Utilização do ensaio de formação de colónia agar mole para identificar inibidores de tumorigenicidade em células de cancro da mama

Resumo

Here, we document the use of the soft agar colony formation assay to test the effects of a peptidylarginine deiminase (PADI) enzyme inhibitor, BB-Cl-amidine, on breast cancer tumorigenicity in vitro.

Resumo

Given the inherent difficulties in investigating the mechanisms of tumor progression in vivo, cell-based assays such as the soft agar colony formation assay (hereafter called soft agar assay), which measures the ability of cells to proliferate in semi-solid matrices, remain a hallmark of cancer research. A key advantage of this technique over conventional 2D monolayer or 3D spheroid cell culture assays is the close mimicry of the 3D cellular environment to that seen in vivo. Importantly, the soft agar assay also provides an ideal tool to rigorously test the effects of novel compounds or treatment conditions on cell proliferation and migration. Additionally, this assay enables the quantitative assessment of cell transformation potential within the context of genetic perturbations. We recently identified peptidylarginine deiminase 2 (PADI2) as a potential breast cancer biomarker and therapeutic target. Here we highlight the utility of the soft agar assay for preclinical anti-cancer studies by testing the effects of the PADI inhibitor, BB-Cl-amidine (BB-CLA), on the tumorigenicity of human ductal carcinoma in situ (MCF10DCIS) cells.

Introdução

Both non-transformed (normal) and transformed cells can readily proliferate in a 2D monolayer culture. This form of adherent cell growth is quite dissimilar from that which occurs in vivo where, in the absence of mitogenic stimulation, cells do not often rapidly divide within their microenvironment. The soft agar assay on the other hand is distinct from 2D culture systems because it quantifies tumorigenicity by measuring a cell’s ability to proliferate and form colonies in suspension within a semi-solid agarose gel¹. In this setting, non-transformed cells are unable to rapidly propagate in the absence of anchorage to the extracellular matrix (ECM) and undergo apoptosis, a process known as anoikis. In contrast, cells that have undergone malignant transformation lose their anchorage dependence due to activation of signaling pathways such as phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)/Akt and Rac/Cdc42/PAK. Therefore, these cells are able to grow and form colonies within the semi-solid soft agar matrix².

A common use of the soft agar assay is to test whether specific compounds, such as PADI inhibitors, are able to suppress tumor growth in vitro. In general, colony count or colony sizes are quantitative read-outs from the assay that can be compared between control and treatment groups to assess differences in cellular tumorigenicity. Therefore, if one finds that colony formation is inversely correlated with increasing drug concentration, then a conclusion could be drawn that the drug is an effective inhibitor of tumorigenicity in vitro. On the other hand, if the drug does not affect colony formation, the drug is either not at the appropriate dosage or it is not an effective tumorigenic inhibitor. Aside from using a soft agar assay to test the anti-tumor effect of a drug, this assay can also be used to probe the relationship between a specific gene and tumorigenesis. For example, the effect of suppressing PADI2 expression on tumorigenicity can be addressed by PADI2-specific siRNA treatment.

PADIs are calcium-dependent enzymes that post-translationally modify proteins by converting positively charged arginine residues into neutrally charged citrulline in a process known as citrullination or deimination^3-5. We have recently found that peptidylarginine deiminase 2 (PADI2) may function as a novel breast cancer biomarker and that PADI inhibitors represent candidate therapies for early stage breast cancers⁶. For example, we have previously demonstrated that a “pan-PADI” inhibitor, Cl-amidine, suppresses the proliferation of breast cancer cells using 2D monolayers and that the inhibitor suppressed the growth of 3D tumor spheroids⁶. In this report, we extend these studies, and highlight the utility of the soft agar assay, by testing the efficacy of a new PADI inhibitor, BB-CLA, in suppressing the growth of MCF10DCIS breast cancer colonies⁷. We note that we used MCF10DCIS cells for this experiment because they are oncogenic derivatives of non-transformed human MCF10A cells and because they contain high steady state levels of PADI2 protein⁸. We hypothesize that PADI2 enzymatic activity plays a key role in the tumorigenicity of this cell line and that BB-CLA-mediated inhibition of PADI2 activity will suppress cancer progression.

