Live Cell Imaging bei Mechanical Stretch

Zusammenfassung

A novel imaging protocol was developed using a custom motor-driven mechanical actuator to allow the measurement of real time responses to mechanical strain in live cells. Relevant to mechanobiology, the system can apply strains up to 20% while allowing near real-time imaging with confocal or atomic force microscopy.

Zusammenfassung

There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in their capability for measuring responses in real time in live cells or viable tissue. A protocol was developed with the use of a cell actuator to distend live cells grown on or tissues attached to an elastic substrate while imaging with confocal and atomic force microscopy (AFM). Preliminary studies show that tonic stretching of human bronchial epithelial cells caused a significant increase in the production of mitochondrial superoxide. Moreover, using this protocol, alveolar epithelial cells were stretched and imaged, which showed direct damage to the epithelial cells by overdistention simulating one form of lung injury in vitro. A protocol to conduct AFM nano-indentation on stretched cells is also provided.

Einleitung

Zellen werden gegenüber mechanischen Belastungen in vielen Geweben unterzogen, und das mechanische Stimulation wurde gezeigt, dass Veränderungen in den Mustern der Genexpression, die Freisetzung von Wachstumsfaktoren, Cytokine oder Umbau der extrazellulären Matrix zu fördern und Zytoskelett ^1-4. Die intrazellulären Signale solcher mechanischen Reizen transduziert auftreten durch den Prozess der mechanotransduction ^5-7. Im Atmungssystem ist ein Ergebnis der mechanotransduction die Erhöhung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) ^8,9 und proinflammatorische Zytokine ¹⁰ in Lungenepithelzellen in Gegenwart von zyklischen Zugbelastung. Starke Beweise legen auch nahe, dass die übermäßige Zugspannung führt zu Verletzungen der Alveolarepithel direkt neben den biochemischen Reaktionen der Zellen ^11-14. Obwohl der Fokus liegt hier vor allem auf die Reaktion der Lungenzellen auf mechanische Verformung, Wege durch Mechanotransduktion induzierte spielen eine Schlüsselrolle in den basic Funktion vieler Gewebe im menschlichen Körper, einschließlich der Regulation des Gefäßtonus ¹⁵ und die Entwicklung der Wachstumsplatte ^16.

Das wachsende Interesse an mechanotransduction hat zur Entwicklung zahlreicher Geräte für die Anwendung von physiologisch relevanten mechanischen Belastungen an kultivierte Zellen und Gewebe geführt. Insbesondere sind Geräte Anlegen einer Zugspannung, die eine häufige Form der mechanischen Belastung durch Gewebe erfahren ist, populär ^11,17-19. Jedoch können viele der verfügbaren Geräte werden entweder als Bioreaktor für das Tissue Engineering-Anwendungen entwickelt oder sind nicht förderlich für eine Echtzeitabbildung mit Stretch. Als solches gibt es einen Bedarf an Werkzeugen und Verfahren, die Zellen und Gewebe unter Zugspannung zu visualisieren kann, um die Untersuchung von Wegen von mechanotransduction erleichtern.

Dabei wurde eine in der Ebene mechanischen Spannvorrichtung entwickelt und Protokolle wurden entwickelt, um m geltenultiple Formen Stamm zu Geweben und Zellen und ermöglicht die Abbildung der biochemischen und mechanischen Reaktionen in Echtzeit (1A-D). Das Gerät verfügt über sechs in Umfangsrichtung angeordnet, um eine flexible Membran greifen und gelten in der Ebene liegende radiale Ausdehnung von bis zu etwa 20% (1B) gleichmäßig beabstandete Schellen. Die Betätigungsvorrichtung kann in einem Zellkulturbrutschrank über einen längeren Zeitraum gegeben werden, während der Motor (1C) außerhalb des Inkubators angeordnet ist und von proprietärer Software vom Motorlieferanten bereitgestellt gesteuert. Der Motor ist mit einem linearen Antriebsteil, der einen Innennocken dreht, fahren die sechs Trage Klemmen einheitlich in An- und Entspannung verbunden ist.

Zusätzlich zu der mechanischen Vorrichtung wurden angepasst flexiblen Membranen aus im Handel erhältlichen Zellkultur bereit Membranen geschaffen, um in dem mechanischen System verwendet werden. Dann kreisförmigen Wände (mit einem Durchmesser von ca.28 mm) wurden hergestellt und auf die flexible Membran, so dass Zellen nur in diesem Bereich der gut beschriebene Spannungsprofil kultiviert werden, befestigt. Um zu bestimmen, ob die Position dieser Membranen innerhalb der Betätigungsvorrichtung würde gleichförmig und isotrop Belastung in der Mitte der flexiblen Membran bereitzustellen, wurde Finite-Elemente-Analyse unter Verwendung kommerziell erhältlicher Software (1E-F) durchgeführt. Die flexible Membran wurde mit symmetrischen Randbedingungen und die Nutzung aller vierseitigen Elemente zu dem Netz modelliert. Die konzentrischen Ringe in der Konturdiagramm der maximalen Hauptdehnung in 1F gezeigt gesehen zeigen die isotropen Verteilung der Belastung.

