ניצול של assay כינונה רך אגר מושבה לזיהוי מעכבי tumorigenicity בתאי סרטן השד

Summary

Here, we document the use of the soft agar colony formation assay to test the effects of a peptidylarginine deiminase (PADI) enzyme inhibitor, BB-Cl-amidine, on breast cancer tumorigenicity in vitro.

Abstract

Given the inherent difficulties in investigating the mechanisms of tumor progression in vivo, cell-based assays such as the soft agar colony formation assay (hereafter called soft agar assay), which measures the ability of cells to proliferate in semi-solid matrices, remain a hallmark of cancer research. A key advantage of this technique over conventional 2D monolayer or 3D spheroid cell culture assays is the close mimicry of the 3D cellular environment to that seen in vivo. Importantly, the soft agar assay also provides an ideal tool to rigorously test the effects of novel compounds or treatment conditions on cell proliferation and migration. Additionally, this assay enables the quantitative assessment of cell transformation potential within the context of genetic perturbations. We recently identified peptidylarginine deiminase 2 (PADI2) as a potential breast cancer biomarker and therapeutic target. Here we highlight the utility of the soft agar assay for preclinical anti-cancer studies by testing the effects of the PADI inhibitor, BB-Cl-amidine (BB-CLA), on the tumorigenicity of human ductal carcinoma in situ (MCF10DCIS) cells.

Introduction

Both non-transformed (normal) and transformed cells can readily proliferate in a 2D monolayer culture. This form of adherent cell growth is quite dissimilar from that which occurs in vivo where, in the absence of mitogenic stimulation, cells do not often rapidly divide within their microenvironment. The soft agar assay on the other hand is distinct from 2D culture systems because it quantifies tumorigenicity by measuring a cell’s ability to proliferate and form colonies in suspension within a semi-solid agarose gel¹. In this setting, non-transformed cells are unable to rapidly propagate in the absence of anchorage to the extracellular matrix (ECM) and undergo apoptosis, a process known as anoikis. In contrast, cells that have undergone malignant transformation lose their anchorage dependence due to activation of signaling pathways such as phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)/Akt and Rac/Cdc42/PAK. Therefore, these cells are able to grow and form colonies within the semi-solid soft agar matrix².

A common use of the soft agar assay is to test whether specific compounds, such as PADI inhibitors, are able to suppress tumor growth in vitro. In general, colony count or colony sizes are quantitative read-outs from the assay that can be compared between control and treatment groups to assess differences in cellular tumorigenicity. Therefore, if one finds that colony formation is inversely correlated with increasing drug concentration, then a conclusion could be drawn that the drug is an effective inhibitor of tumorigenicity in vitro. On the other hand, if the drug does not affect colony formation, the drug is either not at the appropriate dosage or it is not an effective tumorigenic inhibitor. Aside from using a soft agar assay to test the anti-tumor effect of a drug, this assay can also be used to probe the relationship between a specific gene and tumorigenesis. For example, the effect of suppressing PADI2 expression on tumorigenicity can be addressed by PADI2-specific siRNA treatment.

PADIs are calcium-dependent enzymes that post-translationally modify proteins by converting positively charged arginine residues into neutrally charged citrulline in a process known as citrullination or deimination^3-5. We have recently found that peptidylarginine deiminase 2 (PADI2) may function as a novel breast cancer biomarker and that PADI inhibitors represent candidate therapies for early stage breast cancers⁶. For example, we have previously demonstrated that a “pan-PADI” inhibitor, Cl-amidine, suppresses the proliferation of breast cancer cells using 2D monolayers and that the inhibitor suppressed the growth of 3D tumor spheroids⁶. In this report, we extend these studies, and highlight the utility of the soft agar assay, by testing the efficacy of a new PADI inhibitor, BB-CLA, in suppressing the growth of MCF10DCIS breast cancer colonies⁷. We note that we used MCF10DCIS cells for this experiment because they are oncogenic derivatives of non-transformed human MCF10A cells and because they contain high steady state levels of PADI2 protein⁸. We hypothesize that PADI2 enzymatic activity plays a key role in the tumorigenicity of this cell line and that BB-CLA-mediated inhibition of PADI2 activity will suppress cancer progression.

