceden ısıtılmış PBS ile hücreleri durulayın ve tercih protokole göre RNA ayıklayın.
4. Her örnek için RNA ile aynı miktarda olması için RNA konsantrasyonu ayarlayın. CDNA'lar hazırlayın ve Tablo 1 'de gösterilen primerler kullanılarak seçilen genleri analiz etmek için QRT-PCR işlemi gerçekleştirmek.
   NOT: Bu her bileşenin seyreltmeleri şunlardır: 2x SYBR Green, 20x astar ileri, 20x primer ters, 5x steril DD su, 5x cDNA. QRT-PCR ile 95 ° C 15 saniye 40 döngü, 60 ° C 1 dakika içinde gerçekleştirilir.
5. CT GAPDH ve Δ (ACt) ACt uyarılmış olduğunu - - ACt kontrol ACt BT hedef Δ (ACt) yöntemini kullanarak temizlik gen GAPDH'ye normalleştirilmesi ile bağıl ifade seviyelerini hesaplayın.
6. Bu kalite kontrolü sonra, mezenkimal hücreler, hematopoietik hücreleri ya da endotel hücreleri dahil olmak üzere bütün hücre tipleri uyarmak için, kültür ortamına BCM ekleyin.

Sonuçlar

Kemik koşullandırılmış ortam, taze domuz kemik parçacıkları hazırlanır. Işlem genel bakış BCM hazırlamak ve BCM ile kombinasyon halinde biyomalzemeleri kullanımı, Şekil 1, sırasıyla, Şekil 2 'de gösterilmiştir. BCM hazırlanması sırasında, nihai BCM kalitesini etkileyebilir kısa hareketler ya da çok küçük kemik cips sürece hareketlerle büyük kemik cips elde etmek önemlidir. ADM, PTX3, IL11, IL33, NOX4 ve PRG4 (Şekil 3): BCM Kalitesi BCM, hedef genl...

Tartışmalar

Kemik klimalı ortam kemik rejenerasyonu erken evrelerinde kemik grefti yayımlanan aktivitesini yansıtır. Burada açıklanan protokol kemik rejenerasyonu dahil çeşitli hücre tipleri tepkisini incelemek için adapte edilebilir. Bundan başka, protokol işleme kemik veya kemik dolgu kıvamlandırılmış ortam hazırlamak için de kullanılabilir. Çeşitli yerli ve işlenmiş kemik salınan faktörler: yöntemler gerçekleştirmek ve basit bir kavram güvenmek kolaydır. Nasıl BCM anlamak mezenkimal hücreler gref...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pig Mandibles	Local bucher
Bone Scraper	Hu-Friedy	PPBUSE2/36
Antibiotics & Antimicotics	All life Technologies	15240-062
Collagen Membranes (Bio-Gide)	Geistlich
Fetal Calf Serum	Invitrogen Corporation	16030074
DMEM	Invitrogen Corporation	21885-025
High Pure RNA Isolation Kit	Roche	11828665001
Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit	Roche	4379012001
Primers	Microsynth
SYBR Green (for Q-RT-PCR)	Roche	4673484001
PBS	Roche	11666789001