Использование мягких агар колонии Формирование анализе для идентификации ингибиторов туморогенности в клетках рака молочной железы

Резюме

Here, we document the use of the soft agar colony formation assay to test the effects of a peptidylarginine deiminase (PADI) enzyme inhibitor, BB-Cl-amidine, on breast cancer tumorigenicity in vitro.

Аннотация

Given the inherent difficulties in investigating the mechanisms of tumor progression in vivo, cell-based assays such as the soft agar colony formation assay (hereafter called soft agar assay), which measures the ability of cells to proliferate in semi-solid matrices, remain a hallmark of cancer research. A key advantage of this technique over conventional 2D monolayer or 3D spheroid cell culture assays is the close mimicry of the 3D cellular environment to that seen in vivo. Importantly, the soft agar assay also provides an ideal tool to rigorously test the effects of novel compounds or treatment conditions on cell proliferation and migration. Additionally, this assay enables the quantitative assessment of cell transformation potential within the context of genetic perturbations. We recently identified peptidylarginine deiminase 2 (PADI2) as a potential breast cancer biomarker and therapeutic target. Here we highlight the utility of the soft agar assay for preclinical anti-cancer studies by testing the effects of the PADI inhibitor, BB-Cl-amidine (BB-CLA), on the tumorigenicity of human ductal carcinoma in situ (MCF10DCIS) cells.

Введение

Both non-transformed (normal) and transformed cells can readily proliferate in a 2D monolayer culture. This form of adherent cell growth is quite dissimilar from that which occurs in vivo where, in the absence of mitogenic stimulation, cells do not often rapidly divide within their microenvironment. The soft agar assay on the other hand is distinct from 2D culture systems because it quantifies tumorigenicity by measuring a cell’s ability to proliferate and form colonies in suspension within a semi-solid agarose gel¹. In this setting, non-transformed cells are unable to rapidly propagate in the absence of anchorage to the extracellular matrix (ECM) and undergo apoptosis, a process known as anoikis. In contrast, cells that have undergone malignant transformation lose their anchorage dependence due to activation of signaling pathways such as phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)/Akt and Rac/Cdc42/PAK. Therefore, these cells are able to grow and form colonies within the semi-solid soft agar matrix².

A common use of the soft agar assay is to test whether specific compounds, such as PADI inhibitors, are able to suppress tumor growth in vitro. In general, colony count or colony sizes are quantitative read-outs from the assay that can be compared between control and treatment groups to assess differences in cellular tumorigenicity. Therefore, if one finds that colony formation is inversely correlated with increasing drug concentration, then a conclusion could be drawn that the drug is an effective inhibitor of tumorigenicity in vitro. On the other hand, if the drug does not affect colony formation, the drug is either not at the appropriate dosage or it is not an effective tumorigenic inhibitor. Aside from using a soft agar assay to test the anti-tumor effect of a drug, this assay can also be used to probe the relationship between a specific gene and tumorigenesis. For example, the effect of suppressing PADI2 expression on tumorigenicity can be addressed by PADI2-specific siRNA treatment.

PADIs are calcium-dependent enzymes that post-translationally modify proteins by converting positively charged arginine residues into neutrally charged citrulline in a process known as citrullination or deimination^3-5. We have recently found that peptidylarginine deiminase 2 (PADI2) may function as a novel breast cancer biomarker and that PADI inhibitors represent candidate therapies for early stage breast cancers⁶. For example, we have previously demonstrated that a “pan-PADI” inhibitor, Cl-amidine, suppresses the proliferation of breast cancer cells using 2D monolayers and that the inhibitor suppressed the growth of 3D tumor spheroids⁶. In this report, we extend these studies, and highlight the utility of the soft agar assay, by testing the efficacy of a new PADI inhibitor, BB-CLA, in suppressing the growth of MCF10DCIS breast cancer colonies⁷. We note that we used MCF10DCIS cells for this experiment because they are oncogenic derivatives of non-transformed human MCF10A cells and because they contain high steady state levels of PADI2 protein⁸. We hypothesize that PADI2 enzymatic activity plays a key role in the tumorigenicity of this cell line and that BB-CLA-mediated inhibition of PADI2 activity will suppress cancer progression.

протокол

1. Получение 3% 2-гидроксиэтил агарозном

1. В чистую, сухую стеклянную колбу на 100 мл, добавляют 0,9 г 2-гидроксиэтил агарозы (агарозном VII) с последующим 30 мл дистиллированной воды.
2. Микроволновая печь смесь в течение 15 сек и нежно вихревой. Повторите этот шаг, по крайней мере еще три раза, пока агарозном порошок полностью не растворится.
3. Автоклав, содержащий раствор бутылку в течение 15 мин.
4. Разрешить раствор агарозы остыть до комнатной температуры перед дальнейшим использованием. Хранить раствор при комнатной температуре.

