L'utilisation de l'essai de formation souple Agar colonie à identifier des inhibiteurs de Tumorigénicité dans les cellules cancéreuses du sein

Résumé

Here, we document the use of the soft agar colony formation assay to test the effects of a peptidylarginine deiminase (PADI) enzyme inhibitor, BB-Cl-amidine, on breast cancer tumorigenicity in vitro.

Résumé

Given the inherent difficulties in investigating the mechanisms of tumor progression in vivo, cell-based assays such as the soft agar colony formation assay (hereafter called soft agar assay), which measures the ability of cells to proliferate in semi-solid matrices, remain a hallmark of cancer research. A key advantage of this technique over conventional 2D monolayer or 3D spheroid cell culture assays is the close mimicry of the 3D cellular environment to that seen in vivo. Importantly, the soft agar assay also provides an ideal tool to rigorously test the effects of novel compounds or treatment conditions on cell proliferation and migration. Additionally, this assay enables the quantitative assessment of cell transformation potential within the context of genetic perturbations. We recently identified peptidylarginine deiminase 2 (PADI2) as a potential breast cancer biomarker and therapeutic target. Here we highlight the utility of the soft agar assay for preclinical anti-cancer studies by testing the effects of the PADI inhibitor, BB-Cl-amidine (BB-CLA), on the tumorigenicity of human ductal carcinoma in situ (MCF10DCIS) cells.

Introduction

Both non-transformed (normal) and transformed cells can readily proliferate in a 2D monolayer culture. This form of adherent cell growth is quite dissimilar from that which occurs in vivo where, in the absence of mitogenic stimulation, cells do not often rapidly divide within their microenvironment. The soft agar assay on the other hand is distinct from 2D culture systems because it quantifies tumorigenicity by measuring a cell’s ability to proliferate and form colonies in suspension within a semi-solid agarose gel¹. In this setting, non-transformed cells are unable to rapidly propagate in the absence of anchorage to the extracellular matrix (ECM) and undergo apoptosis, a process known as anoikis. In contrast, cells that have undergone malignant transformation lose their anchorage dependence due to activation of signaling pathways such as phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)/Akt and Rac/Cdc42/PAK. Therefore, these cells are able to grow and form colonies within the semi-solid soft agar matrix².

A common use of the soft agar assay is to test whether specific compounds, such as PADI inhibitors, are able to suppress tumor growth in vitro. In general, colony count or colony sizes are quantitative read-outs from the assay that can be compared between control and treatment groups to assess differences in cellular tumorigenicity. Therefore, if one finds that colony formation is inversely correlated with increasing drug concentration, then a conclusion could be drawn that the drug is an effective inhibitor of tumorigenicity in vitro. On the other hand, if the drug does not affect colony formation, the drug is either not at the appropriate dosage or it is not an effective tumorigenic inhibitor. Aside from using a soft agar assay to test the anti-tumor effect of a drug, this assay can also be used to probe the relationship between a specific gene and tumorigenesis. For example, the effect of suppressing PADI2 expression on tumorigenicity can be addressed by PADI2-specific siRNA treatment.

PADIs are calcium-dependent enzymes that post-translationally modify proteins by converting positively charged arginine residues into neutrally charged citrulline in a process known as citrullination or deimination^3-5. We have recently found that peptidylarginine deiminase 2 (PADI2) may function as a novel breast cancer biomarker and that PADI inhibitors represent candidate therapies for early stage breast cancers⁶. For example, we have previously demonstrated that a “pan-PADI” inhibitor, Cl-amidine, suppresses the proliferation of breast cancer cells using 2D monolayers and that the inhibitor suppressed the growth of 3D tumor spheroids⁶. In this report, we extend these studies, and highlight the utility of the soft agar assay, by testing the efficacy of a new PADI inhibitor, BB-CLA, in suppressing the growth of MCF10DCIS breast cancer colonies⁷. We note that we used MCF10DCIS cells for this experiment because they are oncogenic derivatives of non-transformed human MCF10A cells and because they contain high steady state levels of PADI2 protein⁸. We hypothesize that PADI2 enzymatic activity plays a key role in the tumorigenicity of this cell line and that BB-CLA-mediated inhibition of PADI2 activity will suppress cancer progression.