Protocolo

1. Preparação de 3% de 2-Hidroxietil agarose

1. Em uma, seco de 100 ml frasco de vidro limpo, adicionar 0,9 g de 2-hidroxietilo de agarose (agarose VII), seguido por 30 ml de água destilada.
2. Micro-ondas a mistura durante 15 seg e agitar suavemente. Repita este passo pelo menos mais três vezes até que o pó se dissolve totalmente agarose.
3. Autoclavar a garrafa contendo solução durante 15 min.
4. Permitir que a solução de agarose a arrefecer até à temperatura ambiente antes de utilização posterior. Guardar a solução à TA.

2. Preparação da camada inferior: 0,6% do gel de agarose

1. Pré-quente vários 5 ml e 10 ml pipetas num banho a 37 ° C para evitar a incubadora de agarose de solidificação na pipeta durante o manuseamento.
2. Parcialmente soltar a tampa do frasco e microondas a 3% de solução de pré-fabricados de agarose a 2-hidroxietil durante 15 seg. Em seguida, agite suavemente a solução e microondas por mais 15 segundos. CUIDADO: Tenha cuidado quando agitando o agarosolução se porque a solução sobe quando exposto ao ar e pode transbordar.
3. Se houver gel sólido residual no frasco, com microondas, durante mais alguns segundos.
4. Manter o frasco contendo a solução de agarose, num banho de 45 ° C a água durante os próximos passos para impedir que a solução de agarose de solidificação prematura.
5. Mídia MCF10DCIS quente em um banho de água a 37 ° C. Nota: meios MCF10DCIS consiste de DMEM / F12, 5% de soro de cavalo, 5% de penicilina estreptomicina.
6. Transferência de 3 ml da solução de agarose a 3% utilizando as pipetas pré-aquecido para uma estéril tubo de 50 ml.
7. Imediatamente adicione 12 ml de mídia MCF10DCIS quentes e inverter cuidadosamente o tubo cônico para misturar a agarose com a mídia. Tente não formam quaisquer bolhas que pode interferir com a contagem das colónias mais tarde.
8. Adicionar cuidadosamente 2 ml desta mistura para cada poço de uma placa de cultura de 6 cavidades, sem formar quaisquer bolhas de ar.
9. Incubar a placa de 6 poços de cultura horizontally sobre uma superfície plana, a 4 ° C durante 1 h para permitir que a mistura de solidificar.
10. Após as mistura solidificar, colocar a placa numa incubadora a 37 ° C durante 30 min. A camada inferior é agora pronto para o uso.

3. Preparação da Camada contendo celular: 0,3% do gel de agarose

1. Tripsinizar as células e dilui-los MCF10DCIS a uma concentração celular de 4 x 10 ⁴ / ml.
2. 2 ml de agarose a 3% usando pipetas pré-aquecida e transferir para um tubo de 50 mL estéril cónico.
3. Imediatamente adicionar 8 ml de mídia MCF10DCIS para o tubo cônico e gentilmente inverter para misturar a agarose com a mídia. Evite a formação de bolhas.
4. 2 ml de células MCF10DCIS (4 x 10 ⁴ / ml) e trata-se com BB-CLA (0 uM (DMSO) ou 1 uM).
5. Em uma diluição de 1: 1, misturar as células com agarose a 0,6%.
6. Tomar 1 ml da mistura de células-agarose e adicionar suavemente sobre a camada de fundo da cultura de 6 poços ptardios (2 x 10 ⁴ células / mL).
7. Colocar a placa de cultura de 6 poços horizontalmente sobre uma superfície plana, a 4 ° C durante pelo menos 15 minutos para permitir que a camada superior solidificar.
8. Após as mistura solidificar, colocar a placa num incubador a 37 ° C durante uma semana antes de se adicionar a camada de alimentação.

