يعيش التصوير خلية خلال الإمتداد الميكانيكية

Summary

A novel imaging protocol was developed using a custom motor-driven mechanical actuator to allow the measurement of real time responses to mechanical strain in live cells. Relevant to mechanobiology, the system can apply strains up to 20% while allowing near real-time imaging with confocal or atomic force microscopy.

Abstract

There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in their capability for measuring responses in real time in live cells or viable tissue. A protocol was developed with the use of a cell actuator to distend live cells grown on or tissues attached to an elastic substrate while imaging with confocal and atomic force microscopy (AFM). Preliminary studies show that tonic stretching of human bronchial epithelial cells caused a significant increase in the production of mitochondrial superoxide. Moreover, using this protocol, alveolar epithelial cells were stretched and imaged, which showed direct damage to the epithelial cells by overdistention simulating one form of lung injury in vitro. A protocol to conduct AFM nano-indentation on stretched cells is also provided.

Introduction

تتعرض الخلايا لالأحمال الميكانيكية في العديد من الأنسجة، ولقد ثبت هذا التحفيز الميكانيكي لتعزيز التغييرات في أنماط التعبير الجيني، وإطلاق سراح من عوامل النمو، السيتوكينات، أو إعادة تشكيل المصفوفة خارج الخلية والهيكل الخلوي ^1-4. الإشارات بين الخلايا transduced من هذه المحفزات الميكانيكية تحدث من خلال عملية mechanotransduction ^5-7. في الجهاز التنفسي، نتيجة واحدة من mechanotransduction هي زيادة في أنواع الاكسجين التفاعلية (ROS) ^8،9 والسيتوكينات الموالية للالتهابات ¹⁰ في الخلايا الظهارية الرئوي في وجود دوري سلالة الشد. أدلة قوية تشير أيضا إلى أن الإفراط في الضغط الشد يؤدي إلى ضرر مباشر على ظهارة السنخية، بالإضافة إلى ردود البيوكيميائية للخلايا ^11-14. على الرغم من أن التركيز هنا ينصب بالدرجة الأولى على استجابة خلايا الرئة إلى تشويه الميكانيكية، ومسارات الناجمة عن mechanotransduction تلعب دورا رئيسيا في BASجيم ظيفة العديد من الأنسجة في جسم الإنسان، بما في ذلك تنظيم الأوعية الدموية لهجة ¹⁵ ووضع لوحة النمو ^16.

وقد أدى الاهتمام المتزايد في mechanotransduction في تطوير العديد من الأجهزة لتطبيق الأحمال الميكانيكية ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية للخلايا المستزرعة والأنسجة. على وجه الخصوص، وأجهزة تطبيق إجهاد الشد، وهو شكل شائع من تحميل الميكانيكية التي يعاني منها الأنسجة، وتحظى بشعبية ^11،17-19. ومع ذلك، فإن العديد من الأجهزة المتوفرة مصممة إما مفاعل حيوي لتطبيقات هندسة الأنسجة أو لا تفضي إلى التصوير في الوقت الحقيقي مع التمدد. على هذا النحو، هناك حاجة إلى تطوير الأدوات والأساليب التي يمكن تصور الخلايا والأنسجة في التوتر لتسهيل التحقيق في ممرات mechanotransduction.

هنا، تم تصميم جهاز تمتد في الطائرة الميكانيكية وتم تطوير بروتوكولات لتطبيق مأشكال ultiple من سلالة إلى الأنسجة والخلايا في حين يسمح التصوير من الاستجابات الكيميائية الحيوية والميكانيكية في الوقت الحقيقي (الشكل 1A-D). ويستخدم الجهاز ستة المشابك متباعدة بشكل متساو ترتيب محيطي لفهم غشاء مرن وتطبيق في الطائرة، وانتفاخ شعاعي تصل إلى ما يقرب من 20٪ (الشكل 1B). يمكن وضعها الجهاز المشغلات في حاضنة الثقافة خلية لفترة طويلة من الزمن، في حين يتم وضع المحرك (الشكل 1C) خارج الحاضنة والتي تسيطر عليها البرمجيات الاحتكارية التي يقدمها المورد المحرك. ويرتبط المحرك للسائق الخطي، والتي تدور على كام الداخلية، والقيادة المشابك نقالة ستة موحد في التوتر والاسترخاء.

