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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Here, we document the use of the soft agar colony formation assay to test the effects of a peptidylarginine deiminase (PADI) enzyme inhibitor, BB-Cl-amidine, on breast cancer tumorigenicity in vitro.

Zusammenfassung

Given the inherent difficulties in investigating the mechanisms of tumor progression in vivo, cell-based assays such as the soft agar colony formation assay (hereafter called soft agar assay), which measures the ability of cells to proliferate in semi-solid matrices, remain a hallmark of cancer research. A key advantage of this technique over conventional 2D monolayer or 3D spheroid cell culture assays is the close mimicry of the 3D cellular environment to that seen in vivo. Importantly, the soft agar assay also provides an ideal tool to rigorously test the effects of novel compounds or treatment conditions on cell proliferation and migration. Additionally, this assay enables the quantitative assessment of cell transformation potential within the context of genetic perturbations. We recently identified peptidylarginine deiminase 2 (PADI2) as a potential breast cancer biomarker and therapeutic target. Here we highlight the utility of the soft agar assay for preclinical anti-cancer studies by testing the effects of the PADI inhibitor, BB-Cl-amidine (BB-CLA), on the tumorigenicity of human ductal carcinoma in situ (MCF10DCIS) cells.

Einleitung

Both non-transformed (normal) and transformed cells can readily proliferate in a 2D monolayer culture. This form of adherent cell growth is quite dissimilar from that which occurs in vivo where, in the absence of mitogenic stimulation, cells do not often rapidly divide within their microenvironment. The soft agar assay on the other hand is distinct from 2D culture systems because it quantifies tumorigenicity by measuring a cell’s ability to proliferate and form colonies in suspension within a semi-solid agarose gel1. In this setting, non-transformed cells are unable to rapidly propagate in the absence of anchorage to the extracellular matrix (ECM) and undergo apoptosis, a process known as anoikis. In contrast, cells that have undergone malignant transformation lose their anchorage dependence due to activation of signaling pathways such as phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)/Akt and Rac/Cdc42/PAK. Therefore, these cells are able to grow and form colonies within the semi-solid soft agar matrix2.

A common use of the soft agar assay is to test whether specific compounds, such as PADI inhibitors, are able to suppress tumor growth in vitro. In general, colony count or colony sizes are quantitative read-outs from the assay that can be compared between control and treatment groups to assess differences in cellular tumorigenicity. Therefore, if one finds that colony formation is inversely correlated with increasing drug concentration, then a conclusion could be drawn that the drug is an effective inhibitor of tumorigenicity in vitro. On the other hand, if the drug does not affect colony formation, the drug is either not at the appropriate dosage or it is not an effective tumorigenic inhibitor. Aside from using a soft agar assay to test the anti-tumor effect of a drug, this assay can also be used to probe the relationship between a specific gene and tumorigenesis. For example, the effect of suppressing PADI2 expression on tumorigenicity can be addressed by PADI2-specific siRNA treatment.

PADIs are calcium-dependent enzymes that post-translationally modify proteins by converting positively charged arginine residues into neutrally charged citrulline in a process known as citrullination or deimination3-5. We have recently found that peptidylarginine deiminase 2 (PADI2) may function as a novel breast cancer biomarker and that PADI inhibitors represent candidate therapies for early stage breast cancers6. For example, we have previously demonstrated that a “pan-PADI” inhibitor, Cl-amidine, suppresses the proliferation of breast cancer cells using 2D monolayers and that the inhibitor suppressed the growth of 3D tumor spheroids6. In this report, we extend these studies, and highlight the utility of the soft agar assay, by testing the efficacy of a new PADI inhibitor, BB-CLA, in suppressing the growth of MCF10DCIS breast cancer colonies7. We note that we used MCF10DCIS cells for this experiment because they are oncogenic derivatives of non-transformed human MCF10A cells and because they contain high steady state levels of PADI2 protein8. We hypothesize that PADI2 enzymatic activity plays a key role in the tumorigenicity of this cell line and that BB-CLA-mediated inhibition of PADI2 activity will suppress cancer progression.

