Os milieu conditionné: Préparation et essais biologiques

Résumé

Nous décrivons ici comment préparer milieu de l'os de la climatisation (BCM) et de tester son activité in vitro.

Résumé

Greffes osseuses autologues sont largement utilisés dans la chirurgie orale et maxillo-faciale, orthopédie, traumatologie et. Greffes osseuses autologues ne remplacent pas seulement os manquant, ils soutiennent également le processus complexe de la régénération osseuse. Ce comportement favorable des autogreffes est attribuée aux trois caractéristiques: ostéoconductivité, osteogenicity et ostéoinductivité. Cependant, il est un autre aspect: Greffons osseux libérer une multitude de molécules, y compris les facteurs de croissance, qui peuvent cibler des cellules mésenchymateuses impliquées dans la régénération osseuse. Les propriétés paracrines des greffes osseuses peuvent être étudiés in vitro par l'utilisation du support d'os conditionné (BCM). Ici, nous présentons un protocole sur la façon de préparer le milieu de l'os cortical conditionné à partir natif de porc os et l'os qui a subi un traitement thermique ou déminéralisation. Les cellules peuvent être directement exposés à la BCM ou ensemencées sur les biomatériaux, tels que les membranes de collagène, préalablement trempées avec BCM. Nous donnons des exemples pour in vitro bioassays avec des cellules mésenchymateuses sur l'expression des gènes régulés par le TGF-β. Les protocoles présentés devraient inciter à révéler davantage les effets paracrines de greffes osseuses pendant la régénération osseuse et ouvrir un chemin pour la recherche translationnelle dans le vaste domaine de la chirurgie reconstructive.

Introduction

Osseuse autologue est largement utilisé pour combler les défauts qui ont eu lieu à la suite d'une malformation, une chirurgie d'exérèse, la chirurgie traumatologique reconstructive, et avant le placement de l'implant ^1,2. Comprendre les principes biologiques de la façon dont les greffons osseux soutenir le processus de consolidation de la greffe est non seulement la clé pour comprendre pourquoi autogreffes sont considérés comme l'étalon-or en chirurgie reconstructive, il est également bionique pour améliorer la conception des substituts osseux ^3. Pourtant, la consolidation de la greffe est plus rapide avec de l'os autologue par rapport à ^4,5 substituts osseux. Ainsi, il est impératif de révéler les mécanismes moléculaires et cellulaires qui font osseuse autologue si efficace pour soutenir la régénération osseuse.

Il ya trois caractéristiques de manuels de autogreffes qui sont considérés pour soutenir le ^6,7 de processus de consolidation. Tout d'abord, l'os autologue est ostéoconducteur, fournissant des orientations pour l'os nouvellement formé à croîtredans le défaut. Deuxièmement, l'os autologue est ostéogénique, ce qui signifie qu'il contient des cellules mésenchymateuses qui peuvent se différencier en ostéoblastes ^8. Troisièmement, l'os autologue est ostéoinductrice comme des facteurs de croissance comme les protéines morphogénétiques osseuses ensevelis dans la matrice peuvent initier le processus de endochondral ou même intramembranaire formation osseuse ^9. Il ya un autre aspect: éclats d'os fraîchement préparés détiennent une fonction paracrine sur la base des observations in vitro avec «milieu de l'os-conditionné" ^10-15. De plus l'impact de la myélopoïèse ¹⁶ convient de mentionner. Un terme similaire "milieu de la matrice osseuse déminéralisée conditionné" a déjà été inventé en 1996 et soutient le concept global d'une fonction paracrine de l'os, même lorsque traité par déminéralisation ^17. Pour nos fins, BCM peut être préparé à partir de porc fraîche mandibules ^10,11. Analyses protéomiques de BCM a révélé la composition complexe, y compris effet de la croissanceors et constituants de la matrice extracellulaire ^10, étendant également les connaissances actuelles sur le protéasome de l'os ensemble ^18,19. Ainsi, BCM devrait refléter l'activité libéré de diverses modifications de greffes osseuses in vitro.