بالإضافة إلى جهاز ميكانيكي، تم إنشاء أغشية مرنة مخصصة من المتاحة تجاريا ثقافة الخلية أغشية جاهزة لاستخدامها في نظام ميكانيكي. الجدران ثم دائرية (التي يبلغ قطرها حوالي28 ملم) وقدمت ويعلق على لغشاء مرن بحيث يمكن زرع خلايا فقط في هذه المنطقة من موصوفة وصفا جيدا الشخصي سلالة. من أجل تحديد ما إذا كان وضع هذه الأغشية داخل الجهاز المشغلات من شأنه أن يوفر سلالة موحد وموحد الخواص في وسط الغشاء مرنا، أجري تحليل العناصر المحدودة باستخدام البرمجيات المتاحة تجاريا (الشكل 1E-F). وعلى غرار غشاء مرن مع شروط الحدود المتماثلة والاستفادة من جميع العناصر الرباعية للشبكة. حلقات متحدة المركز ينظر في المؤامرة كفاف من أقصى سلالة الرئيسي هو مبين في الشكل 1F تشير إلى توزيع الخواص من سلالة.

وقد تم قياس الإجهاد التي يعاني منها الغشاء عن طريق تسجيل الصور من علامات عن طريق التحميل (الشكل 2). ويبين الشكل 2D أن متوسط ​​سلالة غشاء تقاس شعاعي ومحوري الاتجاهات وكان ما يقرب من الخطيةفيما يتعلق المحرك تطبيقها تعول ما يصل الى سلالة خطي الحد الأقصى من 20٪. لم يكن هناك فرق كبير بين مستويات الإجهاد خلال قياس انتفاخ مقارنة مع تلك التي تقاس خلال التراجع مرة أخرى إلى موقف يستريح. بعد ذلك، تم قياس تشريد الخلايا البشرية القصبية الظهارية (16HBE) والنواة مثقف على الغشاء مخصصة مرونة. تم تصوير fluorescently المسمى (دابي) نوى الخلايا 16HBE باستخدام الهدف 20X تحت المجهر متحد البؤر، في حين تم قياس النزوح خلية كاملة مع الصور الطوري سجلت مع المجهر الرقمي. كما رأينا في الشكل (3)، وكان من سلالة تقاس تشريد النوى مماثلة لتلك التي تقاس تشريد علامات على الغشاء، وتصل إلى 20٪ ~ سلالة الخطي. هذا يؤكد أن سلالة تطبيقها على الأغشية وأحيلت إلى الخلايا الملتصقة. البروتوكولات واصفا استخدام الجهاز مخصص على المجهر التقليدي وmicroscop القوة الذريةيتم توفير البريد في الخطوات التالية.

Protocol

1. بناء الغشاء مع الجدران حسنا لاستبقاء خلية الإعلام الثقافة (انظر الشكل 1D للمنتج النهائي)

1. باستخدام polydimethylsiloxane (PDMS) ورقة المغلفة مع الكولاجين الأول، قطع الخطوط العريضة للغشاء مرن مع مشرط أو يموت.
2. وضع كل الغشاء في 60 مم طبق بتري للتخزين.
3. إنشاء الجدران:
   1. مزيج PDMS في 10: 1 نسبة الوزن من المطاط الصناعي A إلى B المطاط الصناعي (وكيل علاج).
   2. صب 5 مل من PDMS المختلطة بالكامل في 50 مل أنابيب.
   3. وضع 50 مل الأنابيب مع PDMS غير مخمر أفقيا في فرن التهجين.
   4. استخدام وظيفة الدوار لطلاء الجدران الداخلية للأنابيب في 8 دورة في الدقيقة خلال فترة المعالجة. في RT، وPDMS سوف يشفى تماما في 2 يوما.
   5. إزالة PDMS من الأنبوب في الثقافة العقيمة خلية غطاء محرك السيارة.
   6. باستخدام شفرة حلاقة جديدة، تقسيم الاسطوانة من PDMS إلى أقسام 4 مم في الارتفاع.
   7. وضع المقاطع، والتي سوف تكون بمثابة وا الغشاءLLS، في وعاء طبق بتري دون السماح للالجدران لتصبح مجعدة.
4. اختيار ومركز جدار واحد من PDMS على غشاء واحد مع الحفاظ على اثنين في طبق بيتري.
5. وضع بلطف PDMS غير مخمر (10: 1 نسبة) على محيط الخارجي للجدار لاستخدامها الغراء. منع تشكيل الفجوات بين الجدار والغشاء لأنه لا يوجد في الاحتفاظ السائل.
6. وضع كل طبق بتري تحتوي على غشاء المنجزة والمشمولة في فرن عند 70 درجة مئوية لمدة 24 ساعة لعلاج.