Der Stamm von der Membran erfahren wurde durch die Aufnahme von Bildern von Markierungen durch Beladung (Figur 2) gemessen. 2D zeigt, dass der durchschnittliche Membran Dehnung in radialer und axialer Richtung gemessen wurde, war annähernd linearenin Bezug auf die angelegte Motor zählt bis zu einer maximalen linearen Dehnung von 20%. Es gab keinen signifikanten Unterschied zwischen den Dehnungsniveaus während Ausdehnung gemessen im Vergleich mit denen beim Zurückziehen wieder in die Ruheposition gemessen wird. Als nächstes wird die Verschiebung der humanen bronchialen Epithelzellen (16HBE) und ihre Kerne auf dem benutzerdefinierten flexible Membran kultiviert wurden, wurden gemessen. Fluoreszenzmarkierten (DAPI) Kerne der 16HBE Zellen wurden mit einem 20x-Objektiv unter einem konfokalen Mikroskop abgebildet wird, während ganze Zelle Verschiebung wurde mit Phasenkontrast-Aufnahmen mit einem digitalen Mikroskop aufgenommenen Mess. Wie in Figur 3 zu sehen ist, die Belastung durch die Verschiebung der Kerne gemessen wurde, war ähnlich der durch Verschieben von Markierungen auf der Membran gemessen wird, bis zu ca. 20% linear Belastung. Dies bestätigt, daß der Stamm zu den Membranen aufgebracht wurde zu den adhärenten Zellen übertragen. Die Protokolle, die die Verwendung des benutzerdefinierten Geräte auf einem herkömmlichen Mikroskop und ein Atomkraft microscope werden in den folgenden Schritten.

Protokoll

1. Aufbau der Membrane mit Well Walls für Retention von Zellkulturmedien (siehe 1D für das Endprodukt)

1. Verwendung Polydimethylsiloxan (PDMS) Platten mit Collagen I beschichtet sind, schneiden die Kontur der flexiblen Membran mit einem Skalpell oder einer Düse.
2. Platzieren Sie jede Membran in einer 60 mm Petrischale für die Lagerung.
3. Erstellung von Wänden:
   1. Mischungs PDMS bei einem 10: 1-Gewichtsverhältnis von Elastomer A bis B (Härter) Elastomer ist.
   2. Gießen Sie 5 ml vollständig vermischt PDMS in 50 ml Tuben.
   3. Zeigen 50 ml Röhrchen mit nicht ausgehärteten PDMS horizontal in einem Hybridisierungsofen.
   4. Verwenden die Rotorfunktion zur Beschichtung der Innenwände der Rohre bei 8 rpm während der Aushärtezeit. Bei RT wird das PDMS vollständig in 2 Tagen ausgehärtet werden.
   5. Entfernen Sie die PDMS aus der Röhre in einem sterilen Zellkultur Kapuze.
   6. Mit Hilfe einer neuen Rasierklinge, partitioniert die Zylinder des PDMS in Abschnitte 4 mm in der Höhe.
   7. Legen Sie die Abschnitte, die als Membran wa dienen wirdlls, in eine Petrischale Behälter, ohne dass die Wände zu werden erhöht.
4. Auszuwählen und in der Mitte einer Wand des PDMS an einer Membran, während die beiden in der Petrischale erhalten bleibt.
5. Ganz sanft ungehärteten PDMS (Verhältnis 10: 1) auf dem äußeren Umfang der Wand, als Klebstoff verwendet werden. Verhindern die Bildung von Zwischenräumen zwischen der Wand und der Membran, da es dort zu Flüssigkeit zurückzuhalten.
6. Platzieren Sie jede Petrischale mit den fertigen Membran und in einem Ofen bedeckt bei 70 ° C für 24 Stunden, um zu heilen.

2. Korrelation der Motorumdrehungen mit Clamp Verschiebung oder radiale Wachstum für Kalibrierung (Abbildung 2)

1. Starten Sie die Software die Steuerung des Motors.
2. Verdrängen die Klemmen des Geräts mit der manuellen Einstellung der Motorsoftware.
3. Messen des Abstands und Aufzeichnung der Motor Zählposition zwischen gegenüberliegenden Klemmen an beiden minimalen und maximalen Verschiebung der Klammern.
4. Berechnen der prozentualen Änderung in der distance zwischen den Klammern in Abhängigkeit von der Motorzählung (~ 0-75k Aktivität). Dadurch wird die maximal mögliche Belastung der Membran erreicht anzuzeigen.

