Osso meio condicionado: Preparação e Bioensaio

Resumo

Descrevemos aqui como preparar meio-bone condicionado (BCM) e testar a sua actividade in vitro.

Resumo

Enxertos ósseos autólogos são amplamente utilizados em cirurgia oral e maxilofacial, ortopedia, traumatologia e. Enxertos ósseos autólogos não só substituir osso em falta, eles também suportam o complexo processo de regeneração óssea. Esse comportamento favorável dos auto-enxertos é atribuído às três características: osteocondutividade, osteogenicidade, e osteoindutividade. No entanto, há um outro aspecto: Enxerto ósseo libertar uma miríade de moléculas, incluindo factores de crescimento, que podem direcionar as células mesenquimatosas envolvidas na regeneração óssea. As propriedades parácrinos de enxertos de osso pode ser estudada in vitro através da utilização de meio condicionado de ossos (BCM). Aqui apresentamos um protocolo sobre como preparar o meio-condicionado de osso nativo osso cortical suíno e osso que foram submetidos a tratamento térmico ou desmineralização. As células podem ser directamente exposta à BCM ou semeados em biomateriais, tais como membranas de colágeno, previamente embebidos com BCM. Nós damos exemplos de in vitro bioassays com células mesenquimais sobre a expressão de TGF-β genes regulados. Os protocolos apresentados devem incentivar a revelar ainda mais os efeitos parácrinos de enxertos ósseos durante a regeneração óssea e abrir um caminho para a investigação translacional no amplo campo da cirurgia reconstrutiva.

Introdução

Ósseo autólogo é amplamente utilizado para preencher defeitos que ocorreram como consequência de malformação, a cirurgia ressectivo, a cirurgia reconstrutiva trauma, e antes da colocação do implante ^1,2. Compreender os princípios biológicos de como enxertos ósseos apoiar o processo de consolidação do enxerto não é única chave para entender porque auto-enxertos são considerados o padrão-ouro em cirurgia reconstrutiva, também é biônico para o projeto melhorado de substitutos ósseos ^3. Ainda assim, a consolidação do enxerto é mais rápido com ósseo autólogo em comparação com osso substitui ^4,5. Assim, é imperativo para revelar os mecanismos moleculares e celulares que formam osso autólogo de modo eficaz para apoiar a regeneração do osso.

Existem três características exemplares de auto-enxertos que são considerados para suportar o processo de consolidação ^6,7. Primeiro osso, autólogo é osteocondutor, fornecendo orientações para o osso recém-formado para crescerno defeito. Em segundo lugar, osso autólogo é osteogénico, o que significa que ele contém células mesenquimais que podem diferenciar-se em osteoblastos ^8. Terceiro osso, autólogo é osteoindutora como fatores de crescimento, como proteínas ósseas morfogenéticas sepultados na matriz pode iniciar o processo de endochondral ou mesmo a formação óssea intramembranosa ^9. Há um outro aspecto: fragmentos de ossos recém-preparados realizar uma função parácrina baseado nas observações in vitro com "meio-bone condicionado" ^10-15. Além disso, o impacto da mielopoese deve ser mencionado ^16. Um termo similar "meio condicionado-matriz óssea desmineralizada" já foi cunhado em 1996 e apoia o conceito global de uma função parácrina do osso, mesmo quando processados ​​por desmineralização ^17. Para nossos propósitos, BCM pode ser preparado a partir de suíno fresca mandíbulas ^10,11. Análises proteômicas de BCM revelou a composição complexa, incluindo facto crescimentoRUP e constituintes da matriz extracelular ^10, estendendo-se também ao conhecimento existente sobre o proteassoma de osso total ^18,19. Assim, BCM deve refletir a atividade liberada de várias modificações de enxertos ósseos in vitro.

O que acontece quando células mesenquimatosas, por exemplo, os isolados a partir de lascas de osso ou de tecidos moles da boca, são expostos para BCM? In vitro, o BCM reduz osteogénico e osteócito, e provoca um forte aumento da expressão IL11 ^11. Genoma de largura de microarray revelou mais genes a ser expressos diferencialmente em células mesenquimais em resposta ao BCM. Entre estes genes são adrenomedullin (ADM), IL11, IL33, NADPH oxidase 4 (Nox4), proteoglicanos 4 (PRG4, ou lubricin) e pentraxina 3 (PTX3) ^15. BCM obtido a partir de fragmentos de ossos autoclavada não conseguiu alterar a expressão dos respectivos genes ^14. BCM a partir de fragmentos de ossos que foram submetidos a pasteurização eo congelamento foi capaz dealterar a expressão do gene ^14. Meio também condicionado da matriz óssea desmineralizada (DBM-CM) muda a expressão de TGF-β genes regulados por ^20. Curiosamente, as membranas barreira de colagénio utilizadas para proteger os fragmentos de ossos do tecido mole circundante ^21,22, adsorvido às partes de BCM que são responsáveis ​​para que as alterações na expressão do gene ^23. BCM pesquisa pode ser alargado a outros tipos de células envolvidas na regeneração do osso, tais como os osteoclastos de reabsorção óssea e células endoteliais, para citar alguns. No geral, os dados in vitro acumulando proporcionar a base científica para a concepção de um estudo pré-clínico.

O presente protocolo é duplo: Primeiro, ele mostra como preparar BCM. Em segundo lugar, como mostra a testar a sua actividade biológica com base em células mesenquimais in vitro.