Qu'est-ce qui se passe lorsque les cellules mésenchymateuses, par exemple celles qui sont isolées à partir de fragments d'os ou de tissus mous de la bouche, sont exposés à BCM? In vitro, BCM réduit ostéogénique et la différenciation adipocytaire, et provoque une forte augmentation de l'expression de ¹¹ IL11. Génome large microréseau a révélé plusieurs gènes d'être exprimés de manière différentielle dans des cellules mésenchymateuses en réponse à BCM. Parmi ces gènes sont adrénomédulline (ADM), IL11, IL33, la NADPH oxydase 4 (NOX4), des protéoglycanes 4 (PRG4 ou lubricin) et pentraxine 3 (PTX3) ^15. BCM obtenu à partir de copeaux d'os autoclave n'a pas réussi à modifier l'expression des gènes respectifs ^14. BCM à partir de fragments d'os qui ont subi la pasteurisation et de congélation a pumodifier l'expression des gènes ^14. Aussi milieu conditionné de la matrice osseuse déminéralisée (DBM-CM) modifie l'expression du TGF-β gènes régulés ^20. Fait intéressant, les membranes de barrière de collagène utilisées pour protéger les copeaux d'os du tissu mou environnant ^21,22, adsorbés les parties de BCM qui sont responsables de l'évolution de l'expression du gène ^23. la recherche de BCM peut être étendu à d'autres types de cellules impliquées dans la régénération osseuse tels que les ostéoclastes de résorption osseuse et les cellules endothéliales, pour ne nommer que quelques-uns. Globalement, les données d'accumulation in vitro fournissent la base scientifique pour la conception d'une étude préclinique.

Le présent protocole est double: d'abord, il montre comment préparer BCM. Deuxièmement, il montre comment tester son activité biologique à base de cellules mésenchymateuses in vitro.

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Protocole

1. Préparation BCM

1. Obtenir mandibules de porcs du boucher local aussi frais que possible. Placez les mandibules sur une surface ferme et libérer un lambeau de pleine épaisseur accordant une attention particulière à ne pas laisser tout tissu doux ou périoste fixé à l'os. Travailler dans un environnement propre, sans la nécessité de travailler sous la hotte à flux.
2. Une fois un lambeau de pleine épaisseur est libéré, utiliser un grattoir osseuse pour récolter les éclats d'os du côté buccal. S'il vous plaît noter que le grattoir osseuse doit être forte. Poignée fermement le grattoir osseuse et avec de longs mouvements recueillent l'os. Jeter éclats d'os plus petits que de 1mm.
   1. Pour maintenir les éclats d'os natifs, placer directement les éclats d'os dans les plats en plastique de 10 cm de diamètre avec un milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) supplémenté avec 1% d'antibiotiques et antimycosiques ne pas les laisser se dessécher.
   2. Pour évaluer l'impact du traitement thermique, éclats d'os soumis à une pasteurisation pendant 30 min à 80 ° C ouautoclave pendant 20 min à 121 ° C.
   3. Pour évaluer l'impact de la déminéralisation, secouez éclats d'os dans 1 M de HCL pour 4-6 heures à 4 ° C et les laver à plusieurs reprises avec un milieu de culture jusqu'à ce que le pH est neutre.
3. Placez un total de 5 g de copeaux d'os par 10 ml de DMEM frais complété avec 1% d'antibiotiques et antimycosiques dans un nouveau récipient de plastique.
4. Placez les plats en plastique dans une atmosphère humidifiée à 37 ° C pendant 24 heures. Ensuite, la récolte BCM. Centrifugeuse la BCM à 200 g pendant 10 min pour éliminer les débris, filtrer stérile (0,2 nm), et de garder aliquotes congelées à -80 ° C.
5. Décongeler le BCM de stock immédiatement avant utilisation et d'éviter les cycles de gel et dégel.
6. Pour les expériences indiquées, faire tremper les membranes de collagène avec le milieu BCM ou sans sérum pendant 1 heure à température ambiante. Laver vigoureusement les membranes avec du PBS et les placer dans des plaques 96 puits. Membranes humides sont ensemencées avec des cellules.
7. processus de préparation du BCM est résumé dans la figure 1.

