Кость кондиционированной среды: Подготовка и биопроб

Резюме

Мы описываем здесь, как подготовить кости кондиционером среду (BCM) и проверить его деятельность в пробирке.

Аннотация

Аутологичные костные трансплантаты широко используется в челюстно-лицевой хирургии, ортопедии, травматологии и. Аутологичные костные трансплантаты не только заменить отсутствующий кости, они также поддерживают сложный процесс регенерации костной ткани. Это благоприятное поведение аутотрансплантатов объясняется тремя характеристиками: Остеокондуктивность, osteogenicity и остеоиндуктивность. Тем не менее, есть еще один аспект: костные трансплантаты выпустить множество молекул, в том числе факторов роста, которые могут предназначенных мезенхимных клеток, участвующих в регенерации кости. Паракринной свойства костных трансплантатов могут быть изучены в пробирке с использованием костно-кондиционированной среды (БМВ). Здесь мы приводим протокол о том, как подготовить среду кости кондиционером из родного свинья кортикальной кости, и кости, что подвергся термической обработке или деминерализации. Клетки могут быть непосредственно подвергаются BCM или высевали биоматериалов, таких как коллаген мембраны, ранее пропитанных BCM. Приведем примеры для в пробирке bioassaYS с мезенхимных клеток на экспрессию TGF-β регулируемых генов. Представленные протоколы должны поощрять дальнейшее выявить паракринные эффекты костные трансплантаты во время регенерации костной и открыть путь для трансляционных исследований в широкой области реконструктивной хирургии.

Введение

Аутокостью широко используется для преодоления недостатков, которые произошли в результате пороков развития, resective хирургии, реконструктивной хирургии травмы и до имплантации ^1,2. Понимание биологических принципов, как кости трансплантаты поддерживает процесс консолидации трансплантата является не только ключом к пониманию, почему аутографты считаются золотым стандартом в реконструктивной хирургии, это также бионической улучшенной конструкции костных заменителей ^3. Тем не менее, консолидация трансплантата быстрее аутокостью сравнению с костной заменяет ^4,5. Таким образом, крайне важно выявить молекулярные и клеточные механизмы, которые делают аутокостью так эффективной поддержки регенерации костной ткани.

Есть три учебника характеристики аутотрансплантатов, считающихся поддерживает процесс консолидации ^6,7. Во-первых, аутологичных кости остеокондуктивным, обеспечивая руководство для вновь образованной кости растив дефект. Во-вторых, аутологичной кости остеогенная, что означает, что она содержит мезенхимальные клетки, которые могут дифференцироваться в остеобласты ^8. В-третьих, аутологичных кости остеоиндуктивный, как факторы роста, такие как морфогенетические белки кости погребенных в матрице может инициировать процесс эндохондральных или даже Intramembranous формирования костной ^9. Существует еще один аспект: свежеприготовленные чипсы кости провести паракринную функцию, основанную на наблюдениях в пробирке с "средней кости кондиционером" ^10-15. Кроме воздействие миелопоэза Следует отметить, ^16. Аналогичный термин "матрица с кондиционером среднего деминерализованной кости" уже придуман в 1996 году и поддерживает общую концепцию паракринным функции костей, даже при обработке деминерализации ^17. Для наших целей, BCM могут быть получены из свежего свиньи Мандибулы ^10,11. Протеомные анализы показали, BCM сложный состав, в том числе то, ростаПРС и компоненты внеклеточного матрикса ^10, также расширяет существующие знания на протеасоме всей кости ^18,19. Таким образом, BCM должен отражать выпущенный активность различных модификаций костные трансплантаты в пробирке.

Что происходит, когда мезенхимальные клетки, например, выделенные из костной стружки или из мягкой ткани полости рта, подвергаются BCM? В пробирке, BCM уменьшает остеогенной дифференцировки и Adipogenic, и провоцирует сильное увеличение экспрессии IL11 ^11. Геном шириной микрочипов показали несколько генов, которые будут по-разному выражается в мезенхимальных клеток в ответ на ВСМ. Среди этих генов адреномедуллин (АДМ), IL11, IL33, НАДФН-оксидазы (4 NOX4), протеогликан 4 (PRG4 или лубрицином) и pentraxin 3 (PTX3) ^15. BCM получены из автоклавного фишек кости не удалось изменить выражение соответствующих генов ^14. BCM от кости чипов, которые прошли пастеризацию и замораживание удалосьизменить экспрессию генов ^14. Также кондиционером среднего деминерализованной костной матрицы (ДКМ-CM) изменяет экспрессию TGF-β-регулируемых генов ^20. Интересно, что коллаген барьерные Мембраны, используемые для защиты кусочков кости от окружающих мягких тканей ^21,22, адсорбированный те части ВСМ, которые отвечают за изменений в экспрессии генов ^23. BCM исследования могут быть распространены на другие типы клеток, участвующих в регенерации кости, такие как кости резорбции остеокластов и эндотелиальных клеток, чтобы назвать несколько. В целом, данные накапливаются в пробирке обеспечить научную основу для дизайна доклинических исследований.

Настоящий Протокол два: во-первых, он показывает, как подготовить BCM. Во-вторых, она показывает, как проверить его биологическую активность на основе мезенхимальных клеток в пробирке.