4. Preparação da Camada de alimentador: 0,3% do gel de agarose

1. Microondas a 3% de 2-Hidroxietil solução de agarose pré-fabricados durante 15 seg. agite suavemente a solução e microondas por mais 15 segundos.
2. Equilibrar o frasco de solução de agarose, num banho de água a 45 ° C.
3. Aquecer os meios MCF10DCIS num banho de água a 37 ° C.
4. Misture 1 ml de solução de agarose 3% com 9 ml de mídia MCF10DCIS quente em um tubo de 50 ml e gentilmente inverter para misturar a agarose com a mídia. Evite a formação de bolhas de ar.
5. Tratar a mistura com BB-CLA (0 uM (DMSO) ou 1 uM).
6. Suavemente adicionar 1 ml desta mistura (sem paraming bolhas) em cada poço da placa de cultura de 6 poços contendo o fundo e as camadas macias.
7. Colocar a placa de cultura de 6 poços horizontalmente sobre uma superfície plana, a 4 ° C durante pelo menos 15 minutos para permitir que a mistura de solidificar.
8. Após a camada alimentadora solidifica, colocar a placa num incubador de 37 ° C.
9. Repetir este procedimento semanalmente alimentação sobrepondo 1 ml de solução de agarose / médio / tratamento de 0,3% para a camada de alimentação existente para repor as células com novos meios, até a formação de colónias é observado. Nota: Agar nas camadas moles e de alimentação é muito suave e, por conseguinte, os nutrientes adicionados a partir da camada de alimentação irá facilmente difundir-se na camada contendo as células para atingir as células.

5. Coleta de Dados

1. Depois de 2,5 semanas de crescimento celular no agar mole, contar o número de colónias em cada poço usando um microscópio de luz. Para facilitar a quantificação, imprimir uma grade em uma transparência e anexar a grade para o6-poços para ajudar a localizar onde as células são, durante a contagem. Uma vez que o tamanho da colónia (como quantificado por o diâmetro de cada colónia) irá variar, predefinir um tamanho de colónias de referência para determinar quais as colónias serão marcados. Por exemplo, incluem dimensões das colónias de 70 mm ou maior na análise de dados.
2. Armazenar as amostras a 4 ° C para evitar uma maior formação de colónias e de contagem futuro. Selar a placa de cultura de 6 poços com Parafilm para evitar que os géis de secar.

Resultados

O ensaio de formação de colónias em ágar mole pode ser utilizado para uma larga gama de aplicações que documentam a tumorigenicidade das células cancerosas. Uma importante vantagem desta técnica é que a matriz semi-sólida favorece selectivamente o crescimento de células que podem proliferar de uma forma independente de ancoragem. Esta característica é exibido principalmente por células cancerosas, mas não por células normais. Utilizamos esta técnica principalmente para testar a eficácia de inibição d...

Discussão

A taxa de formação de colónias em agar mole varia dependendo do tipo de célula ^9. Portanto, o número de células para iniciar com deve ser optimizado e ajustado em conformidade. Uma gama de partida sugerida é de entre 5 x10 ² a 1 x 10 ⁴ culas por po numa placa de 6 poços. Além disso, o tamanho da colónia varia dependendo da taxa de crescimento de cada célula. Portanto, um pré-definido um limite para o tamanho da colónia é necessária para anotar colónias individuais para an...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zeiss Axiopot	Carl Zeiss Microscopy	1021859251
Inverted Microscope	Olympus	CKX41
DMEM/F-12	Lonza BioWhittaker	12-719F
HyClone Donor Equine Serum	Fisher Scientific	SH30074.03
Penicillin Streptomycin	Life Technologies	15140-122
2-Hydroxyethylagarose: Type VII, low gelling temperature	Sigma-Aldrich	39346-81-1