3. Anwendung der Stretch auf Maus Lung Epithelzelllinie (MLE12)

1. Samen MLE12 Zellen 2,5 Millionen Zellen auf der flexiblen Membran (Schritt 1) ​​pro Vertiefung innerhalb von zwei Tagen konfluent werden. Die Aussaatdichte für unterschiedliche Zelltypen variieren.
2. Sicherzustellen, dass die mechanische Betätigungseinrichtung in einer vollständig entspannten Position.
   1. Entfernen von Zellkulturmedien.
   2. Verwendung von 1,5 mm Biopsieausstanzungen, Punch zwei Löcher in jeder der sechs Klemm (siehe Figur 1D) Laschen der Membran. Die radiale Anordnung der Löcher bestimmt die Menge der Vorspannung der Membran zunächst Erfahrungen. Ausstanzung der Löcher auf einem Radius von 20,5 mm an den Membranzungen wenn keine Vorspannung erwünscht ist.
   3. Positionieren Sie die Membran auf dem Keilrahmen mit den gestanzten Löchern Schlange mit den Stiften in den Klammern.Zeigen oberen Klemmen vorhanden. Ziehen Sie die Schrauben ein zu einer Zeit wechselseitig.
   4. 1 ml Zellkulturmedium.
3. Platzieren der Vorrichtung auf dem Mikroskoptisch Zentrierung der Mitte der Membran mit dem Lichtweg.
4. Verwenden Sie Isolierband oder Magneten (wenn möglich), um das Gerät auf die Bühne zu beheben. Sobald festen, steuern die in der Ebene (parallel zur Membran) und vertikalen (z-Richtung) der mechanischen Einrichtung mit der Tischsteuereinrichtung des Mikroskops.
5. Bewerben Strecke mit dem vom Hersteller durch die Position und Geschwindigkeit der Motordrehung ²⁰ manuelle Steuerung zur Verfügung gestellte Software.

4. Messung der Mitochondrial reaktiven Sauerstoffspezies (ROS)

1. Sobald Zellen konfluent, fügen Sie 1-2 ml RT DMEM mit mitochondrialen Superoxid-Anzeige (5 & mgr; M Endkonzentration) direkt auf die Zellen.
2. Inkubieren für 10 min bei 37 ° C.
3. Wasche die Zellen vorsichtig dreimal mit Puffer erwärmt in einem Wasserbad auf37 ° C.
4. Sofort platzieren die flexible Membran auf dem Keilrahmen (Schritt 2.2) bereits im Rahmen einer aufrechten konfokalen Mikroskop.
5. 1 ml DMEM mit Phenolrot-freiem Medium und 25 mM HEPES.
6. Stellen Anregungs- / Emissions Filter können 510/580 nm.
7. Bild mehrere Felder alle 15 min, um die gewünschte Zeitverlauf der mitochondrialen Superoxid-Produktion zu schaffen.
8. Von aufgenommenen Bildern, Histogramme Aufzeichnung der Fluoreszenzintensität in jedem Zeitintervall unter Verwendung von Software in der Lage ist die Quantifizierung der Fluoreszenzintensität.

5. Anwendung der Stretch und Rasterkraftmikroskopie (AFM)

Hinweis: Diese Schritte werden für eine bestimmte AFM und optischen Mikroskop Kombination (Abbildung 4 und Materialliste) versehen ist.