Protocole

1. Préparation de 3% de 2-hydroxyéthyle Agarose

1. Dans un endroit propre, sec 100 ml bouteille en verre, ajouter 0,9 g de 2-hydroxyethyl agarose (Agarose VII), suivie par 30 ml d'eau distillée.
2. Micro-ondes le mélange pendant 15 secondes et agiter doucement. Répétez cette étape au moins trois fois jusqu'à ce que la poudre d'agarose dissout complètement.
3. Autoclaver la bouteille contenant la solution pendant 15 min-.
4. Laisser la solution d'agarose à refroidir à température ambiante avant une nouvelle utilisation. Conserver la solution à la température ambiante.

2. Préparation de la couche inférieure: 0,6% gel d'agarose

1. Pré-réchauffer plusieurs 5 ml et 10 ml de pipettes dans un incubateur à 37 ° C pour empêcher la solidification de l'agarose dans la pipette lors de la manipulation.
2. Desserrer partiellement le couvercle de la bouteille et micro-ondes la solution d'agarose à pré-mesure de 3% de 2-hydroxyéthyle pendant 15 s. Ensuite, mélanger doucement la solution et micro-ondes pendant 15 secondes. ATTENTION: Soyez prudent lorsque vous tourner le agarosolution soi parce que la solution se lève lorsqu'il est exposé à l'air et peut déborder.
3. Si il ya gel solide résiduel dans la bouteille, micro-ondes quelques secondes de plus.
4. Gardez la bouteille contenant la solution d'agarose dans un bain d'eau à 45 ° au cours des prochaines étapes pour empêcher la solution d'agarose de se solidifier prématurément.
5. Médias MCF10DCIS chaud dans un bain d'eau à 37 C ° de. Remarque: MCF10DCIS support est constitué de DMEM / F12, de sérum de cheval à 5%, 5% de pénicilline streptomycine.
6. Transfert 3 ml de la solution d'agarose à 3% en utilisant les pipettes préchauffées dans un tube conique de 50 ml stérile.
7. Immédiatement ajouter 12 ml de milieu de MCF10DCIS chaudes et inverser doucement le tube conique de mélanger l'agarose avec les médias. Essayez de ne pas former des bulles comme il va interférer avec la colonie comptant plus tard.
8. Ajouter doucement 2 ml de ce mélange dans chaque puits d'une plaque de culture à 6 puits sans former de bulles d'air.
9. Incuber le 6 puits plaque de culture horizontally sur une surface plane à 4 ° C pendant 1 heure pour permettre au mélange de se solidifier.
10. Après le mélange se solidifie, placer la plaque dans un incubateur à 37 ° de 30 min. La couche inférieure est maintenant prêt à l'emploi.

3. Préparation de la couche contenant des cellules: 0,3% gel d'agarose

1. Trypsiniser les cellules MCF10DCIS et les diluer à une concentration cellulaire de 4 x 10 ⁴ / ml.
2. Prendre 2 ml de l'agarose à 3% en utilisant des pipettes préchauffées et transférer dans un tube conique de 50 ml stérile.
3. Immédiatement ajouter 8 ml de MCF10DCIS médias pour le tube conique et inverser doucement pour mélanger l'agarose avec les médias. Éviter la formation de bulles.
4. Prendre 2 ml de cellules MCF10DCIS (4 x 10 ⁴ / ml) et traiter avec BB-CLA (0 uM (DMSO) ou 1 um).
5. Dans une dilution 1: 1, le mélange des cellules avec le 0,6% d'agarose.
6. Prélever 1 ml du mélange de cellules-agarose et ajouter doucement sur la couche inférieure de la culture à 6 puits pfin (2 x 10 ⁴ cellules / ml).
7. Placer la plaque de culture à 6 puits à l'horizontale sur une surface plane à 4 ° C pendant au moins 15 minutes pour permettre à la couche de recouvrement se solidifier.
8. Après le mélange se solidifie, placer la plaque dans un incubateur à 37 ° C pendant de une semaine avant d'ajouter la couche d'alimentation.