протокол

1. Подготовка BCM

1. Получить свинью челюсти от местного мясника, как свежие, как это возможно. Поместите челюсти на твердую поверхность и отпустите всю толщину лоскута уделяя особое внимание, чтобы не оставить никакого мягкие ткани или надкостницы прикреплены к кости. Работа в чистой окружающей среде, без необходимости работать под капотом потока.
2. После того, как всю толщину лоскута освобожден, использовать кости скребок для уборки костных чипсов из ротовой стороне. Пожалуйста, обратите внимание, что кости скребок должен быть острым. Ручка твердо кости скребок и с длинными движения собрать кости. Откажитесь кости чипы меньше 1 мм, что.
   1. Для поддержания родные фишки кости, поместить непосредственно костных чипов в пластиковых блюд 10см диаметром со средой Игла в модификации Игла (DMEM) с добавлением 1% антибиотиков и противогрибковых средств не давая им высыхать.
   2. Чтобы оценить влияние термической обработки, подлежащие костной стружкой пастеризации в течение 30 мин при 80 ° С илиавтоклаве в течение 20 мин при 121 ° С.
   3. Чтобы оценить влияние деминерализации, встряхнуть костной стружки в 1 М HCl в течение 4-6 ч при 4 ° С и мыть раз культуральной средой до тех пор, пока рН не является нейтральным.
3. Поместите в общей сложности 5 г костной стружкой в ​​10 мл свежей среды DMEM, дополненной 1% антибиотиков и противогрибковых средств в новую пластиковую чашку.
4. Поместите пластиковую посуду в увлажненной атмосфере при 37 ° С в течение 24 ч. Тогда, урожай BCM. Центрифуга ВСМ при 200g в течение 10 мин для удаления мусора, фильтровать стерильной (0,2 нм), и держать аликвоты замораживали при -80 ° С.
5. Оттепель BCM акции непосредственно перед использованием и во избежание повторных циклов замораживания и оттаивания.
6. Для указанных экспериментов, впитать коллагеновые мембраны с ВСМ или бессывороточной среде в течение 1 часа при комнатной температуре. Вымойте энергично мембраны с PBS и поместить их в 96-луночных планшетах. Влажные мембраны клеток высевали с.
7. Процесс подготовки ВСМ приводится на рисунке 1.

2. Биопробы на основе мезенхимальных клеток

1. Семенной человека мезенхимальные клетки (например костных клеток, десны и пародонта связок фибробластов) в 12-луночного планшета с концентрацией 30000 клеток / см ^2. Чтобы отобрать клетки используют ростовой среды, состоящей из DMEM, 10% фетальной телячьей сыворотки и антибиотики. Пусть клетки прикрепляются к пластина O / N.
2. Отменить культуральной среды и промыть клетки с подогретого PBS при 37 ° С. Стимулирование клеток путем добавления подогретого бессывороточной культуральной среды с и без 20% ВСМ. Поместите клетки в увлажненной атмосфере при 37 ° С в течение 24 ч.
3. Откажитесь от культуральной среды, промыть клетки с подогретого PBS и извлечь РНК в соответствии с вашим предпочтительного протокола.
4. Регулировка концентрации РНК, чтобы иметь то же самое количество РНК в каждом образце. Готовят кДНК и выполнить Qrt-ПЦР для анализа выбранных генов с использованием праймеров, показанных в таблице 1.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эти разведения каждого компонента: 2x SYBR зеленый, 20x грунт вперед, 20x грунт наоборот, 5x стерильной воды ДД, 5x кДНК. Qrt-ПЦР проводили в 40 циклов 95 ° С 15 сек и 60 ° С 1 мин.
5. Рассчитать относительные уровни экспрессии по нормализации в генной уборка GAPDH с использованием метода Δ (& Delta; CТ), где & Delta; CТ является целевой КТ - КТ GAPDH и Δ (& Delta; CТ) является & Delta; CТ стимулировали - & Delta; CТ управления.
6. После этого контроль качества, чтобы добавить ВСМ культуральной среды, чтобы стимулировать все типы клеток, включая мезенхимальные клетки, гемопоэтические клетки или эндотелиальные клетки.

Результаты

Костный кондиционированной среды получают из свежих свиных костной стружкой. Общий обзор процесса подготовить ВСМ и использовать биоматериалов в комбинации с БМВ показано на фиг.1 и 2, соответственно. Во время подготовки ВСМ, важно, чтобы получить большие фишки кости ...

Обсуждение

Кость кондиционером среднего отражает выпущен деятельность костных имплантатов во время ранних стадиях регенерации костной ткани. Протокол, описанный здесь, может быть адаптирован для изучения реакции различных типов клеток, участвующих в регенерации кости. Кроме того, протокол мож?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pig Mandibles	Local bucher
Bone Scraper	Hu-Friedy	PPBUSE2/36
Antibiotics & Antimicotics	All life Technologies	15240-062
Collagen Membranes (Bio-Gide)	Geistlich
Fetal Calf Serum	Invitrogen Corporation	16030074
DMEM	Invitrogen Corporation	21885-025
High Pure RNA Isolation Kit	Roche	11828665001
Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit	Roche	4379012001
Primers	Microsynth
SYBR Green (for Q-RT-PCR)	Roche	4673484001
PBS	Roche	11666789001