הדמיה של תא חי במהלך מכאני למתוח

Summary

A novel imaging protocol was developed using a custom motor-driven mechanical actuator to allow the measurement of real time responses to mechanical strain in live cells. Relevant to mechanobiology, the system can apply strains up to 20% while allowing near real-time imaging with confocal or atomic force microscopy.

Abstract

There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in their capability for measuring responses in real time in live cells or viable tissue. A protocol was developed with the use of a cell actuator to distend live cells grown on or tissues attached to an elastic substrate while imaging with confocal and atomic force microscopy (AFM). Preliminary studies show that tonic stretching of human bronchial epithelial cells caused a significant increase in the production of mitochondrial superoxide. Moreover, using this protocol, alveolar epithelial cells were stretched and imaged, which showed direct damage to the epithelial cells by overdistention simulating one form of lung injury in vitro. A protocol to conduct AFM nano-indentation on stretched cells is also provided.

Introduction

תאים חשופים לעומסים מכאניים ברקמות רבות, וגירוי מכאני זה הוכח לקדם שינויים בדפוסי ביטוי גנים, שחרור של גורמי גדילה, ציטוקינים, או שיפוץ של מטריקס ושלד תא ^1-4. האותות תאיים transduced מגירויים מכאניים כאלה מתרחשים בתהליך של mechanotransduction ^5-7. במערכת הנשימה, תוצאה אחת של mechanotransduction היא העלייה במינים תגובתי חמצן (ROS) ^8,9 וציטוקינים פרו-דלקתי ¹⁰ בתאי אפיתל ריאה בנוכחות של מתח מתיחה מחזורי. ראיות חזקות גם מצביעות על כך שזן מתיחה מוגזם מוביל לכוון פגיעה באפיתל מכתשי, בנוסף לתגובות הביוכימיות של תאי ^11-14. למרות ההתמקדות כאן היא בראש ובראשונה על התגובה של תאי ריאה לעיוות מכאנית, מסלולים הנגרמים על ידי mechanotransduction לשחק תפקיד מפתח בbasפונקצית IC של רקמות רבות בגוף האדם, ובכלל זה הסדרה טון של כלי דם ¹⁵ והפיתוח של צלחת צמיחת ^16.

ההתעניינות הגוברת בmechanotransduction הביאה בפיתוח של מכשירים רבים ליישום של עומסים מכאניים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית לתאים ורקמות בתרבית. בפרט, מכשירי החלת מתח מתיחה, אשר הוא צורה נפוצה של העמסה מכאנית המנוסים על ידי רקמות, פופולריים ^11,17-19. עם זאת, רב של ההתקנים הזמינים נועדו גם כbioreactor עבור יישומי הנדסת רקמות או לא תורם להדמיה בזמן אמת עם מתיחה. ככזה, יש צורך בפיתוח כלים ושיטות שיכולים לדמיין תאים ורקמות במתח כדי להקל על החקירה של מסלולים של mechanotransduction.

במסמך זה, מכשיר מתיחה מכאני במטוס תוכנן ופרוטוקולים שפותחו כדי להחיל מ 'צורות ultiple של מתח לרקמות ותאים ומאפשרים הדמיה של התגובות ביוכימיות ומכאניות בזמן אמת (איור 1 א-ד). המכשיר משתמש בשישה מלחציים מחולק באופן שווה המסודרים circumferentially לתפוס קרום גמיש וליישם, התנפחות עד רדיאלי במטוס לכ -20% (איור 1). מכשיר actuating יכול להיות ממוקם בתרבית תאי חממה לתקופה ארוכה של זמן, ואילו מנוע (איור 1 ג) ממוקם מחוץ לחממה ונשלט על ידי תוכנת קניינית הניתנת על ידי ספק המנוע. המנוע מחובר לנהג ליניארי, אשר מסתובב מצלמת פנימית, נהיגה שישה מלחציים האלונקה אחידה במתח והרפיה.