Protocol

1. הכנה של 3% 2-Hydroxyethyl Agarose

1. לתוך בקבוק נקי, יבש 100 מיליליטר זכוכית, להוסיף 0.9 גרם של agarose 2-hydroxyethyl (Agarose VII) ואחריו 30 מיליליטר של מים מזוקקים.
2. מיקרוגל את התערובת במשך 15 שניות ועדינות מערבולת. חזור על שלב זה לפחות עוד שלוש פעמים עד שאבקת agarose מתמוססת באופן מלא.
3. החיטוי הבקבוק המכיל פתרון במשך 15 דקות.
4. אפשר פתרון agarose להתקרר לRT לפני שימוש נוסף. אחסן את הפתרון בRT.

2. הכנת השכבה התחתונה: 0.6% Agarose ג'ל

1. טרום חם 5 מיליליטר ו -10 מיליליטר בטפטפות 37 ° C חממה כמה למנוע agarose לחיזוק בפיפטה בעת טיפול.
2. חלקית לשחרר את מכסה הבקבוק ומיקרוגל 3% פתרון agarose 2-hydroxyethyl שהוכן מראש, במשך 15 שניות. ואז, בעדינות מערבולת הפתרון ומיקרוגל לעוד 15 שניות. זהירות: היזהרי בעת מתערבלת agaroפתרון se כי הפתרון עולה כאשר נחשף לאוויר ויכול לגלוש.
3. אם יש ג'ל השייר המוצק בבקבוק, מיקרוגל לעוד כמה שניות.
4. שמור את הבקבוק המכיל את פתרון agarose באמבט מים C ° 45 במהלך השלבים הבאים כדי למנוע את פתרון agarose מהגיבוש בטרם עת.
5. תקשורת MCF10DCIS חמה באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. הערה: תקשורת MCF10DCIS מורכבת DMEM / F12, 5% בסרום סוס, 5% סטרפטומיצין פניצילין.
6. העברה 3 מיליליטר של פתרון agarose 3% באמצעות טפטפות המחוממות מראש לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר סטרילי.
7. מייד להוסיף 12 מיליליטר של תקשורת MCF10DCIS החמה ועדינות להפוך את צינור חרוטי לערבב agarose עם התקשורת. נסה לא ליצור בועות כפי שיפריע למושבה ספירה מאוחר יותר.
8. בעדינות להוסיף 2 מיליליטר של תערובת זו לכל גם צלחת תרבות 6 היטב בלי להרכיב את כל בועות אוויר.
9. דגירה horizonta צלחת תרבות 6 היטבlly על משטח שטוח ב 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 כדי לאפשר את התערובת לביסוס.
10. לאחר מתמצק התערובת, מניח את הצלחת לתוך 37 ° C חממה למשך 30 דקות. השכבה התחתונה היא מוכנה לשימוש.

3. הכנת השכבה המכיל הנייד: 0.3% Agarose ג'ל

1. תאי Trypsinize MCF10DCIS ולדלל אותם לריכוז תא של 4 x 10 ⁴ מיליליטר /.
2. קח 2 מיליליטר של agarose 3% באמצעות טפטפות מחוממות מראש ולהעביר לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר סטרילי.
3. מייד להוסיף 8 מיליליטר של תקשורת MCF10DCIS לצינור חרוטי ועדינות להפוך לערבב agarose עם התקשורת. הימנע יצירת בועות.
4. קח 2 מיליליטר של תאי MCF10DCIS (4 x 10 ⁴ / מיליליטר) ולטפל עם BB-CLA (0 מיקרומטר (DMSO) או 1 מיקרומטר).
5. בדילול 1: 1, לערבב את התאים עם agarose 0.6%.
6. קח 1 מיליליטר של תערובת התא-agarose ועדינות להוסיף על השכבה התחתונה של עמ 'תרבות 6 היטב(2 x 10 ⁴ תאים / מיליליטר) מאוחר.
7. מניחים את צלחת תרבות 6 היטב אופקי על משטח שטוח ב 4 מעלות צלזיוס במשך לפחות 15 דקות, כדי לאפשר את השכבה העליונה כדי לחזק.
8. לאחר מתמצק התערובת, מניח את הצלחת לתוך 37 ° C חממה במשך שבוע לפני הוספת שכבת ההאכלה.

