Knochen konditioniertem Medium: Vorbereitung und Bioassay

Jordi Caballé-Serrano; Kosaku Sawada; Guenther Schuldt Filho; Dieter D. Bosshardt; Daniel Buser; Reinhard Gruber

doi:10.3791/52707

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In diesem Artikel

Zusammenfassung
Zusammenfassung
Einleitung
Protokoll
Ergebnisse
Diskussion
Offenlegungen
Danksagungen
Materialien
Referenzen
Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Wir beschreiben hier, wie man Knochen-konditionierten Medium (BCM) vorbereiten und testen ihre Aktivität in vitro.

Zusammenfassung

Autologe Knochentransplantate sind weit verbreitet in der MKG-Chirurgie, Orthopädie, Traumatologie und verwendet. Autologe Knochentransplantate nicht nur fehlenden Knochen zu ersetzen, sie unterstützen auch den komplexen Prozess der Knochenregeneration. Dieses günstige Verhalten des Autografts ist mit den drei Eigenschaften zugeschrieben: Osteokonduktivität, osteogenicity und Osteoinduktivität. Es besteht jedoch ein weiterer Aspekt: Knochentransplantate setzen eine Vielzahl von Molekülen, einschließlich Wachstumsfaktoren, die mesenchymalen Zellen in der Knochenregeneration beteiligten Ziel kann. Die parakrine Eigenschaften von Knochentransplantaten in vitro durch die Verwendung von Knochen-konditionierten Mediums (BCM) untersucht werden. Hier präsentieren wir ein Protokoll, wie man Knochen-konditioniertes Medium von einheimischen Schweine kortikalen Knochen vorzubereiten und Knochen, die thermische Verarbeitung oder Entsalzung unterzogen. Zellen können direkt an BCM ausgesetzt oder auf Biomaterialien, wie Kollagen Membranen, die zuvor mit BCM getränkt ausgesät werden. Wir geben Beispiele für die in vitro bioassays mit mesenchymalen Zellen auf die Expression von TGF-β reguliert Gene. Die vorgestellten Protokolle sollten ermutigen, die parakrine Wirkung von Knochentransplantaten weiter enthüllen während die Knochenregeneration und öffnen Sie einen Pfad für die translationale Forschung auf dem weiten Feld der rekonstruktiven Chirurgie.

Einleitung

Autologem Knochen wird häufig eingesetzt, um Mängel, die als Folge der Fehlbildung, resektive Chirurgie, Rekonstruktive Unfallchirurgie, und vor der Implantation ^1,2 aufgetreten brücken. Das Verständnis der biologischen Grundlagen, wie Knochentransplantate unterstützen den Prozess der Konsolidierung Transplantat ist nicht nur Schlüssel, um zu verstehen, warum Autotransplantate gelten als der Goldstandard in der rekonstruktiven Chirurgie, ist es auch bionic der verbesserten Gestaltung von Knochenersatz ^3. Dennoch ist Transplantat Konsolidierung schneller mit autologem Knochen im Vergleich zu Knochenersatz ^4,5. Daher ist es zwingend notwendig, um die molekularen und zellulären Mechanismen, die autologe Knochen so wirksam ist, um die Knochenregeneration zu unterstützen offenbaren.

Es gibt drei Lehrbuch Merkmale der Autotransplantate, die berücksichtigt werden, um den Konsolidierungsprozess ^6,7 unterstützt. Zunächst wird autologen Knochen ist osteokonduktive, die Beratung für den neu gebildeten Knochen zu wachsenin den Defekt. Zweitens ist die autologe Knochen osteogenen, dh es mesenchymalen Zellen, zu Osteoblasten differenzieren können ⁸ enthält. Drittens autologem Knochen osteoinduktiven Wachstumsfaktoren wie bone morphogenetic proteins in der Matrix vergraben können den Prozess der enchondralen oder sogar intramembranous Knochenbildung ⁹ einzuleiten. Es ist ein weiterer Aspekt: frisch hergestellten Knochenchips halten eine parakrine Funktion auf der Grundlage der in vitro-Beobachtungen mit "Knochen-konditioniertes Medium" ^10-15. Auch die Auswirkungen der Myelopoese sollte erwähnt ¹⁶ werden. Ein ähnlicher Begriff "demineralisierte Knochenmatrix-konditioniertes Medium" wurde bereits 1996 geprägt und unterstützt das Gesamtkonzept einer parakrinen Funktion von Knochen, selbst wenn sie durch Demineralisierung ¹⁷ verarbeitet. Für unsere Zwecke können BCM von frischem Schweinefleisch hergestellt werden Mandibeln ^10,11. Proteom-Analysen von BCM zeigte die komplexe Zusammensetzung, einschließlich des Wachstums der Tators und Bestandteile der extrazellulären Matrix ^10, der sich auch das vorhandene Wissen auf dem Proteasom der ganzen Knochen ^18,19. So sollte BCM spiegeln die Freigabe Aktivität verschiedener Modifikationen von Knochentransplantaten in vitro.

Was passiert, wenn mesenchymalen Zellen, beispielsweise die aus Knochenspäne oder von oralen Weichgewebe isoliert, ausgesetzt sind BCM? In vitro, BCM verringert osteogene und adipogenen Differenzierung und provoziert eine starke Zunahme der IL11 Ausdruck ^11. Genomweite Mikroarray ergab mehr Gene differentiell in mesenchymalen Zellen in Reaktion auf BCM ausgedrückt werden. Unter diesen Genen sind Adrenomedullin (ADM), IL11, IL33, NADPH-Oxidase-4 (NOX4), Proteoglycan 4 (PRG4 oder lubricin) und Pentraxin 3 (PTX3) ^15. BCM autoklaviert Knochenspänen erhalten konnte die Expression der jeweiligen Gene ¹⁴ ändern. BCM von Knochenchips, die Pasteurisierung unterzogen und das Einfrieren der Lage war,ändern Genexpression ^14. Auch konditionierte Medium demineralisierte Knochenmatrix (DBM-CM) verändert die Expression von TGF-β-regulierte Gene ^20. Interessanterweise Kollagen Barrieremembranen verwendet, um die Knochenspäne aus dem umgebenden Weichgewebe ^21,22 abzuschirmen, adsorbiert die Teile des BCM, das für die Veränderungen in der Genexpression, ²³ verantwortlich sind. BCM Forschung kann auf andere in der Knochenregeneration beteiligt wie Knochen-Osteoklasten und Endothelzellen Zelltypen erweitert werden, um einige zu nennen. Insgesamt sind die anfallenden in-vitro-Daten liefern die wissenschaftliche Grundlage für die Gestaltung einer präklinischen Studie.

Dieses Protokoll ist zweifach: Erstens zeigt es, wie man BCM vorzubereiten. Zweitens zeigt sie, wie seine biologische Aktivität getestet anhand von mesenchymalen Zellen in vitro.