בנוסף למכשיר המכני, קרומים גמישים מותאמים אישית נוצרו מקרומים מוכנים תרבית תאים זמינים מסחרית לשימוש במערכת המכנית. קירות ואז עגולים (בקוטר של כ28 מ"מ) נעשה ומצורף בקרום גמיש, כך שתאים יכולים להיות מתורבת רק באזור זה של פרופיל מתח מתואר היטב. על מנת לקבוע אם המיקום של הקרומים האלה בתוך המכשיר actuating יספק מתח אחיד ואיזוטרופי במרכז של הקרום גמיש, ניתוח אלמנטים סופי נערך באמצעות תוכנה זמינה באופן מסחרי (איור 1E-F). הקרום גמיש היה דגם עם תנאי גבול סימטריים וניצול כל האלמנטים מרובע לרשת. הטבעות קונצנטריות ראו בעלילת קווי המתאר של זן עיקרי מרבי שמוצגת באיור 1F לציין את חלוקת איזוטרופיים של הזן.

המתח שעבר על הקרום נמדד על ידי הקלטת תמונות של סימונים באמצעות טעינה (איור 2). איור 2 ד מראה כי מתח הקרום הממוצע שנמדד בכיוונים רדיאלי והציריים היה כ יניאריביחס למנוע מיושם סופר עד מתח ליניארי מרבי של 20%. לא היה הבדל משמעותי בין רמות המתח נמדדו במהלך התנפחות בהשוואה לאלו שנמדדו במהלך הנסיגה חזרה למצב המנוחה. בשלב הבא, התזוזה של תאים אנושיים אפיתל הסימפונות (16HBE) והגרעינים שלהם בתרבית על הקרום גמיש המותאם אישית נמדדה. גרעינים (DAPI) שכותרתו fluorescently של תאי 16HBE היו צילמו באמצעות מטרת 20X תחת מיקרוסקופ confocal, ואילו עקירת תא שלמה נמדדה עם תמונות בניגוד השלב נרשמו עם מיקרוסקופ דיגיטלי. כפי שניתן לראות באיור 3, המתח שנמדד על ידי עקירה של גרעינים היה דומה לזה שנמדד על ידי עקירה של סימונים על הקרום, עד 20% מתח ליניארי ~. זו מאשרת כי המאמץ ליישם את הקרומים הועבר לתאים חסיד. הפרוטוקולים מתארים את השימוש במכשיר המותאם אישית על מיקרוסקופ מסורתי וmicroscop כוח אטומידואר מסופק בשלבים הבאים.

Protocol

1. בנייה של ממברנה עם קירות ובכן לשמירת תא תרבות מדיה (ראה איור 1D למוצר הסופי)

1. באמצעות polydimethylsiloxane גיליונות (PDMS) מצופים בקולגן אני, לחתוך את קווי המתאר של הקרום גמיש עם אזמל או למות.
2. מניחים כל קרום בצלחת פטרי 60 מ"מ לאחסון.
3. יצירת קירות:
   1. מערבבים PDMS ב- 10: 1 יחס משקל של אלסטומר אלסטומר לB (סוכן ריפוי).
   2. יוצקים 5 מיליליטר של מעורב באופן מלא PDMS לתוך צינורות 50 מיליליטר.
   3. מניחים צינורות 50 מיליליטר עם PDMS דפוקה אופקי בתנור הכלאה.
   4. השתמש בפונקצית הרוטור למעייל הקירות הפנימיים של הצינורות ב 8 סל"ד בזמן הריפוי. ב RT, PDMS יהיה נרפא לחלוטין ב 2 ימים.
   5. הסר את PDMS מהצינור במכסת מנוע תרבית תאים סטריליים.
   6. באמצעות סכין גילוח חדש, לחלק את הגליל של PDMS לסעיפים 4 מ"מ הגובה.
   7. מניחים את החלקים, שישמשו כwa הקרוםLLS, למכל צלחת פטרי מבלי לאפשר הקירות כדי להיות מקומטים.
4. בחר ומרכז קיר אחד של PDMS על קרום אחד, תוך שמירה על שתי בצלחת פטרי.
5. מניח בעדינות PDMS דפוקה (10: 1 יחס) על ההיקף החיצוני של הקיר כדי לשמש כדבק. למנוע היווצרות פערים בין הקיר והקרום שכן הוא שם כדי לשמור על נוזלים.
6. מניחים כל צלחת פטרי המכיל קרום הושלם ומכוסה בתנור על 70 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות כדי לרפא.

2. מתאם של מוטוריים סיבובים עם קלאמפ תזוזה או רדיאלי צמיחה לכיול (איור 2)

1. הפעל את תוכנת שליטה המוטורית.
2. לעקור את מהדק של המכשיר באמצעות ההגדרה הידנית בתוכנת המנוע.
3. מדוד את המרחק ולהקליט את עמדת הספירה המוטורית בין מנוגדים מלחציים בשתי עקירת המינימום ומקסימום של מהדק.
4. לחשב את אחוז השינוי בדistance בין מלחציים כפונקציה של ספירת המנוע (~ 0-75k ספירה). זה יציין את מתח הפוטנציאל המרבי הושג בקרום.

