Utilización del ensayo Soft Agar formación de colonias para identificar inhibidores de tumorigenicidad en células de cáncer de mama

Resumen

Here, we document the use of the soft agar colony formation assay to test the effects of a peptidylarginine deiminase (PADI) enzyme inhibitor, BB-Cl-amidine, on breast cancer tumorigenicity in vitro.

Resumen

Given the inherent difficulties in investigating the mechanisms of tumor progression in vivo, cell-based assays such as the soft agar colony formation assay (hereafter called soft agar assay), which measures the ability of cells to proliferate in semi-solid matrices, remain a hallmark of cancer research. A key advantage of this technique over conventional 2D monolayer or 3D spheroid cell culture assays is the close mimicry of the 3D cellular environment to that seen in vivo. Importantly, the soft agar assay also provides an ideal tool to rigorously test the effects of novel compounds or treatment conditions on cell proliferation and migration. Additionally, this assay enables the quantitative assessment of cell transformation potential within the context of genetic perturbations. We recently identified peptidylarginine deiminase 2 (PADI2) as a potential breast cancer biomarker and therapeutic target. Here we highlight the utility of the soft agar assay for preclinical anti-cancer studies by testing the effects of the PADI inhibitor, BB-Cl-amidine (BB-CLA), on the tumorigenicity of human ductal carcinoma in situ (MCF10DCIS) cells.

Introducción

Both non-transformed (normal) and transformed cells can readily proliferate in a 2D monolayer culture. This form of adherent cell growth is quite dissimilar from that which occurs in vivo where, in the absence of mitogenic stimulation, cells do not often rapidly divide within their microenvironment. The soft agar assay on the other hand is distinct from 2D culture systems because it quantifies tumorigenicity by measuring a cell’s ability to proliferate and form colonies in suspension within a semi-solid agarose gel¹. In this setting, non-transformed cells are unable to rapidly propagate in the absence of anchorage to the extracellular matrix (ECM) and undergo apoptosis, a process known as anoikis. In contrast, cells that have undergone malignant transformation lose their anchorage dependence due to activation of signaling pathways such as phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)/Akt and Rac/Cdc42/PAK. Therefore, these cells are able to grow and form colonies within the semi-solid soft agar matrix².

A common use of the soft agar assay is to test whether specific compounds, such as PADI inhibitors, are able to suppress tumor growth in vitro. In general, colony count or colony sizes are quantitative read-outs from the assay that can be compared between control and treatment groups to assess differences in cellular tumorigenicity. Therefore, if one finds that colony formation is inversely correlated with increasing drug concentration, then a conclusion could be drawn that the drug is an effective inhibitor of tumorigenicity in vitro. On the other hand, if the drug does not affect colony formation, the drug is either not at the appropriate dosage or it is not an effective tumorigenic inhibitor. Aside from using a soft agar assay to test the anti-tumor effect of a drug, this assay can also be used to probe the relationship between a specific gene and tumorigenesis. For example, the effect of suppressing PADI2 expression on tumorigenicity can be addressed by PADI2-specific siRNA treatment.

PADIs are calcium-dependent enzymes that post-translationally modify proteins by converting positively charged arginine residues into neutrally charged citrulline in a process known as citrullination or deimination^3-5. We have recently found that peptidylarginine deiminase 2 (PADI2) may function as a novel breast cancer biomarker and that PADI inhibitors represent candidate therapies for early stage breast cancers⁶. For example, we have previously demonstrated that a “pan-PADI” inhibitor, Cl-amidine, suppresses the proliferation of breast cancer cells using 2D monolayers and that the inhibitor suppressed the growth of 3D tumor spheroids⁶. In this report, we extend these studies, and highlight the utility of the soft agar assay, by testing the efficacy of a new PADI inhibitor, BB-CLA, in suppressing the growth of MCF10DCIS breast cancer colonies⁷. We note that we used MCF10DCIS cells for this experiment because they are oncogenic derivatives of non-transformed human MCF10A cells and because they contain high steady state levels of PADI2 protein⁸. We hypothesize that PADI2 enzymatic activity plays a key role in the tumorigenicity of this cell line and that BB-CLA-mediated inhibition of PADI2 activity will suppress cancer progression.