2. Подготовка нижнего слоя: 0,6% агарозном геле

1. Предварительно теплой несколько 5 мл и 10 мл пипетки в 37 ° С инкубатор, чтобы предотвратить затвердевание агарозы в пипетку при обращении.
2. Частично ослабить крышку бутылки и микроволновой печью готовые 3% 2-гидроксиэтил раствор агарозы в течение 15 сек. Затем нежно вихревой решение и микроволновая печь еще 15 сек. ВНИМАНИЕ: Будьте осторожны при закрученной AgaroРаствор существу, потому что раствор поднимается при контакте с воздухом, и может распространиться.
3. Если остаточная твердый гель в бутылке, микроволновая печь на несколько секунд.
4. Держите бутылку, содержащую агарозы решение в водяной бане при 45 ° в течение следующих шагов по предотвращению раствора агарозы затвердевание преждевременно.
5. Теплый MCF10DCIS СМИ в С на водяной бане 37 °. Примечание: MCF10DCIS носитель состоит из DMEM / F12, 5% лошадиной сыворотки, 5% пенициллина стрептомицина.
6. Передача 3 мл 3% -ного раствора агарозы с использованием подогретого пипетки в стерильный 50 мл коническую пробирку.
7. Сразу добавить 12 мл теплой MCF10DCIS СМИ и аккуратно переверните коническую трубку, чтобы смешать агарозы со СМИ. Старайтесь не образуют пузырьки, как это будет мешать колонии считая позже.
8. Осторожно добавляют 2 мл этой смеси в каждую лунку планшета для культивирования 6-луночный без образования пузырьков воздуха.
9. Выдержите культура пластины Horizonta 6-аLLY на плоской поверхности при 4 ° С в течение 1 ч, чтобы дать смеси затвердеть.
10. После того как смесь затвердеет, поместите пластину в 37 ° C инкубаторе в течение 30 мин. Нижний слой готов к использованию.

3. Подготовка клетки, содержащие слой: 0,3% агарозном геле

1. Trypsinize MCF10DCIS клетки и разбавить их концентрации клеток 4 х 10 ⁴ / мл.
2. Возьмите 2 мл 3% агарозы с использованием подогретого пипеток и передать в стерильный 50 мл коническую трубку.
3. Сразу добавить 8 мл MCF10DCIS СМИ конической трубе и аккуратно переверните смешать агарозы со СМИ. Избегайте образования пузырьков.
4. Принимать 2 мл клеток MCF10DCIS (4 х 10 ⁴ / мл) и обработать BB-CLA (0 мкм (ДМСО) или 1 мкМ).
5. В разведении 1: 1, смесь клеток с 0,6% агарозы.
6. Принимать по 1 мл смеси клеток-агарозы и осторожно добавить на нижнем слое культуральной р 6-луночногоконце (2 х 10 ⁴ клеток / мл).
7. Место культуры пластины 6-а горизонтально на плоской поверхности при 4 ° С в течение не менее 15 мин, чтобы верхний слой затвердевать.
8. После того как смесь затвердеет, поместите пластину в 37 ° C инкубаторе в течение недели, прежде чем добавлять фидерного слоя.

4. Подготовка фидерного слоя: 0,3% агарозном геле

1. Микроволновая печь готовые 3% 2-гидроксиэтил раствор агарозы в течение 15 сек. нежно вихревой решение и микроволновая печь еще 15 сек.
2. Равновесие агарозы бутылку раствора в водяной бане при 45 ° C.
3. Теплый СМИ MCF10DCIS на водяной бане 37 ° C.
4. Смешайте 1 мл 3% раствора агарозы с 9 мл теплой MCF10DCIS СМИ в 50 мл коническую трубку и аккуратно переверните смешать агарозы со СМИ. Избегайте образования пузырьков воздуха.
5. Treat смеси с BB-CLA (0 мкм (ДМСО) или 1 мкМ).
6. Аккуратно добавить 1 мл этой смеси (без дляМин пузырьков) в каждую лунку культуральной пластины 6-луночный содержащей дно и мягкие слои.
7. Место культуры пластины 6-а горизонтально на плоской поверхности при 4 ° С в течение не менее 15 мин, чтобы дать смеси затвердеть.
8. После подачи слой затвердевает, поместите пластину в 37 ° C инкубатора.
9. Повторите эту процедуру кормления еженедельно путем наложения 1 мл 0,3% раствора агарозы / средний / лечения на существующей фидерного слоя для пополнения клетки с новыми СМИ, пока не наблюдается образование колоний. Примечание: Агар в мягких и фидерных слоях очень мягким и, следовательно, добавлены питательные вещества из фидерного слоя будет легко диффундируют в слой клеток, содержащих достичь клетки.

5. Сбор данных

1. Через 2,5 недели роста клеток в мягком агаре, подсчитывают количество колоний в каждой лунке с помощью светового микроскопа. Для облегчения количественного, распечатать сетку на прозрачности и прикрепите сетку6-луночный планшет, чтобы помочь определить, где клетки во время подсчета голосов. Так размер колонии (как количественно диаметра каждой колонии) будет изменяться, заранее определить размер опорного колоний, чтобы определить, какие колонии будет забито. Например, включают размеры колонии 70 мкм или больше, при анализе данных.
2. Хранить образцы при температуре 4 ° С, чтобы предотвратить дальнейшее образование колоний и для будущего подсчета. Печать культуру пластину 6-а с парафильмом, чтобы предотвратить гели от высыхания.

Результаты

Мягком агаре анализа образования колоний может быть использован для широкого диапазона приложений, документирующих онкогенность раковых клеток. Основным преимуществом этого метода является то, что полутвердой матрице избирательно способствует росту клеток, которые могут размножат...

Обсуждение

Скорость образования колоний в мягком агаре варьируется в зависимости от типа клеток ^9. Таким образом, количество клеток, чтобы начать с должны быть оптимизированы и соответствующим образом скорректированы. Предложил начать диапазон от 5 × 10 ² до 1 · 10 ⁴ клеток на лунку, ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zeiss Axiopot	Carl Zeiss Microscopy	1021859251
Inverted Microscope	Olympus	CKX41
DMEM/F-12	Lonza BioWhittaker	12-719F
HyClone Donor Equine Serum	Fisher Scientific	SH30074.03
Penicillin Streptomycin	Life Technologies	15140-122
2-Hydroxyethylagarose: Type VII, low gelling temperature	Sigma-Aldrich	39346-81-1