2. الربط بين دوران المحرك مع المشبك النزوح أو شعاعي النمو لمعايرة (الشكل 2)

1. بدء برنامج التحكم في المحرك.
2. تهجير المشابك الجهاز باستخدام الإعداد اليدوي في البرامج الحركية.
3. قياس المسافة وتسجيل موقف عدد السيارات بين معارضة المشابك في كل من النزوح الحد الأدنى والحد الأقصى من المشابك.
4. حساب التغير في المئة في دistance بين المشابك بوصفها وظيفة من عدد السيارات (~ 0-75k التهم). وهذا يشير إلى الحد الأقصى للسلالة المحتملة التي تحققت على الغشاء.

3. تطبيق تمتد على الرئة ماوس الظهارية الخط الخليوي (MLE12)

1. البذور MLE12 الخلايا عند 2.5 مليون خلية على غشاء مرن (الخطوة 1) لكل بئر إلى أن متكدسة في غضون يومين. قد تختلف كثافة البذر لأنواع مختلفة من الخلايا.
2. تأكد من أن المحرك الميكانيكي في وضع مريح تماما.
   1. إزالة الخلايا سائل الإعلام والثقافة.
   2. باستخدام 1.5 ملم اللكمات الخزعة، لكمة اثنين من الثقوب في كل من المشبك ستة (انظر الشكل 1D) علامات التبويب من الغشاء. وضع شعاعي من الثقوب يحدد مقدار ما قبل التوتر تجارب غشاء البداية. لكمة ثقوب في دائرة نصف قطرها 20،5 ملم على علامات التبويب غشاء إذا كان المطلوب لا قبل التوتر.
   3. وضع غشاء على نقالة مع ثقبا يصطفون مع دبابيس داخل المشابك.أعلى مكان المشابك في المكان. تضييق الخناق في وقت واحد بالتناوب الجانبين.
   4. إضافة 1 مل سائل الإعلام ثقافة الخلية.
3. وضع الجهاز على المسرح المجهر تركز وسط الغشاء مع مسار الضوء.
4. استخدام الشريط أو مغناطيس (إن أمكن) لإصلاح الجهاز إلى المرحلة. مرة واحدة ثابتة، والسيطرة على في الطائرة (موازية للغشاء) والرأسي (ض الاتجاه) من جهاز ميكانيكي مع وحدة تحكم مرحلة من مراحل المجهر.
5. تطبيق تمتد مع البرامج المقدمة من قبل الشركة المصنعة عن طريق التحكم في الموقف وسرعة دوران المحرك ²⁰ يدويا.

4. قياس الميتوكوندريا أنواع الاكسجين التفاعلية (ROS)

1. بمجرد متموجة الخلايا، إضافة 1-2 مل من RT DMEM مع مؤشر الفائق الميتوكوندريا (5 ميكرومتر تركيز النهائي) مباشرة على الخلايا.
2. احتضان لمدة 10 دقيقة عند 37 ° C.
3. غسل الخلايا بلطف ثلاث مرات مع العازلة تحسنت في حمام مائي ل37 ° C.
4. المكان على الفور غشاء مرن على نقالة (الخطوة 2.2) بالفعل في مكان تحت المجهر متحد البؤر تستقيم.
5. إضافة 1 مل من DMEM مع الفينول الحمراء المتوسطة مجانا و 25 ملم من HEPES.
6. تعيين المرشحات الإثارة / الانبعاثات 510/580 نانومتر.
7. صورة حقول متعددة كل 15 دقيقة لخلق مسار الوقت المطلوب لإنتاج الفائق الميتوكوندريا.
8. من الصور التي تم التقاطها، رسوم بيانية كثافة سجل مضان في كل فترة زمنية باستخدام برمجيات قادرة على قياس كثافة مضان.

5. تطبيق تمدد وقوة الذرية المجهر (AFM)

ملاحظة: يتم توفير هذه الخطوات لAFM محددة والجمع بين المجهر الضوئي (الشكل 4 و قائمة المواد).