1. Bereiten Sie das AFM für das Experiment.
   1. Erhöhen die Höhe des AFM Kopfes zu seiner maximalen Position in der z-Richtung.
   2. Gesetzt Extender auf die Beine des AFMHeben Sie die Ebene, bei der AFM Cantilever Kontakten der Probe. Die Probe und das AFM Kopf muss angehoben werden, um die Höhe der mechanischen Vorrichtung aufzunehmen.
2. Bereiten Sie das Lichtmikroskop (falls vorhanden).
   1. Entfernen Sie die AFM-Scanner Platte. Entfernen Sie das gewünschte Ziel.
   2. Fügen Sie einen Abstandshalter auf das Ziel. Die Höhe des Abstandhalters würde die Aufgabe und die spezifische AFM Aufbau abhängen, aber es ist erforderlich, wenn optische Bildgebung erwünscht ist, da Beobachtungsebene verschiebt sich in der z-Richtung um einen Betrag gleich der Trage und Adapterhöhe (Figur sein 5A). Beachten Sie, dass die AFM bietet in der Regel geringer Vergrößerung Bildgebung aus einer optischen Pfad über dem Gerät.
   3. Montieren Sie die gewünschte Ziel wieder in seine Lage. Stellen Sie den Scanner wieder ein, um die AFM.
   4. Starten Sie die AFM-Software. Starten Sie alle notwendigen Lichtquellen einschließlich der Lichtquelle für Fluoreszenzmessungen.
   5. Montieren Sie einen Chip mit einer freitragenden Balken,ist für die gewünschten Messungen geeignet. 200 pN / nm oder weniger Steifigkeit wird bevorzugt, wenn die Messung des Elastizitätsmoduls von lebenden Zellen.
   6. Richten Sie den Laser und Kalibrierung des freitragenden Steifigkeit nach Hersteller Vorschläge auf einem Deckglas auf dem Gerät angebracht ist.
3. Vorbereitung einer Membran wie in Schritt 1, jedoch mit folgenden Modifikationen.
   1. Unmittelbar vor der Montage der Membran an der Streckvorrichtung, schneiden die Wände bis etwa 1 mm in der Höhe. Dies verhindert, dass die Interferenz zwischen den Membranwänden und dem Last Zelle erfährt.
   2. Halterung der Membran an der mechanischen Vorrichtung, wie beschrieben, 3.2.1-3.2.3.
   3. Zellkulturmedium zu entfernen, um eine Beschädigung der AFM-Scanner im Falle eines Austretens verhindern.
   4. Paar das Gerät mit einem Adapter (5A). Legen Sie die mechanische Vorrichtung mit dem Adapter auf den Scanner.
   5. Dehnen Sie die Membran auf die gewünschte Dehnung Ebene.
4. Nano-Eindruck der gestreckten Zellen.
   1. Fügen Sie eine begrenzte (<0,5 ml) Volumen von Medien auf die Zellen, um AFM Scanner oder Mikroskop Schäden zu vermeiden aufgrund eines spill.
   2. Aktivieren Sie den Freiträger mit der Membran.
   3. Folgen Sie dem Protokoll des jeweiligen AFM-Gerät, um Bereiche von Interesse zu scannen.

Ergebnisse

Reaktive Sauerstoffspezies und Deformation

Frühere Studien haben Steigerungen reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in den Atemwegen und alveolare Epithelzellen in Reaktion auf zyklische Dehnung ²¹ gezeigt. Reaktive Sauerstoffspezies umfassen Moleküle und freie Radikale aus molekularem Sauerstoff mit einer hohen Reaktivität gegenüber Lipiden, Proteinen, Polysacchariden und Nukleinsäuren ^22-24 abgeleitet ist. ROS dienen als gemeinsame intrazellulären Signal an...

Diskussion

Ein einzigartiges Gerät für Live Cell Imaging bei mechanischer Dehnung entwickelt; und diese Vorrichtung wurde in einem Protokoll zum Lungen Epithelzellen Mechanobiologie studieren. In Voruntersuchungen wurde festgestellt, dass eine einzige statt Streck stimuliert die Produktion von Superoxid in mitochondrialen bronchiale Epithelzellen. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass erhöhte mechanische Belastung verursacht direkte Beschädigung der Integrität einer Monoschicht von alveolären Epithelzellen.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
SmartMotor NEMA 34: 3400 Series	MOOG Animatics	SM3416D	Integrated motor, controller, amplifier, encoder and communications bus
Flexcell Membrane (Collagen I coated)	Flexcell International Corp	SM2-1010C	3.5" x 5.25" x 0.020"
Sylgard 184	Dow Corning Corporation		10:1
Hoechst 33342	Sigma-Aldrich	H1399	DAPI stain
MitoSOX	Sigma-Aldrich	M36008
Tiron	Sigma-Aldrich	D7389	mitochondrial superoxide label
DMEM			superoxide inhibitor
FBS
HEPES
50 ml tubes	Fisher Scientific	06-443-19	Any centriguge tube can be used to create an area for imaging.
Hybridization oven	Bellco Glass
MLE12 Cells	ATCC	CRL-2110	Mouse Lung Epithelial Cells
16HBE cells	ATCC	CRL-2741	Human Bronchial Epithelial Cells
AFM Indentation Experiments
Cantilever Beams for Nano-indentation	Budget Sensors	Si-Ni30
AFM	Asylum Research	MFP3D
Olympus microscope	Olympus	IX-71	Inverted microscope with 20X and 40X objectives.
AFM Leg Extenders	Asylum Research	Not available	AFM microscope
Finite Element Analyses
ABAQUS	Simulia	6.12
Software
ImageJ	NIH
Microscopes
Digital microscope	Life Technologies	EVOS XL Core	Initially a self standing company, now owned by Life Technologies.
Confocal microscope	Zeiss	LSM 710	2-photon upright microscope