2. Bioassays à base de cellules mésenchymateuses

1. les cellules mésenchymateuses humaines graines (par exemple des cellules osseuses, gingivale et les fibroblastes du ligament parodontal) dans une plaque à 12 puits avec une concentration de 30 000 cellules / cm ^2. Pour ensemencer les cellules utilisent un milieu de croissance constitué de DMEM, 10% de sérum de veau foetal et des antibiotiques. Laissez les cellules attachent à la plaque O / N.
2. Jeter le milieu de culture et laver les cellules avec PBS préchauffé à 37 ° C. Stimuler les cellules en ajoutant préchauffé milieu de culture sans sérum avec et sans 20% BCM. Placer les cellules dans une atmosphère humidifiée à 37 ° C pendant 24 heures.
3. Jeter le milieu de culture, rincer les cellules avec PBS préchauffé et extraire l'ARN selon votre protocole préféré.
4. Ajuster la concentration de l'ARN afin d'avoir la même quantité d'ARN dans chaque échantillon. Préparer des ADNc et effectuer une qRT-PCR pour analyser les gènes sélectionnés en utilisant les amorces indiquées dans le tableau 1.
   NOTE: Ce sont les dilutions de chaque composant: 2x SYBR Green, 20x amorce avant, 20x amorce inverse, 5x eau DD stérile, 5x ADNc. Le qRT-PCR est réalisée en 40 cycles de 95 ° C 15 s et 60 ° C 1 min.
5. Calculer les niveaux d'expression relatifs en normalisant la GAPDH de gène de ménage en utilisant la méthode Δ (ACt) où ACt est la cible de CT - CT GAPDH et Δ (ACt) est stimulée ACt - ACt contrôle.
6. Après ce contrôle de la qualité, BCM ajouter au milieu de culture pour stimuler tous les types de cellules comprenant des cellules mésenchymateuses, des cellules hématopoïétiques ou des cellules endothéliales.

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Résultats

Os milieu conditionné est préparé à partir de frites fraîches d'os de porc. Aperçu général du processus pour préparer BCM et à utiliser en combinaison avec des biomatériaux BCM est illustré à la figure 1 et la figure 2, respectivement. Lors de la préparation de la BCM, il est important d'obtenir de grandes éclats d'os avec de longs mouvements que les mouvements de courte durée ou de très petits éclats d'os peut affecter la qualité de la BCM finale. Qua...

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Discussion

Support d'os conditionné reflète l'activité libéré de greffons osseux au cours des premiers stades de la régénération osseuse. Le protocole décrit ici peut être adapté à étudier la réponse de différents types de cellules impliquées dans la régénération osseuse. En outre, le protocole peut être utilisé pour préparer un milieu conditionné à partir de transformés os ou des charges. Les méthodes sont faciles à réaliser et de compter sur un concept simple: les facteurs libérés à partir ...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pig Mandibles	Local bucher
Bone Scraper	Hu-Friedy	PPBUSE2/36
Antibiotics & Antimicotics	All life Technologies	15240-062
Collagen Membranes (Bio-Gide)	Geistlich
Fetal Calf Serum	Invitrogen Corporation	16030074
DMEM	Invitrogen Corporation	21885-025
High Pure RNA Isolation Kit	Roche	11828665001
Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit	Roche	4379012001
Primers	Microsynth
SYBR Green (for Q-RT-PCR)	Roche	4673484001
PBS	Roche	11666789001