1. إعداد AFM للتجربة.
   1. زيادة ارتفاع الرأس AFM إلى موقف الأقصى في ض الاتجاه.
   2. وضع تمديدات على الساقين من AFM لرفع الطائرة التي AFM الاتصالات ناتئ العينة. العينة ورئيس AFM لا بد من رفع لاستيعاب ارتفاع جهاز ميكانيكي.
2. إعداد المجهر الضوئي (إن وجد).
   1. إزالة لوحة AFM الماسح الضوئي. إزالة الهدف المنشود.
   2. إضافة فاصل إلى الهدف. إن ذروة هل تعتمد على الهدف وAFM المحددة المتابعة، ولكن من الضروري إذا كانت هناك رغبة التصوير الضوئي منذ طائرة المراقبة سيكون تحولا في الاتجاه التصاعدي مبلغ يساوي نقالة وارتفاع محول (الشكل 5A). لاحظ أن AFM تقدم عادة منخفضة التصوير التكبير من مسار بصري فوق الجهاز.
   3. يعلو ظهر الهدف المنشود في موقعه. ضع الماسح الضوئي مرة أخرى إلى AFM.
   4. بدء تشغيل البرنامج AFM. تبدأ كل مصادر الضوء اللازمة بما في ذلك مصدر الضوء لقياس مضان.
   5. جبل رقاقة مع شعاع ناتئ أنغير مناسبة القياسات المطلوبة. ويفضل 200 السندات الإذنية / نانومتر أو أقل صلابة عند قياس معامل مرونة الخلايا الحية.
   6. محاذاة الليزر ومعايرة صلابة ناتئ وفقا لاقتراحات الشركة المصنعة على ساترة الزجاج التي شنت على الجهاز.
3. إعداد الغشاء كما في الخطوة 1، ولكن مع التعديلات التالية.
   1. مباشرة قبل تركيب الغشاء إلى جهاز تمتد، وقطع الجدران إلى حوالي 1 ملم في الطول. هذا يمنع تدخل من ذوي الخبرة بين الجدران غشاء الخلية والحمل.
   2. تركيب غشاء على الجهاز الميكانيكي كما هو موضح 3.2.1-3.2.3.
   3. إزالة وسائل الإعلام ثقافة الخلية لمنع الأضرار التي لحقت الماسح الضوئي AFM في حالة وجود تسرب.
   4. زوجين الجهاز مع محول (الشكل 5A). وضع جهاز ميكانيكي مع محول على الماسح الضوئي.
   5. تمتد الغشاء إلى مستوى سلالة الشد المطلوب.
4. نانو المسافة البادئة الخلايا تمدد.
   1. إضافة محدود (<0.5 مل) حجم وسائل الاعلام على الخلايا لتجنب الماسح الضوئي AFM أو الضرر المجهر بسبب وجود تسرب.
   2. إشراك شعاع ناتئ مع الغشاء.
   3. متابعة بروتوكول للجهاز AFM خاص لمسح المناطق المثيرة للاهتمام.

النتائج

أنواع الاكسجين التفاعلية والتشوه

وقد أظهرت الدراسات السابقة زيادة في أنواع الاكسجين التفاعلية (ROS) في الشعب الهوائية والخلايا الظهارية السنخية ردا على امتداد دوري ^21. وتشمل أنواع الاكسجين التفاعلية جزيئات والجذور الح?...

Discussion

وقد تم تطوير جهاز فريد من نوعه لتصوير الخلايا الحية خلال تمتد الميكانيكية. وهذا الجهاز كان يستخدم في البروتوكول لدراسة الظهارية الرئة ذي الخلية mechanobiology. في الدراسات الأولية، تبين أن شريط واحد عقد حفز إنتاج الفائق الميتوكوندريا في الخلايا الظهارية القصبية. بالإضافة ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
SmartMotor NEMA 34: 3400 Series	MOOG Animatics	SM3416D	Integrated motor, controller, amplifier, encoder and communications bus
Flexcell Membrane (Collagen I coated)	Flexcell International Corp	SM2-1010C	3.5" x 5.25" x 0.020"
Sylgard 184	Dow Corning Corporation		10:1
Hoechst 33342	Sigma-Aldrich	H1399	DAPI stain
MitoSOX	Sigma-Aldrich	M36008
Tiron	Sigma-Aldrich	D7389	mitochondrial superoxide label
DMEM			superoxide inhibitor
FBS
HEPES
50 ml tubes	Fisher Scientific	06-443-19	Any centriguge tube can be used to create an area for imaging.
Hybridization oven	Bellco Glass
MLE12 Cells	ATCC	CRL-2110	Mouse Lung Epithelial Cells
16HBE cells	ATCC	CRL-2741	Human Bronchial Epithelial Cells
AFM Indentation Experiments
Cantilever Beams for Nano-indentation	Budget Sensors	Si-Ni30
AFM	Asylum Research	MFP3D
Olympus microscope	Olympus	IX-71	Inverted microscope with 20X and 40X objectives.
AFM Leg Extenders	Asylum Research	Not available	AFM microscope
Finite Element Analyses
ABAQUS	Simulia	6.12
Software
ImageJ	NIH
Microscopes
Digital microscope	Life Technologies	EVOS XL Core	Initially a self standing company, now owned by Life Technologies.
Confocal microscope	Zeiss	LSM 710	2-photon upright microscope