Yumuşak Agar koloni oluşturma deneyi kullanılması Meme Kanseri Hücrelerinde tümör oluşum nedenlerinin nin inhibitörlerini teşhis etmek üzere

Özet

Here, we document the use of the soft agar colony formation assay to test the effects of a peptidylarginine deiminase (PADI) enzyme inhibitor, BB-Cl-amidine, on breast cancer tumorigenicity in vitro.

Özet

Given the inherent difficulties in investigating the mechanisms of tumor progression in vivo, cell-based assays such as the soft agar colony formation assay (hereafter called soft agar assay), which measures the ability of cells to proliferate in semi-solid matrices, remain a hallmark of cancer research. A key advantage of this technique over conventional 2D monolayer or 3D spheroid cell culture assays is the close mimicry of the 3D cellular environment to that seen in vivo. Importantly, the soft agar assay also provides an ideal tool to rigorously test the effects of novel compounds or treatment conditions on cell proliferation and migration. Additionally, this assay enables the quantitative assessment of cell transformation potential within the context of genetic perturbations. We recently identified peptidylarginine deiminase 2 (PADI2) as a potential breast cancer biomarker and therapeutic target. Here we highlight the utility of the soft agar assay for preclinical anti-cancer studies by testing the effects of the PADI inhibitor, BB-Cl-amidine (BB-CLA), on the tumorigenicity of human ductal carcinoma in situ (MCF10DCIS) cells.

Giriş

Both non-transformed (normal) and transformed cells can readily proliferate in a 2D monolayer culture. This form of adherent cell growth is quite dissimilar from that which occurs in vivo where, in the absence of mitogenic stimulation, cells do not often rapidly divide within their microenvironment. The soft agar assay on the other hand is distinct from 2D culture systems because it quantifies tumorigenicity by measuring a cell’s ability to proliferate and form colonies in suspension within a semi-solid agarose gel¹. In this setting, non-transformed cells are unable to rapidly propagate in the absence of anchorage to the extracellular matrix (ECM) and undergo apoptosis, a process known as anoikis. In contrast, cells that have undergone malignant transformation lose their anchorage dependence due to activation of signaling pathways such as phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)/Akt and Rac/Cdc42/PAK. Therefore, these cells are able to grow and form colonies within the semi-solid soft agar matrix².

A common use of the soft agar assay is to test whether specific compounds, such as PADI inhibitors, are able to suppress tumor growth in vitro. In general, colony count or colony sizes are quantitative read-outs from the assay that can be compared between control and treatment groups to assess differences in cellular tumorigenicity. Therefore, if one finds that colony formation is inversely correlated with increasing drug concentration, then a conclusion could be drawn that the drug is an effective inhibitor of tumorigenicity in vitro. On the other hand, if the drug does not affect colony formation, the drug is either not at the appropriate dosage or it is not an effective tumorigenic inhibitor. Aside from using a soft agar assay to test the anti-tumor effect of a drug, this assay can also be used to probe the relationship between a specific gene and tumorigenesis. For example, the effect of suppressing PADI2 expression on tumorigenicity can be addressed by PADI2-specific siRNA treatment.

PADIs are calcium-dependent enzymes that post-translationally modify proteins by converting positively charged arginine residues into neutrally charged citrulline in a process known as citrullination or deimination^3-5. We have recently found that peptidylarginine deiminase 2 (PADI2) may function as a novel breast cancer biomarker and that PADI inhibitors represent candidate therapies for early stage breast cancers⁶. For example, we have previously demonstrated that a “pan-PADI” inhibitor, Cl-amidine, suppresses the proliferation of breast cancer cells using 2D monolayers and that the inhibitor suppressed the growth of 3D tumor spheroids⁶. In this report, we extend these studies, and highlight the utility of the soft agar assay, by testing the efficacy of a new PADI inhibitor, BB-CLA, in suppressing the growth of MCF10DCIS breast cancer colonies⁷. We note that we used MCF10DCIS cells for this experiment because they are oncogenic derivatives of non-transformed human MCF10A cells and because they contain high steady state levels of PADI2 protein⁸. We hypothesize that PADI2 enzymatic activity plays a key role in the tumorigenicity of this cell line and that BB-CLA-mediated inhibition of PADI2 activity will suppress cancer progression.

Protokol

% 3 2-Hidroksietil Agaroz hazırlanması 1.

