الاستفادة من الفحص لينة آجار مستعمرة تشكيل لالتعرف مثبطات Tumorigenicity في خلايا سرطان الثدي

Summary

Here, we document the use of the soft agar colony formation assay to test the effects of a peptidylarginine deiminase (PADI) enzyme inhibitor, BB-Cl-amidine, on breast cancer tumorigenicity in vitro.

Abstract

Given the inherent difficulties in investigating the mechanisms of tumor progression in vivo, cell-based assays such as the soft agar colony formation assay (hereafter called soft agar assay), which measures the ability of cells to proliferate in semi-solid matrices, remain a hallmark of cancer research. A key advantage of this technique over conventional 2D monolayer or 3D spheroid cell culture assays is the close mimicry of the 3D cellular environment to that seen in vivo. Importantly, the soft agar assay also provides an ideal tool to rigorously test the effects of novel compounds or treatment conditions on cell proliferation and migration. Additionally, this assay enables the quantitative assessment of cell transformation potential within the context of genetic perturbations. We recently identified peptidylarginine deiminase 2 (PADI2) as a potential breast cancer biomarker and therapeutic target. Here we highlight the utility of the soft agar assay for preclinical anti-cancer studies by testing the effects of the PADI inhibitor, BB-Cl-amidine (BB-CLA), on the tumorigenicity of human ductal carcinoma in situ (MCF10DCIS) cells.

Introduction

Both non-transformed (normal) and transformed cells can readily proliferate in a 2D monolayer culture. This form of adherent cell growth is quite dissimilar from that which occurs in vivo where, in the absence of mitogenic stimulation, cells do not often rapidly divide within their microenvironment. The soft agar assay on the other hand is distinct from 2D culture systems because it quantifies tumorigenicity by measuring a cell’s ability to proliferate and form colonies in suspension within a semi-solid agarose gel¹. In this setting, non-transformed cells are unable to rapidly propagate in the absence of anchorage to the extracellular matrix (ECM) and undergo apoptosis, a process known as anoikis. In contrast, cells that have undergone malignant transformation lose their anchorage dependence due to activation of signaling pathways such as phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)/Akt and Rac/Cdc42/PAK. Therefore, these cells are able to grow and form colonies within the semi-solid soft agar matrix².

A common use of the soft agar assay is to test whether specific compounds, such as PADI inhibitors, are able to suppress tumor growth in vitro. In general, colony count or colony sizes are quantitative read-outs from the assay that can be compared between control and treatment groups to assess differences in cellular tumorigenicity. Therefore, if one finds that colony formation is inversely correlated with increasing drug concentration, then a conclusion could be drawn that the drug is an effective inhibitor of tumorigenicity in vitro. On the other hand, if the drug does not affect colony formation, the drug is either not at the appropriate dosage or it is not an effective tumorigenic inhibitor. Aside from using a soft agar assay to test the anti-tumor effect of a drug, this assay can also be used to probe the relationship between a specific gene and tumorigenesis. For example, the effect of suppressing PADI2 expression on tumorigenicity can be addressed by PADI2-specific siRNA treatment.

PADIs are calcium-dependent enzymes that post-translationally modify proteins by converting positively charged arginine residues into neutrally charged citrulline in a process known as citrullination or deimination^3-5. We have recently found that peptidylarginine deiminase 2 (PADI2) may function as a novel breast cancer biomarker and that PADI inhibitors represent candidate therapies for early stage breast cancers⁶. For example, we have previously demonstrated that a “pan-PADI” inhibitor, Cl-amidine, suppresses the proliferation of breast cancer cells using 2D monolayers and that the inhibitor suppressed the growth of 3D tumor spheroids⁶. In this report, we extend these studies, and highlight the utility of the soft agar assay, by testing the efficacy of a new PADI inhibitor, BB-CLA, in suppressing the growth of MCF10DCIS breast cancer colonies⁷. We note that we used MCF10DCIS cells for this experiment because they are oncogenic derivatives of non-transformed human MCF10A cells and because they contain high steady state levels of PADI2 protein⁸. We hypothesize that PADI2 enzymatic activity plays a key role in the tumorigenicity of this cell line and that BB-CLA-mediated inhibition of PADI2 activity will suppress cancer progression.