Protocolo

1. Preparación de 3% 2-hidroxietil agarosa

1. En un frasco de vidrio de 100 ml limpio y seco, añadir 0,9 g de 2-hidroxietilo agarosa (Agarosa VII) seguido de 30 ml de agua destilada.
2. Microondas la mezcla durante 15 segundos y suavemente remolino. Repita este paso al menos tres veces más hasta que el polvo de agarosa se disuelve totalmente.
3. Autoclave la botella que contiene solución durante 15 min.
4. Deje que la solución de agarosa se enfríe a temperatura ambiente antes de su uso posterior. Guarde la solución a temperatura ambiente.

2. Preparación de la capa inferior: 0,6% en gel de agarosa

1. Pre-caliente varias 5 ml y 10 ml pipetas en una incubadora a 37 ° para evitar que la agarosa se solidifique en la pipeta durante la manipulación.
2. Parcialmente aflojar la tapa de la botella y microondas la solución de agarosa pre-hechos 3% 2-hidroxietil durante 15 s. Luego, agitar suavemente la solución y microondas durante otros 15 seg. PRECAUCIÓN: Tenga cuidado al girar el agarosolución en sí porque la solución se eleva cuando se expone al aire y puede extenderse.
3. Si hay gel sólido residual en la botella, microondas durante unos segundos más.
4. Mantenga el frasco que contiene la solución de agarosa en un baño de agua a 45 ° C durante los próximos pasos para prevenir la solución de agarosa se solidifique antes de tiempo.
5. Medios MCF10DCIS caliente en un 37 ° C baño de agua. Nota: los medios de comunicación MCF10DCIS consta de DMEM / F12, 5% de suero de caballo, 5% de penicilina estreptomicina.
6. Transferencia de 3 ml de la solución de agarosa al 3% utilizando las pipetas pre-calentado en un tubo cónico de 50 ml estéril.
7. Añada inmediatamente 12 ml de medio MCF10DCIS cálidos e invierta suavemente el tubo cónico para mezclar la agarosa con los medios de comunicación. Trate de no formar las burbujas, ya que interfiere con la colonia contar después.
8. Añadir con cuidado 2 ml de esta mezcla en cada pocillo de una placa de cultivo de 6 pocillos sin formar burbujas de aire.
9. Incubar el 6 pocillos horizonta placa de cultivoLLY sobre una superficie plana a 4 ° C durante 1 hora para permitir que la mezcla se solidifique.
10. Después de que se solidifique la mezcla, colocar la placa en una incubadora a 37ºC durante 30 min. La capa inferior está ahora listo para su uso.

3. Preparación de la capa que contiene Cell-: 0,3% en gel de agarosa

1. Células trypsinize MCF10DCIS y diluir a una concentración de células de 4 x 10 ⁴ / ml.
2. Tome 2 ml de la agarosa 3% utilizando pipetas pre-calentado y transferir a un tubo cónico de 50 ml estéril.
3. Inmediatamente añadir 8 ml de medio MCF10DCIS al tubo cónico e invertir suavemente para mezclar la agarosa con los medios. Evite la formación de burbujas.
4. Tome 2 ml de las células MCF10DCIS (4 x 10 ⁴ / ml) y tratar con BB-CLA (0 mM (DMSO) o 1 mM).
5. En una dilución 1: 1, mezclar las células con la agarosa 0,6%.
6. Tomar 1 ml de la mezcla de células de agarosa y agregar suavemente sobre la capa inferior de la 6-p pocillo de cultivotardías (2 x 10 ⁴ células / ml).
7. Coloque la placa de cultivo de 6 pocillos en posición horizontal sobre una superficie plana a 4 ° C durante al menos 15 min para permitir que la capa superior se solidifique.
8. Después de que se solidifique la mezcla, colocar la placa en una incubadora a 37 ° durante una semana antes de añadir la capa de alimentación.