1. Temiz ve kuru bir 100 ml'lik cam şişe içine, damıtılmış su, 30 ml, ardından 2-hidroksietil agaroz (Agaroz VII) 0.9 g.
2. 15 saniye hafifçe için karışım girdap mikrodalga. Agaroz tozu tamamen eriyene kadar bu adımı en az üç kez daha tekrarlayın.
3. 15 dakika için çözelti içeren bir şişe otoklava.
4. Agaroz çözüm daha kullanımdan önce oda sıcaklığına kadar soğumasını bekleyin. Oda sıcaklığında çözelti saklayın.

Alt Katman 2. Hazırlık:% 0.6 Agaroz Jel

1. Tutarken pipet katılaşmasını agaroz önlemek için 5 ml 37 ° C kuluçka makinesi içinde 10 mi pipetler önceden sıcak birçok.
2. Kısmen şişe kapağı ve mikrodalga 15 saniye önceden yapılmış% 3 2-hidroksietil agaroz çözümü gevşetin. Daha sonra, yumuşak bir 15 sn için çözelti ve mikrodalga girdap. DİKKAT: Agaro dönen dikkatli olunse çözümü çözüm havaya maruz ve yayılabilir zaman yükselir çünkü.
3. Şişede kalan katı jel, birkaç saniye mikrodalga varsa.
4. Erken katılaşmasını agaroz çözüm önlemek için bir sonraki adımları sırasında 45 ° C su banyosunda agaroz solüsyon içeren şişe tutun.
5. 37 ° C su banyosu içinde sıcak MCF10DCIS ortamı. Not: MCF10DCIS ortam DMEM / F12,% 5 at serumu,% 5 penisilin streptomisin oluşur.
6. Aktarım steril 50 ml konik bir tüp içine önceden ısıtılmış pipetler kullanılarak% 3 agaroz çözeltisi 3 mi.
7. Hemen sıcak MCF10DCIS medya 12 ml ekleyin ve hafifçe medya ile agaroz karıştırmak için konik tüp ters. Bu koloni sonradan sayım engel olacak herhangi bir kabarcıkları oluşturmak için çalışın.
8. Yavaşça hava kabarcıklarını oluşturucu olmayan bir 6-yuvalı kültür plakasının her bir oyuğuna, bu karışım 2 ml ekleyin.
9. 6-çukurlu kültür plakası Horizonta inkübelly, 1 saat boyunca 4 ° C 'de, düz bir yüzeye karışımın sertleşmesine izin vermek.
10. Karışım katılaşmasından sonra, 30 dakika boyunca 37 ° C inkübatör içine plaka yerleştirin. alt tabaka artık kullanıma hazırdır.

Hücre içeren katmanın 3. hazırlanması:% 0.3 agaroz jel

1. Trypsinize MCF10DCIS hücreler 4 x 10 ⁴ / ml'lik bir hücre konsantrasyonuna seyreltilmesi ve.
2. Bir steril 50 ml konik bir tüp içine önceden ısıtılmış pipetler ve transferi ile% 3 agaroz 2 ml alın.
3. Hemen konik tüp MCF10DCIS medya 8 ml ekleyin ve hafifçe medya ile agaroz karıştırmak için ters. Herhangi kabarcıkları oluşturan kaçının.
4. (0 uM (DMSO) ya da 1 uM) MCF10DCIS hücreleri (4 x 10 ⁴ / ml) 2 ml alın ve BB-CLA ile tedavi edilir.
5. Bir 1: 1 seyreltme,% 0.6 agaroz ile hücrelerin karışımı.
6. Hücre-agaroz karışımının 1 ml alın ve yavaşça 6 oyuklu kültür p alt tabakanın üzerine eklemekGeç (2 x 10 ⁴ hücre / ml).
7. Üst tabaka katılaşmaya izin vermek için en az 15 dakika boyunca 4 ° C 'de, düz bir yüzeye yatay 6 oyuklu kültür plakasına yerleştirin.
8. Karışım katılaşmasından sonra, besleme tabakanın ilave edilmeden önce bir hafta boyunca 37 ° C inkübatör içine plaka yerleştirin.