Protokoll

1. Herstellung von 3% 2-Hydroxyethyl Agarose

  1. In einem sauberen, trockenen 100 ml-Glasflasche, fügen Sie 0,9 g 2-Hydroxyethyl Agarose (Agarose VII), gefolgt von 30 ml destilliertem Wasser.
  2. Mikrowelle die Mischung für 15 Sekunden und leicht schwenken. Wiederholen Sie diesen Schritt mindestens drei weitere Male, bis die Agarose-Pulver vollständig auflöst.
  3. Autoklavieren der Lösung enthaltende Flasche für 15 min.
  4. Lassen Sie die Agarose-Lösung auf RT vor der weiteren Verwendung abkühlen. Bewahren Sie die Lösung bei RT.

2. Herstellung der Unterschicht: 0,6% Agarosegel

  1. Vorwärmen mehrere 5 ml und 10 ml-Pipetten in einem Inkubator bei 37ºC, um die Agarose erstarrt in der Pipette bei der Handhabung zu verhindern.
  2. Teilweise lösen Sie die Flaschendeckel und Mikrowelle die vorgefertigten 3% 2-Hydroxyethyl Agarose-Lösung für 15 Sekunden. Dann sanft schwenken Sie die Lösung und Mikrowelle für weitere 15 sec. ACHTUNG: Seien Sie vorsichtig beim Schwenken des agarose Lösung, da die Lösung erhebt sich an der Luft und können überschwappen.
  3. Wenn es Rest festes Gel in der Flasche, Mikrowelle für ein paar Sekunden.
  4. Halten Sie die Flasche mit der Agarose-Lösung in einem 45 ° C Wasserbad während der nächsten Schritte, um die Agarose-Lösung verfestigt vorzeitig zu verhindern.
  5. Warm MCF10DCIS Medien in einem 37 ° C Wasserbad. Anmerkung: MCF10DCIS Medien besteht aus DMEM / F12, 5% Pferdeserum, 5% Penicillin-Streptomycin.
  6. Übertragungs 3 ml der 3% igen Lösung unter Verwendung der vorgewärmten Pipetten in einem sterilen 50 ml konischen Röhrchen.
  7. Sofort im 12 ml warmem MCF10DCIS Medien und vorsichtig umdrehen das konische Röhrchen, um die Agarose mit den Medien zu mischen. Versuchen Sie nicht, alle Blasen zu bilden, wie es mit der Koloniezahl später stören.
  8. Vorsichtig 2 ml dieser Mischung in jede Vertiefung einer 6-Well-Kulturplatte hinzufügen, ohne die Bildung von Luftblasen.
  9. Inkubieren Sie die 6-well-Kulturplatte horizontally auf einer flachen Oberfläche bei 4 ° C für 1 Stunde, damit die Mischung zu verfestigen.
  10. Nachdem die Mischung sich verfestigt, legen Sie die Platte in einem 37 ° C Inkubator für 30 Minuten. Die untere Schicht ist jetzt einsatzbereit.

3. Herstellung der zellhaltigen Schicht: 0,3% Agarosegel

  1. Trypsinize MCF10DCIS Zellen und verdünnen, um eine Zellkonzentration von 4 x 10 4 / ml.
  2. Nehmen Sie 2 ml der 3% igen mit vorgewärmten Pipetten und Überführung in eine sterile 50 ml konischen Röhrchen.
  3. Sofort an den konischen Rohr 8 ml MCF10DCIS Medien und vorsichtig umdrehen, um die Agarose mit den Medien zu mischen. Vermeiden Sie bilden keine Blasen.
  4. Nehmen Sie 2 ml der MCF10DCIS Zellen (4 x 10 4 / ml) und behandle mit BB-CLA (0 uM (DMSO) oder 1 & mgr; M).
  5. In einem 1: 1-Verdünnung, Mischen der Zellen mit 0,6% Agarose.
  6. Nimm 1 ml der Zelle-Agarose-Mischung und schonend hinzuzufügen auf die untere Schicht der 6-Well-Kultur pspät (2 x 10 4 Zellen / ml).
  7. Platzieren Sie die 6-well-Kulturplatte horizontal auf einer flachen Oberfläche bei 4 ° C für mindestens 15 Minuten, damit die obere Schicht zu verfestigen.
  8. Nachdem die Mischung sich verfestigt, legen Sie die Platte in einem 37 ° C Inkubator für eine Woche vor der Zugabe des Fütterungsschicht.