Protocol

1. إعداد 3٪ 2-هيدروكسي إيثيل الاغاروز

1. إلى الجافة زجاجة نظيفة، 100 مل، إضافة 0.9 غرام من 2-هيدروكسي إيثيل الاغاروز (الاغاروز السابع) تليها 30 مل من الماء المقطر.
2. الميكروويف الخليط لمدة 15 ثانية، وبلطف دوامة. كرر هذه الخطوة لا يقل عن ثلاث مرات حتى يذوب مسحوق الاغاروز تماما.
3. الأوتوكلاف الزجاجة التي تحتوي على حل لمدة 15 دقيقة.
4. السماح الحل الاغاروز ليبرد لRT قبل استخدامها مرة أخرى. تخزين الحل في RT.

2. إعداد الطبقة السفلية: 0.6٪ الاغاروز جل

1. قبل عدة الحارة 5 مل و 10 مل ماصات في 37 ° C حاضنة لمنع الاغاروز من التصلب في ماصة عند التعامل مع.
2. تخفيف جزء من غطاء زجاجة والميكروويف 3٪ 2-هيدروكسي إيثيل الحل الاغاروز مسبقة الصنع لمدة 15 ثانية. ثم، دوامة بلطف الحل والميكروويف لمدة 15 ثانية أخرى. تحذير: كن حذرا عندما يحوم agaroالحل ذاته لأن الحل ترتفع عند تعرضها للهواء، ويمكن أن تمتد.
3. إذا كان هناك هلام الصلبة المتبقية في زجاجة، الميكروويف لبضع ثوان.
4. إبقاء زجاجة تحتوي على الحل الاغاروز في 45 ° C حمام الماء خلال الخطوات التالية لمنع الحل الاغاروز من ترسيخ قبل الأوان.
5. وسائل الإعلام MCF10DCIS الدافئ في 37 ° C حمام الماء. ملاحظة: يتكون MCF10DCIS وسائل الإعلام من DMEM / F12، 5٪ مصل الحصان، 5٪ البنسلين ستربتومايسين.
6. نقل 3 مل من محلول الاغاروز 3٪ باستخدام ماصات قبل تحسنت في العقيمة 50 مل أنبوب مخروطي الشكل.
7. على الفور إضافة 12 مل من وسائل الإعلام MCF10DCIS الدافئة وعكس بلطف أنبوب مخروطي لخلط الاغاروز مع وسائل الإعلام. ليس محاولة لتشكيل أي فقاعات لأنها سوف تتداخل مع مستعمرة العد في وقت لاحق.
8. بلطف إضافة 2 مل من هذا الخليط في كل بئر من لوحة الثقافة 6 جيدا دون تشكيل أي فقاعات الهواء.
9. احتضان 6 جيدا لوحة الثقافة افقياLLY على سطح مستو عند 4 درجة مئوية لمدة 1 ساعة للسماح للخليط ليصلب.
10. بعد يتصلب الخليط، ووضع لوحة في الحاضنة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. الطبقة السفلى هي الآن جاهزة للاستخدام.

3. إعداد طبقة التي تحتوي على الخلايا: 0.3٪ الاغاروز جل

1. خلايا يعرض للتريبسين MCF10DCIS وتمييع منهم إلى تركيز خلية من 4 × 10 ⁴ / مل.
2. خذ 2 مل من الاغاروز 3٪ باستخدام ماصات قبل تحسنت ونقل إلى العقيمة 50 مل أنبوب مخروطي الشكل.
3. إضافة على الفور 8 مل من MCF10DCIS وسائل الإعلام إلى أنبوب مخروطي الشكل وعكس بلطف لمزج الاغاروز مع وسائل الإعلام. تجنب تشكيل أي فقاعات.
4. خذ 2 مل من الخلايا MCF10DCIS (4 × 10 ⁴ / مل)، وعلاج مع BB-CLA (0 ميكرومتر (DMSO) أو 1 ميكرومتر).
5. في 1: 1 التخفيف، ومزيج من الخلايا التي تحتوي على الاغاروز 0.6٪.
6. تأخذ 1 مل من الخليط خلية الاغاروز وإضافة بلطف على الطبقة السفلية من 6 جيدا ثقافة صفي وقت متأخر (2 × 10 ⁴ خلية / مل).
7. وضع لوحة ثقافة 6 جيدا أفقيا على سطح مستو عند 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة على الأقل للسماح الطبقة العليا ليصلب.
8. بعد يتصلب الخليط، ووضع لوحة في حاضنة C 37 درجة لمدة أسبوع قبل أن يضيف طبقة التغذية.