Besleyici Katman 4. Hazırlanması:% 0.3 Agaroz Jel

1. Mikrodalga 15 saniye önceden yapılmış% 3 2-Hidroksietil agaroz çözüm. yavaşça başka bir 15 saniye için çözüm ve mikrodalga girdap.
2. 45 ° C su banyosu içinde agaroz çözelti şişe dengelenmesi.
3. 37 ° C su banyosunda MCF10DCIS medyayı ısıtın.
4. 50 ml konik bir tüp içine, sıcak MCF10DCIS ortam 9 ml% 3 agaroz çözeltisi 1 ml karıştırın ve yavaşça ortam ile agaroz karıştırmak için ters. Hava kabarcıkları oluşturarak kaçının.
5. BB-CLA ile karışım (0 uM (DMSO) ya da 1 uM) tedavi edin.
6. Yavaşça için olmayan (bu karışıma 1 ml ekleMing alt ve yumuşak tabakalar ihtiva eden 6 oyuklu kültür plakasının her oyuğuna) kabarcıklar.
7. Karışım, katılaşmaya izin vermek için en az 15 dakika boyunca 4 ° C 'de, düz bir yüzeye yatay 6 oyuklu kültür plakasına yerleştirin.
8. Besleyici tabakası katılaşır sonra, 37 ° C inkübatör içine plaka yerleştirin.
9. Koloni oluşumu gözlenir kadar yeni medya ile hücreleri doldurmak için mevcut besleyici tabakası üzerine% 0.3 agaroz / orta / işleme çözeltisinin 1 ml kaplayan bu beslenme prosedürü haftalık tekrarlayın. Not: Agar yumuşak ve besleyici tabakalar bundan dolayı, besleyici tabaka ile ilgili ilave besinler kolaylıkla hücreler ulaşmak için hücre içeren bir tabaka halinde yayılır, çok yumuşak ve.

5. Veri Toplama

1. Yumuşak agar içinde hücre büyümesinin 2.5 hafta sonra, her bir göze, bir ışık mikroskobu kullanarak koloni sayısı. Ölçümü kolaylaştırmak için, bir şeffaflık üzerine ızgara yazdırmak ve ızgara takmak6-plaka hücreleri sayma sırasında nerede bulmanıza yardımcı olmak için. (Her koloninin çapı ile miktarı gibi) koloni büyüklüğü değişebilir olduğundan, atılır olan koloniler belirlemek için bir referans koloni boyutunu önceden tanımlamak. Örneğin, 70 mikron ya da veri analizinde büyük bir koloni boyutları içerir.
2. Daha fazla koloni oluşumunu ve gelecekteki sayım önlemek için 4 ° C'de örnekleri saklayın. Kurumasını önlemek için jeller Parafilm ile 6-kuyu kültür plaka Seal.

Sonuçlar

yumuşak agar koloni oluşturma deneyi kanser hücrelerinin tümör oluşum nedenlerinin belgeleyen çok geniş bir uygulama aralığı için kullanılabilir. Bu tekniğin önemli bir avantajı, yan-katı bir matris seçici bir ankrajdan bağımsız bir şekilde prolifere olabilir hücrelerin büyümesini yana olmasıdır. Bu özellik esas olarak, kanser hücreleri tarafından değil, normal hücreler tarafından sergilenir. Öncelikle ilaçlar ile tümör büyüme inhibisyonu etkinliğini test etmek için, meme kanseri...

Tartışmalar

yumuşak agar içinde koloni oluşumu oranı hücre tipi ⁹ bağlı olarak değişir. Bu nedenle, hücre sayısı optimize edilmiş ve buna uygun olarak ayarlanmalıdır ile başlayın. Önerilen bir başlangıç ​​aralığı oyuk, 6 oyuklu plaka kullanılarak göz başına ^{4 ila} 10 x ^02-1 Ekim x 5 arasındaki hücreleridir. Buna ek olarak, koloni büyüklüğü her bir hücrenin büyüme hızına bağlı olarak değişir. Bu nedenle, koloni boyutu için önceden tanımlanmış bir cu...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zeiss Axiopot	Carl Zeiss Microscopy	1021859251
Inverted Microscope	Olympus	CKX41
DMEM/F-12	Lonza BioWhittaker	12-719F
HyClone Donor Equine Serum	Fisher Scientific	SH30074.03
Penicillin Streptomycin	Life Technologies	15140-122
2-Hydroxyethylagarose: Type VII, low gelling temperature	Sigma-Aldrich	39346-81-1