4. Vorbereitung der Feeder-Schicht: 0,3% Agarosegel

  1. Mikrowelle die vorgefertigten 3% 2-Hydroxyethyl Agarose-Lösung für 15 Sekunden. sanft schwenken Sie die Lösung und Mikrowelle für weitere 15 sec.
  2. Äquilibrieren Sie die Agarose-Lösung Flasche in einem 45 ° C Wasserbad.
  3. Wärmen Sie die MCF10DCIS Medien in einem 37 ° C Wasserbad.
  4. Mix 1 ml 3% Agarose-Lösung mit 9 ml warmem MCF10DCIS Medium in einem 50 ml konischen Röhrchen und vorsichtig umgedreht, um die Agarose zu den Medien mischen. Vermeiden Sie Luftblasen bilden.
  5. Behandlung der Mischung mit BB-CLA (0 & mgr; (DMSO) oder 1 & mgr; M).
  6. Vorsichtig 1 ml dieser Mischung (ohne fürming Blasen) in jedes Well der 6-Well-Kulturplatte, die den Boden und weichen Schichten.
  7. Platzieren Sie die 6-well-Kulturplatte horizontal auf einer flachen Oberfläche bei 4 ° C für mindestens 15 min, die Mischung zu verfestigen.
  8. Nachdem der Feeder-Schicht erstarrt, legen Sie die Platte in einem 37 ° C Inkubator.
  9. Wiederholen Sie diese Prozedur Zufuhr wöchentlich durch Überlagerung von 1 ml 0,3% Agarose / mittel / Behandlungslösung auf den vorhandenen Futterschicht, um die Zellen mit neuen Medien aufzufüllen, bis die Koloniebildung beobachtet. Hinweis: Agar in den weichen und Feeder-Schichten sehr weich ist, und daher wird die zugesetzten Nährstoffe aus der Feeder-Schicht leicht in die Zellen enthaltende Schicht diffundieren, um die Zellen zu erreichen.

5. Data Collection

  1. Nach 2,5 Wochen Zellwachstum in dem weichen Agar, zählen die Anzahl der Kolonien in jeder Vertiefung unter Verwendung eines Lichtmikroskops. Um eine Quantifizierung zu ermöglichen, drucken Sie ein Raster auf eine Transparenz und befestigen Sie das Raster, um die6-Well-Platte, um zu lokalisieren, wo die Zellen während der Zählung sind. Da Koloniegröße (wie durch den Durchmesser jeder Kolonie quantifiziert) variiert vordefinieren eine Referenzkoloniegröße zu bestimmen, welche Kolonien erzielt wird. Beispielsweise umfassen Koloniegrößen von 70 um oder in der Datenanalyse größer.
  2. Lagern die Proben bei 4 ° C weiter Koloniebildung und für zukünftige Zählung zu verhindern. Verschließen Sie den 6-Well-Kulturplatte mit Parafilm, um die Gele vor dem Austrocknen zu verhindern.

Ergebnisse

Die Koloniebildung in Weichagar-Assay kann für eine breite Palette von Anwendungen dokumentieren die Tumorigenität von Krebszellen verwendet werden. Ein Hauptvorteil dieser Technik ist, dass die halbfeste Matrix selektiv begünstigt das Wachstum von Zellen, die in einem verankerungsunabhängigen Weise vermehren können. Diese Eigenschaft wird hauptsächlich durch die Krebszellen, aber nicht von normalen Zellen zeigten. Verwendet werden vor allem diese Technik, um die Wirksamkeit der Hemmung des Tumorwachstums durch Me...