Protocolo

1. Preparação BCM

1. Obter mandíbulas de porco do talho local o mais fresco possível. Coloque as mandíbulas em uma superfície firme e liberar um retalho de espessura total com especial atenção para não deixar qualquer tecido mole ou periósteo fixados ao osso. Trabalhar em um ambiente limpo, sem a necessidade de trabalhar sob o capô fluxo.
2. Uma vez que um retalho de espessura total é liberado, use um raspador de osso para colher as lascas de osso do lado vestibular. Por favor note que o raspador ósseo tem de ser afiado. Manusear com firmeza o raspador ósseo e com movimentos longos recolher o osso. Descarte fragmentos de ossos menores que um milímetro.
   1. Para manter fragmentos de ossos nativas, coloque directamente os fragmentos de ossos em pratos de plástico de 10 cm de diâmetro com meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 1% antibióticos e antimicóticos não deixá-los secar.
   2. Para avaliar o impacto do processamento térmico, lascas de osso sujeito a uma pasteurização durante 30 min a 80 ° C ouautoclave durante 20 min a 121 ° C.
   3. Para avaliar o impacto de desmineralização, agitar fragmentos de ossos em HCl 1 M para 4-6 horas a 4 ° C e lava-se várias vezes com meio de cultura até o pH ser neutro.
3. Inserir um total de 5 g de pedaços de osso por 10 ml de DMEM fresco suplementado com 1% de antibióticos e antimicóticos para um novo prato de plástico.
4. Colocar as placas de plástico em uma atmosfera humidificada a 37 ° C durante 24 h. Então, colheita BCM. Centrifugar o BCM a 200 xg durante 10 min para remover os detritos, filtrá-la estéril (0,2 nM), e manter aliquotas congeladas a -80 ° C.
5. Descongele o estoque BCM imediatamente antes da utilização e evitar ciclos repetidos de congelamento e descongelamento.
6. Para as experiências indicadas, embeber as membranas de colagénio com meio BCM ou isento de soro durante 1 hora à TA. Lavar vigorosamente as membranas com PBS e colocá-los em placas de 96 poços. Membranas molhadas são semeadas com células.
7. Processo de preparação de BCM está resumida na Figura 1.

2. Os bioensaios Baseado em Células mesenquimais

1. Células mesenquimais semente humana (por exemplo, células ósseas, gengival e fibroblastos do ligamento periodontal) em uma placa de 12 poços com uma concentração de 30.000 células / ^cm2. Para semear as células usam meio de crescimento consistindo em DMEM, 10% de soro fetal de vitelo e antibióticos. Deixe as células anexar à placa O / N.
2. Descartar o meio de cultura e lava-se as células com PBS pré-aquecido a 37 ° C. Estimular as células pela adição de meio de cultura isento de soro pré-aquecido, com e sem 20% de BCM. Colocar as células numa atmosfera humidificada a 37 ° C durante 24 h.
3. Descartar o meio de cultura, lavar as células com PBS pré-aquecido e extrai-se o ARN de acordo com o seu protocolo preferido.
4. Ajustar a concentração de ARN, de modo a ter a mesma quantidade de ARN em cada amostra. Preparar ADNc e executar um de qRT-PCR para analisar os genes seleccionados utilizando os iniciadores apresentados na Tabela 1.
   NOTA: Estas são as diluições de cada componente: 2x SYBR verde, 20x iniciador directo, 20x iniciador inverso, 5x DD estéril água, 5x cDNA. O qRT-PCR é realizada em 40 ciclos de 95 ° C, 15 seg e 60 ° C 1 min.
5. Calcular os níveis de expressão relativa através da normalização para o gene GAPDH de limpeza utilizando o método Δ (ΔCt) onde é ΔCT alvo TC - CT GAPDH e Δ (ΔCT) é estimulada ΔCT - ΔCT controlo.
6. Após este controlo de qualidade, BCM adicionar ao meio de cultura para estimular a todos os tipos de células, incluindo células mesenquimais, células hematopoiéticas ou células endoteliais.

Resultados

Osso meio condicionado é preparado a partir frescos fragmentos de ossos suína. Descrição geral do processo para preparar e utilizar BCM biomateriais em combinação com BCM é mostrado na Figura 1 e Figura 2, respectivamente. Durante a preparação BCM, é importante obter grandes fragmentos de ossos com movimentos longos como movimentos curtos ou muito pequenos fragmentos de ossos pode afetar a qualidade do BCM final. Qualidade de o BCM pode ser controlada através da análise da e...

Discussão

Meio condicionado por óssea reflecte a actividade libertada de enxertos de osso durante os estágios iniciais de regeneração óssea. O protocolo aqui descrito pode ser adaptado para estudar a resposta de diferentes tipos de células envolvidas na regeneração óssea. Além disso, o protocolo pode ser utilizado para preparar o meio condicionado a partir de agentes de enchimento de osso ou ossos processados. Os métodos são fáceis de realizar e contam com um conceito simples: os fatores libertados por várias osso n...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pig Mandibles	Local bucher
Bone Scraper	Hu-Friedy	PPBUSE2/36
Antibiotics & Antimicotics	All life Technologies	15240-062
Collagen Membranes (Bio-Gide)	Geistlich
Fetal Calf Serum	Invitrogen Corporation	16030074
DMEM	Invitrogen Corporation	21885-025
High Pure RNA Isolation Kit	Roche	11828665001
Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit	Roche	4379012001
Primers	Microsynth
SYBR Green (for Q-RT-PCR)	Roche	4673484001
PBS	Roche	11666789001