4. إعداد طبقة الطاعم: 0.3٪ الاغاروز جل

1. الميكروويف 3٪ 2-هيدروكسي إيثيل الحل الاغاروز مسبقة الصنع لمدة 15 ثانية. دوامة بلطف الحل والميكروويف لمدة 15 ثانية أخرى.
2. تتوازن الزجاجة الحل الاغاروز في حمام مائي 45 ° C.
3. تدفئة وسائل الإعلام MCF10DCIS في حمام مائي 37 ° C.
4. مزيج 1 مل من 3٪ حل الاغاروز مع 9 مل من وسائل الإعلام MCF10DCIS الدافئ في 50 مل أنبوب مخروطي الشكل وعكس بلطف لمزج الاغاروز مع وسائل الإعلام. تجنب تشكيل فقاعات الهواء.
5. علاج الخليط مع BB-CLA (0 ميكرومتر (DMSO) أو 1 ميكرومتر).
6. بلطف إضافة 1 مل من هذا الخليط (بدون لمينغ فقاعات) في كل بئر من لوحة الثقافة 6 جيدا تحتوي على القاع وطبقات لينة.
7. وضع لوحة ثقافة 6 جيدا أفقيا على سطح مستو عند 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة على الأقل للسماح للخليط ليصلب.
8. بعد ترسخ الطبقة المغذية، وضع لوحة في الحاضنة 37 درجة مئوية.
9. كرر هذا الإجراء أسبوعيا التغذية التي تتراكب 1 مل من 0.3٪ محلول الاغاروز / متوسطة / العلاج على طبقة المغذية الموجودة لتجديد الخلايا مع وسائل الإعلام الجديدة حتى لوحظ تشكيل مستعمرة. ملاحظة: آجار في الطبقات الناعمة والمغذية لينة جدا، وبالتالي فإن العناصر الغذائية المضافة من الطبقة المغذية منتشر بسهولة إلى الطبقة التي تحتوي على خلية للوصول إلى الخلايا.

5. جمع البيانات

1. بعد 2،5 أسابيع من نمو الخلايا في أجار لينة، وحساب عدد المستعمرات في كل بئر باستخدام المجهر الضوئي. لتسهيل الكمي، طباعة الشبكة على الشفافية وإرفاق شبكة للوحة 6 جيدا للمساعدة في تحديد موقع حيث كانت الخلايا أثناء الفرز. منذ حجم مستعمرة (كما كميا من قطر كل مستعمرة) سوف تختلف، تحديد مسبق حجم مستعمرة مرجعية لتحديد المستعمرات سيتم سجل. على سبيل المثال، تشمل أحجام مستعمرة من 70 ميكرون أو أكبر في تحليل البيانات.
2. تخزين العينات في 4 درجات مئوية لمنع المزيد من تشكيل مستعمرة والعد في المستقبل. ختم لوحة الثقافة 6 جيدا مع parafilm لمنع المواد الهلامية من الجفاف.

النتائج

لينة أجار تشكيل مستعمرة الفحص يمكن استخدامها لمجموعة واسعة من التطبيقات توثيق tumorigenicity الخلايا السرطانية. والميزة الرئيسية لهذا الأسلوب هو أن المصفوفة شبه صلبة تفضل بشكل انتقائي من نمو الخلايا التي يمكن أن تتكاثر بطريقة-مرسى مستقل. وعرضت هذه الصفة بشكل رئيسي من قبل ?...

Discussion

معدل تكوين مستعمرة في أجار لينة يختلف باختلاف نوع من الخلايا ^9. ولذلك، فإن عدد الخلايا لبدء ينبغي أن يكون الأمثل وتبعا لذلك مع. وهناك مجموعة انطلاق المقترح هو بين 5 × ^02-01 أكتوبر × 10 ⁴ خلايا لكل بئر باستخدام لوحة 6 جيدا. بالإضافة إلى ذلك، حجم مستعمرة يختل?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zeiss Axiopot	Carl Zeiss Microscopy	1021859251
Inverted Microscope	Olympus	CKX41
DMEM/F-12	Lonza BioWhittaker	12-719F
HyClone Donor Equine Serum	Fisher Scientific	SH30074.03
Penicillin Streptomycin	Life Technologies	15140-122
2-Hydroxyethylagarose: Type VII, low gelling temperature	Sigma-Aldrich	39346-81-1