3. יישום למתוח על קו סלולארי עכבר ריאות אפיתל (MLE12)

1. MLE12 תאי זרע ב- 2.5 מיליון תאים בקרום גמיש (שלב 1) לכל גם להיות מחוברים בתוך יומיים. צפיפות הזריעה עשויה להשתנות לתאים מסוגים שונים.
2. ודא המפעיל המכני הוא במצב רגוע לחלוטין.
   1. הסר תקשורת תרבות תא.
   2. באמצעות 1.5 מ"מ אגרופים ביופסיה, אגרוף שני חורים בכל אחת מששת המהדק (ראה איור 1D) כרטיסיות של הקרום. המיקום הרדיאלי של החורים קובע את כמות מראש מתח חוויות קרום בתחילה. אגרוף החורים ברדיוס של 20.5 מ"מ בכרטיסיות הקרום אם לא מראש מתח הוא רצוי.
   3. מקם את הקרום על האלונקה עם החורים המנוקבים הזדנבות עם הסיכות בתוך מלחציים.הנח מהדק עליון במקום. להדק את הברגים באחד צדדים זמן לסירוגין.
   4. הוסף 1 מיליליטר תרבות תקשורת הסלולרי.
3. מניחים את המכשיר על הבמה מיקרוסקופ מרכוז אמצע הקרום עם נתיב האור.
4. השתמש קלטת או מגנטים (אם אפשר) כדי לתקן את המכשיר לבמה. ברגע קבוע, לשלוט (במקביל לממברנה) במטוס ו( Z-כיוון) אנכי של המכשיר המכני עם בקר השלב של המיקרוסקופ.
5. החל למתוח עם התוכנה המסופקת על ידי היצרן על ידי שליטה על המצב ומהירות סיבוב מנוע ²⁰ באופן ידני.

4. מדידה של מינים חמצן מגיב מיטוכונדריאלי (ROS)

1. ברגע שתאים ומחוברות, להוסיף 1-2 מיליליטר של RT DMEM עם מחוון המיטוכונדריה סופראוקסיד (5 מיקרומטר ריכוז סופי) ישירות על התאים.
2. דגירה של 10 דקות על 37 מעלות צלזיוס.
3. לשטוף את תאים בעדינות שלוש פעמים עם חיץ חיממו באמבט מים ל37 מעלות צלזיוס.
4. מייד למקם את הקרום גמיש על האלונקה (שלב 2.2) כבר במקום תחת מיקרוסקופ confocal זקוף.
5. הוסף 1 מיליליטר של DMEM עם פנול-אדום בינוני חופשי ו -25 מ"מ של HEPES.
6. להגדיר מסנני עירור / פליטה ל510 / 580 ננומטר.
7. שדות מרובים תמונה כל 15 דקות כדי ליצור את קורס הזמן הרצוי של ייצור סופראוקסיד המיטוכונדריה.
8. מתמונות שנתפסו, עוצמת הקרינה שיא היסטוגרמות בכל מרווח זמן באמצעות תוכנה מסוגלת לכמת את עוצמת הקרינה.

5. יישום של מתיחה וכוח האטומי מיקרוסקופית (AFM)

הערה: שלבים אלה ניתנים לAFM ספציפי ושילוב מיקרוסקופ אופטי (איור 4 וחומרי רשימה).