Diskussion

Die Rate der Koloniebildung in Weichagar in Abhängigkeit von dem Zelltyp 9 abhängig. Daher ist die Anzahl von Zellen mit zu optimieren und entsprechend angepasst werden starten. Eine vorgeschlagene Startbereich liegt zwischen 5 x 2 bis 01 Oktober x 10 4 Zellen pro Vertiefung unter Verwendung einer 6-Well-Platte. Außerdem variiert Koloniegröße von der Wachstumsrate jeder Zelle abhängig. Daher wird ein vordefinierter ein cut-off für die Koloniegröße erforderlich, um einzelne Kolon...

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Danksagungen

We are thankful to Dr. Richard Cerione, Dr. Marc Antonyak, and Kelly Sullivan, Cornell University, for providing technical advice, and to Dr. Gerlinde Van de Walle, Cornell University, for sharing their Olympus CKX41 inverted microscope.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Zeiss AxiopotCarl Zeiss Microscopy1021859251
Inverted MicroscopeOlympusCKX41
DMEM/F-12Lonza BioWhittaker12-719F
HyClone Donor Equine SerumFisher ScientificSH30074.03
Penicillin StreptomycinLife Technologies15140-122
2-Hydroxyethylagarose: Type VII, low gelling temperatureSigma-Aldrich39346-81-1

Referenzen

  1. Hamburger, A. W., Salmon, S. E. Primary bioassay of human tumor stem cells. Science. 197, 461-463 (1977).
  2. Wang, L. H. Molecular signaling regulating anchorage-independent growth of cancer cells. Mt Sinai J Med. 71 (6), 361-367 (2004).
  3. Vossenaar, E. R., Zendman, A. J., van Venrooij, W. J., Pruijn, G. J. PAD, a growing family of citrullinating enzymes: genes, features and involvement in disease. Bioessays. 25 (11), 1106-1118 (2003).
  4. Horibata, S., Coonrod, S. A., Cherrington, B. D. Role for peptidylarginine deiminase enzymes in disease and female reproduction. J Reprod Dev. 58 (3), 274-282 (2012).
  5. Mohanan, S., Cherrington, B. D., Horibata, S., McElwee, J. L., Thompson, P. R., Coonrod, S. A. Potential role of peptidylarginine deiminase enzymes and protein citrullination in cancer pathogenesis. Biochem Res Int. , 895343 (2012).
  6. McElwee, J. L., et al. Identification of PADI2 as a potential breast cancer biomarker and therapeutic target. BMC Cancer. 12, 500 (2012).
  7. Knight, J. S., et al. Peptidylarginine deiminase inhibition disrupts NET formation and protects against kidney, skin and vascular disease in lupus-prone MRL/lpr mice. Ann Rheum Dis. , 1-8 (2014).
  8. Miller, F. R., Santner, S. J., Tait, L., Dawson, P. J. MCF10DCIS.com xenograft model of human comedo ductal carcinoma in situ. J Natl cancer Inst. 92, 1185-1186 (2000).
  9. Fan, D., Morgan, L. R., Schneider, C., Blank, H., Fan, S. Cooperative evaluation of human tumor chemosensitivity in the soft-agar assay and its clinical correlations. J Cancer Res Clin Oncol. 109, 23-28 (2000).
  10. Hamburger, A. W., White, C. P., Dunn, F. E., Citron, M. L., Hummel, S. Modulation of human tumor colony growth in soft agar by serum. Int J Cell Cloning. 1 (4), 216-229 (1983).
  11. Anderson, S. N., Towne, D. L., Burns, D. J., Warrior, U. A high-throughput soft agar assay for identification of anticancer compound. J Biomol Screen. 12, 938-945 (2007).

Nachdrucke und Genehmigungen

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