4. Preparación de la capa de alimentación: 0,3% en gel de agarosa

1. Microondas el 2-hidroxietil solución de agarosa pre-hechos del 3% durante 15 s. agitar suavemente la solución y microondas durante otros 15 seg.
2. Equilibrar la botella de solución de agarosa en un baño de agua a 45 ° C.
3. Calentar los medios MCF10DCIS en un baño de agua a 37 ° C.
4. Mezclar 1 ml de solución de agarosa al 3% con 9 ml de medio MCF10DCIS caliente en un tubo cónico de 50 ml e invertir suavemente para mezclar la agarosa con los medios de comunicación. Evitar la formación de burbujas de aire.
5. Tratar la mezcla con BB-CLA (0 mM (DMSO) o 1 mM).
6. Añadir suavemente 1 ml de esta mezcla (sin paraming burbujas) en cada pocillo de la placa de cultivo de 6 pocillos que contiene la parte inferior y capas blandas.
7. Coloque la placa de cultivo de 6 pocillos en posición horizontal sobre una superficie plana a 4 ° C durante al menos 15 min para permitir que la mezcla se solidifique.
8. Después de la capa de alimentación solidifica, coloque la placa en una incubadora a 37 °.
9. Repita este procedimiento de alimentación semanal mediante la superposición de 1 ml de solución de agarosa / medio / tratamiento de 0,3% en la capa de alimentación existente para reponer las células con nuevos medios de comunicación hasta que se observa la formación de colonias. Nota: Agar en las capas blandas y el alimentador es muy suave y, por lo tanto, los nutrientes añadidos de la capa de alimentación se difundirán fácilmente en la capa que contiene la célula a llegar a las células.

5. Recolección de Datos

1. Después de 2,5 semanas de crecimiento celular en el agar suave, contar el número de colonias en cada pocillo utilizando un microscopio de luz. Para facilitar la cuantificación, imprima una rejilla sobre una transparencia y adjuntar la red a laPlaca de 6 pocillos para ayudar a localizar donde las células son durante el conteo. Desde tamaño de la colonia (cuantificada por el diámetro de cada colonia) variará, predefinir un tamaño de la colonia de referencia para determinar qué colonias se marcarán. Por ejemplo, incluir tamaños de colonia de 70 micras o más grande en el análisis de datos.
2. Almacenar las muestras a 4 ° C para evitar una mayor formación de colonias y para el recuento futuro. Selle la placa de cultivo de 6 pocillos con Parafilm para evitar que los geles se sequen.

Resultados

El ensayo de formación de colonias en agar blando se puede utilizar para una amplia gama de aplicaciones que documentan la tumorigenicidad de las células cancerosas. Una ventaja principal de esta técnica es que la matriz semi-sólido favorece selectivamente el crecimiento de células que pueden proliferar en una manera independiente de anclaje. Este rasgo se exhibe principalmente por las células cancerosas, pero no por las células normales. Utilizamos principalmente esta técnica para probar la eficacia de inhibici...

Discusión

La tasa de formación de colonias en agar blando varía dependiendo del tipo de célula ^9. Por lo tanto, el número de células para iniciar con debe ser optimizado y ajustado en consecuencia. Una gama de partida sugerido es de entre 5 x ¹⁰ 02 al 01 x 10 ⁴ células por pocillo utilizando una placa de 6 pocillos. Además, tamaño de las colonias varía en función de la tasa de crecimiento de cada célula. Por lo tanto, se necesita un predefinido un punto de corte para el tamaño de colon...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zeiss Axiopot	Carl Zeiss Microscopy	1021859251
Inverted Microscope	Olympus	CKX41
DMEM/F-12	Lonza BioWhittaker	12-719F
HyClone Donor Equine Serum	Fisher Scientific	SH30074.03
Penicillin Streptomycin	Life Technologies	15140-122
2-Hydroxyethylagarose: Type VII, low gelling temperature	Sigma-Aldrich	39346-81-1