4. הכנת שכבת המזין: 0.3% Agarose ג'ל

1. מיקרוגל 3% פתרון agarose 2-Hydroxyethyl שהוכן מראש, במשך 15 שניות. מערבולת בעדינות את הפתרון ומיקרוגל לעוד 15 שניות.
2. לאזן את בקבוק פתרון agarose באמבט מים 45 מעלות צלזיוס.
3. לחמם את תקשורת MCF10DCIS באמבט מים 37 מעלות צלזיוס.
4. מערבבים 1 מיליליטר של 3% פתרון agarose עם 9 מיליליטר של תקשורת MCF10DCIS החמה לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר ועדינות להפוך לערבב agarose עם התקשורת. הימנע יוצר בועות אוויר.
5. פנק את התערובת עם BB-CLA (0 מיקרומטר (DMSO) או 1 מיקרומטר).
6. בעדינות להוסיף 1 מיליליטר של תערובת זו (בלי למינג בועות) לבאר כל צלחת תרבות 6 היטב המכילה את החלק התחתון ושכבות רכות.
7. מניחים את צלחת תרבות 6 היטב אופקי על משטח שטוח ב 4 מעלות צלזיוס במשך לפחות 15 דקות, כדי לאפשר את התערובת לביסוס.
8. לאחר שכבת המזין מתמצקת, למקם את הצלחת לתוך 37 ° C חממה.
9. חזור שבועי הליך זה על ידי האכלה כיסה 1 מיליליטר של 0.3% פתרון agarose / בינוניים / טיפול על שכבת המזין הקיימת כדי לחדש את התאים עם תקשורת חדשה עד הקמת מושבה הוא ציין. הערה: אגר בשכבות הרכות ומזין היא רכה מאוד, ולכן, חומרים מזינים הגיעו משכבת ​​המזין יהיו מוכנים לפזר את השכבה המכיל תא כדי להגיע לתאים.

5. איסוף נתונים

1. לאחר 2.5 שבועות של צמיחת תאים באגרו הרך, לספור את מספר המושבות בכל טוב באמצעות מיקרוסקופ אור. כדי להקל על כימות, להדפיס רשת על שקיפות ולצרף את הרשת ל6-גם צלחת לסיוע באיתור שבו התאים נמצאים בספירה. מאז גודל מושבה (כלכמת ידי הקוטר של כל מושבה) ישתנה, להגדיר מראש גודל מושבה התייחסות כדי לקבוע אילו מושבות יהיה כבש. לדוגמא, כוללים גדלי מושבה של 70 מיקרומטר או גדולים יותר בניתוח הנתונים.
2. אחסן את הדגימות ב 4 ° C כדי למנוע היווצרות מושבה נוספת ולספירת עתיד. חותם את צלחת תרבות 6 היטב עם Parafilm כדי למנוע את ג'לי מהתייבשות.

תוצאות

Assay הקמת המושבה אגר הרך יכול לשמש למגוון רחב של יישומים המתעדים את tumorigenicity של תאים סרטניים. יתרון עיקרי של שיטה זו הוא שמטריצת חצי מוצקה סלקטיבי מעדיפה את הצמיחה של תאים שיכולים להתרבות באופן עצמאי מעגן-. תכונה זו היא בעיקר הפגינה תאים סרטניים אך לא בתאים נורמלים. אנחנ...

Discussion

קצב היווצרות מושבה באגרה רך משתנה בהתאם לסוג התא ^9. לכן, מספר התאים להתחיל עם צריך להיות מותאם ובהתאם. מגוון התחלה הציע הוא בין 5 x ^02-01 אוקטובר x 10 ⁴ תאים לכל גם באמצעות צלחת 6 היטב. בנוסף, גודל מושבה משתנה בהתאם לקצב הצמיחה של כל תא. לכן, יש צורך בחתך מוגדר ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zeiss Axiopot	Carl Zeiss Microscopy	1021859251
Inverted Microscope	Olympus	CKX41
DMEM/F-12	Lonza BioWhittaker	12-719F
HyClone Donor Equine Serum	Fisher Scientific	SH30074.03
Penicillin Streptomycin	Life Technologies	15140-122
2-Hydroxyethylagarose: Type VII, low gelling temperature	Sigma-Aldrich	39346-81-1