1. הכן את AFM לניסוי.
   1. להגדיל את הגובה של ראש AFM לעמדתו המרבית בZ-הכיוון.
   2. שים מרחיבי על הרגליים של AFM ללהרים את המטוס שבו אנשי קשר שלוחה AFM המדגם. הדגימה וראש AFM צריך להיות הרים כדי להתאים את הגובה של המכשיר המכני.
2. הכן את מיקרוסקופ האופטי (אם קיימים).
   1. הסר את צלחת סורק AFM. הסר את המטרה הרצויה.
   2. הוסף spacer למטרה. הגובה של spacer יהיה תלוי במטרה והגדרת AFM הספציפי, אבל זה הכרחי אם הדמיה אופטית היא רצויה מאז מטוס תצפית יהיה שינוי בכיוון Z-ידי סכום השווה לאלונקה וגובה מתאם (איור 5A). שים לב שAFM בדרך כלל מספק הדמיה בהגדלה נמוכה מנתיב אופטי מעל המכשיר.
   3. הר בחזרה מטרה הרצויה במיקומו. הנח את הסורק בחזרה לAFM.
   4. הפעל את תוכנת AFM. התחל כל מקורות האור הנדרשים כולל מקור האור עבור מדידות הקרינה.
   5. הר שבב עם קרן שלוחה שמתאים למידות הרצויות. 200 PN / נוקשות ננומטר או פחות עדיפה בעת מדידת מודולוס האלסטיות של תאי חיים.
   6. יישר את הלייזר ולכייל את נוקשות שלוחה פי ההצעות של היצרן על coverslip זכוכית רכוב על המכשיר.
3. הכן קרום כמו בשלב 1, אבל עם השינויים הבאים.
   1. מייד לפני ההרכבה הקרום למכשיר המתיחה, לחתוך את הקירות של כ 1 מ"מ הגובה. זה מונע את ההתערבות חוותה בין קירות הקרום ותא העומס.
   2. הר הקרום במכשיר המכני כפי שתואר 3.2.1-3.2.3.
   3. הסר תקשורת תרבית תאים, כדי למנוע נזק לסורק AFM במקרה של דליפה.
   4. זוג המכשיר עם מתאם (איור 5 א). מניחים את המכשיר המכני עם המתאם בסורק.
   5. למתוח את הקרום לרמת מתח מתיחה הרצויה.
4. ננו-כניסה של תאים נמתחו.
   1. הוספת נפח (<0.5 מיליליטר) מוגבל של תקשורת בתאים, כדי למנוע סורק AFM או נזק מיקרוסקופ בשל דליפה.
   2. לעסוק קרן שלוחה עם הקרום.
   3. בצע את הפרוטוקול של מכשיר AFM המסוים כדי לסרוק תחומי העניין.

תוצאות

מינים חמצן מגיבים ודפורמציה

מחקרים קודמים הראו עלייה במינים תגובתי חמצן (ROS) בדרכי נשימה ותאי האפיתל מכתשי בתגובה למחזורית מתיחה ^21. מיני חמצן מגיבים כוללים מולקולות ורדיקלים חופשיים הנגזרים מחמצן מולקולרי עם תגובתיות...

Discussion

מכשיר ייחודי להדמיה תא חי במהלך מתיחה מכאנית פותח; והמכשיר הזה היה בשימוש בפרוטוקול ללמוד mechanobiology תאי אפיתל ריאות. במחקרים ראשוניים, נמצא כי קטע שנערך אחת עורר את הייצור של סופראוקסיד המיטוכונדריה בתאי אפיתל הסימפונות. בנוסף, הוא הוכיח כי הרמות גבוהות של לחץ מכאני גר...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
SmartMotor NEMA 34: 3400 Series	MOOG Animatics	SM3416D	Integrated motor, controller, amplifier, encoder and communications bus
Flexcell Membrane (Collagen I coated)	Flexcell International Corp	SM2-1010C	3.5" x 5.25" x 0.020"
Sylgard 184	Dow Corning Corporation		10:1
Hoechst 33342	Sigma-Aldrich	H1399	DAPI stain
MitoSOX	Sigma-Aldrich	M36008
Tiron	Sigma-Aldrich	D7389	mitochondrial superoxide label
DMEM			superoxide inhibitor
FBS
HEPES
50 ml tubes	Fisher Scientific	06-443-19	Any centriguge tube can be used to create an area for imaging.
Hybridization oven	Bellco Glass
MLE12 Cells	ATCC	CRL-2110	Mouse Lung Epithelial Cells
16HBE cells	ATCC	CRL-2741	Human Bronchial Epithelial Cells
AFM Indentation Experiments
Cantilever Beams for Nano-indentation	Budget Sensors	Si-Ni30
AFM	Asylum Research	MFP3D
Olympus microscope	Olympus	IX-71	Inverted microscope with 20X and 40X objectives.
AFM Leg Extenders	Asylum Research	Not available	AFM microscope
Finite Element Analyses
ABAQUS	Simulia	6.12
Software
ImageJ	NIH
Microscopes
Digital microscope	Life Technologies	EVOS XL Core	Initially a self standing company, now owned by Life Technologies.
Confocal microscope	Zeiss	LSM 710	2-photon upright microscope