4. Préparation de la couche d'alimentation: 0,3% Agarose Gel

1. Micro-ondes de la solution d'agarose préfabriqué 3% de 2-hydroxyéthyle pendant 15 s. agiter doucement la solution et micro-ondes pendant 15 secondes.
2. Equilibrer la bouteille de solution de gélose dans un bain d'eau à 45 ° C.
3. Réchauffez les médias MCF10DCIS dans un bain d'eau à 37 ° C.
4. Mélanger 1 ml de solution d'agarose à 3% avec 9 ml de milieu de MCF10DCIS chaud dans un tube conique de 50 ml et inverser doucement pour mélanger l'agarose avec les médias. Éviter la formation de bulles d'air.
5. On traite le mélange avec BB-CLA (0 uM (DMSO) ou 1 pM).
6. Ajouter délicatement 1 ml de ce mélange (sans pourming bulles) dans chaque puits de la plaque de culture de 6 puits contenant le fond et couches molles.
7. Placer la plaque de culture à 6 puits à l'horizontale sur une surface plane à 4 ° C pendant au moins 15 minutes pour permettre au mélange de se solidifier.
8. Après la couche d'alimentation se solidifie, placer la plaque dans un incubateur à 37 ° C.
9. Répétez cette procédure hebdomadaire alimentation en superposant 1 ml de solution d'agarose / moyen / traitement de 0,3% sur la couche d'alimentation existante pour reconstituer les cellules avec les nouveaux médias jusqu'à ce que la formation de colonies est observée. Remarque: Agar dans les couches molles et d'alimentation est très doux et, par conséquent, les éléments nutritifs ajoutés à partir de la couche d'alimentation seront facilement diffuser dans la couche contenant des cellules d'atteindre les cellules.

5. Collecte de données

1. Au bout de 2,5 semaines de croissance cellulaire dans la gélose molle, compter le nombre de colonies dans chaque puits en utilisant un microscope optique. Pour faciliter la quantification, imprimer une grille sur une transparence et fixer la grille pour laPlaque de 6 puits pour aider à localiser où les cellules sont en cours de comptage. Étant donné que la taille des colonies (telle que quantifiée par le diamètre de chaque colonie) varie prédéfinir une taille de colonie de référence pour déterminer les colonies qui sera reçu. Par exemple, inclure la taille des colonies de 70 um ou plus dans l'analyse de données.
2. Stocker les échantillons à 4 ° C pour empêcher la formation de colonies pour le comptage et futur. Sceller le 6 puits plaque de culture avec du Parafilm pour éviter les gels de se dessécher.

Résultats

Le dosage de formation de colonies sur gélose molle peut être utilisée pour une large gamme d'applications documentant la tumorigénicité des cellules cancéreuses. Un avantage majeur de cette technique est que la matrice semi-solide favorise sélectivement la croissance des cellules qui peuvent proliférer d'une manière indépendante de l'ancrage. Cette caractéristique est principalement exposée par les cellules cancéreuses, mais pas par les cellules normales. Nous utilisons cette technique principa...

Discussion

Le taux de formation de colonies dans de l'agar mou varie en fonction du type de cellule ^9. Par conséquent, le nombre de cellules pour commencer devrait être optimisé et ajusté en conséquence. Une gamme départ suggéré est entre 5 x 10 ² à 1 x 10 ⁴ cellules par puits en utilisant une plaque de 6 puits. En outre, la taille des colonies varie en fonction du taux de croissance de chaque cellule. Par conséquent, un prédéfini une coupure pour la taille des colonies est nécessa...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zeiss Axiopot	Carl Zeiss Microscopy	1021859251
Inverted Microscope	Olympus	CKX41
DMEM/F-12	Lonza BioWhittaker	12-719F
HyClone Donor Equine Serum	Fisher Scientific	SH30074.03
Penicillin Streptomycin	Life Technologies	15140-122
2-Hydroxyethylagarose: Type VII, low gelling temperature	Sigma-Aldrich	39346-81-1