기계 스트레치 동안 라이브 세포 이미징

요약

A novel imaging protocol was developed using a custom motor-driven mechanical actuator to allow the measurement of real time responses to mechanical strain in live cells. Relevant to mechanobiology, the system can apply strains up to 20% while allowing near real-time imaging with confocal or atomic force microscopy.

초록

There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in their capability for measuring responses in real time in live cells or viable tissue. A protocol was developed with the use of a cell actuator to distend live cells grown on or tissues attached to an elastic substrate while imaging with confocal and atomic force microscopy (AFM). Preliminary studies show that tonic stretching of human bronchial epithelial cells caused a significant increase in the production of mitochondrial superoxide. Moreover, using this protocol, alveolar epithelial cells were stretched and imaged, which showed direct damage to the epithelial cells by overdistention simulating one form of lung injury in vitro. A protocol to conduct AFM nano-indentation on stretched cells is also provided.

서문

세포는 여러 조직에서의 기계적 하중을 실시하고,이 기계적 자극 유전자 발현, 성장 인자, 사이토 카인, 또는 세포 외 기질의 재 형성의 방출 패턴의 변화를 촉진하고 세포 골격 ^1-4 밝혀졌다. 기계적 자극에서 형질 세포 내 신호는 mechanotransduction ^5-7의 과정을 통해 발생한다. 호흡계에서, mechanotransduction의 일 결과는, 반응성 산소 종 (ROS) 환상 인장 변형의 존재 폐 상피 세포에서 ^8,9 및 전 염증성 사이토 카인 ^(10)의 증가이다. 강력한 증거는 과도한 인장력이 ^11-14 세포의 생화학 적 반응에 더하여, 폐포 상피 부상을 직접 유도 것을 시사한다. 포커스 여기서 기계적 변형에 폐 세포의 반응에 주로이지만 mechanotransduction 의해 유도 경로는 BAS에 중요한 역할혈관 음 ^(15)의 조정 · 성장판 ^(16)의 개발을 포함하여 인체의 여러 조직의 IC 기능.

mechanotransduction에 대한 관심이 증가 배양 세포 및 조직 생리 학적으로 중요한 기계적 하중의인가에 대한 여러 장치의 발전을 가져왔다. 특히, 조직 경험 기계적 하중의 일반적인 형태 인 인장 변형을, 적용 장치 ^11,17-19 인기 있습니다. 그러나, 사용 가능한 장치의 대부분은 어느 조직 공학 응용 프로그램을위한 생물 반응기로 설계 또는 스트레칭 실시간 영상에 도움이 아니다. 이와 같이, mechanotransduction의 경로의 조사를 용이하게하기 위해 장력 세포와 조직을 시각화 도구와 방법의 개발이 요구된다.

여기서, 면내 기계적 연신 장치를 설계하고, 프로토콜은 m을 적용하기 위해 개발되었다ultiple 조직에 변형의 형태와 세포를 실시간으로 (그림 1A-D)의 생화학 적 및 기계적 응답의 영상을 허용하면서. 장치는가요 성 멤브레인을 잡고 약 20 % (도 1b)에 면내 방사형 팽창 위로 적용 원주 등 간격 배치 여섯 클램프를 사용한다. 모터 (도 1C)는 인큐베이터의 외측에 배치 된 모터 공급자 독점 소프트웨어에 의해 제어되는 동안 구동 장치는 장기간 세포 배양 용 인큐베이터에 배치 될 수있다. 모터는 긴장과 이완 균일 여섯 들것 클램프 구동, 내부 캠을 회전 선형 드라이버에 접속된다.

기계적인 장치 이외에, 맞춤형가요 성 멤브레인은 기계 시스템에 사용되는 시판되는 세포 배양 준비 막으로부터 만들어졌다. 약의 직경 그리고 원형 벽 (28mm)를 만들어 세포 만 잘 설명 변형 프로파일이 지역에서 배양 할 수 있도록 유연한 막에 부착 하였다. 구동 장치 내에서 이러한 막의 배치는가요 성 멤브레인의 중앙에 균일하고 등방 변형을 제공 할 수 있는지 여부를 확인하기 위하여, 유한 요소 분석은 시판되는 소프트웨어 (도 1E-F)를 수행 하였다. 플렉서블 멤브레인은 대칭 경계 조건으로 메시에 대한 모든 사변형 요소를 이용하여 모델링되었다. 그림 1 층에 표시된 최대 주 변형률의 윤곽 플롯에서 볼 동심 링은 변형의 등방성 분포를 나타냅니다.

막에 의해 경험 한 스트레인은 하중 (도 2)를 통해 표시의 화상을 기록하여 측정 하였다.도 2d는 반경 방향 및 축 방향으로 측정 된 평균 막 응력은 대략 선형임을 나타낸다적용된 모터에 대하여 20 %의 최대 선형 변형까지 카운트한다. 다시 정지 위치로 후퇴 동안 측정과 비교 팽창 동안 측정 균주 수준 사이에는 유의 한 차이가 없었다. 다음으로,가요 ​​성 멤브레인에 정의 배양 인간 기관지 상피 세포 (16HBE) 및 그 핵의 변위를 측정 하였다. 전 세포 변위 디지털 현미경 기록 위상차 이미지를 측정 하였다 반면 16HBE 세포의 형광 표지 (DAPI) 핵은, 공 초점 현미경으로 20 배의 대물 렌즈를 사용하여 영상화되었다. 도 3에서 보듯이, 핵의 변위에 의해 측정 된 변형은 최대 ~ 20 %의 선형 변형에 막 마크의 변위에 의해 측정 된 것과 유사 하였다. 이는 멤브레인에 적용 균주 부착 세포에 전달되었음을 확인한다. 전통적인 현미경에 정의 디바이스의 사용을 기술하는 프로토콜 및 원자 힘 microscopE는 다음과 같이 제공된다.

프로토콜

보존 셀의 문화 매체에 대한 음의 벽 (최종 제품에 대한 그림 1D 참조) 멤브레인의 1. 건설

1. 콜라겐 I로 코팅 된 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 시트를 사용하여, 메스 나 다이를가요 성 멤브레인의 윤곽을 잘랐다.
2. 저장을위한 60mm 페트리 접시에 각각의 막 놓습니다.
3. 벽의 창조 :
   1. B (경화제) 엘라스토머 엘라스토머의 중량비는 1 : 10 PDMS 섞는다.
   2. 50 ㎖ 튜브에 완전히 혼합 된 PDMS 5 mL를 따르십시오.
   3. 수평 하이브리드 오븐에서 경화 PDMS 50 ml의 튜브를 놓습니다.
   4. 경화 시간 동안 8 rpm에서 코팅 튜브의 내벽을 로터 함수를 사용한다. 실온에서, PDMS는 완전히 2 일 내에 완치됩니다.
   5. 무균 세포 배양 후드에 튜브에서 PDMS를 제거합니다.
   6. 새로운 면도날을 사용하여, 섹션의 높이에 대한 4mm의 PDMS 실린더 분할.
   7. 막 WA 될 것입니다 섹션을 배치LLS, 수없이 페트리 접시 용기에 벽이 접혔 될 수 있습니다.
4. 페트리 접시에 두 가지를 유지하면서 하나의 막에 PDMS의 한 벽을 선택하고 센터.
5. 접착제로 사용하는 벽의 바깥 둘레에 : (1 비율 10) 조심스럽게 경화 PDMS를 놓습니다. 이 액체를 유지하기 위해 존재하기 때문에 벽과 막 사이의 간격의 형성을 방지합니다.
6. 각 페트리 접시 완성 된 멤브레인을 포함하고 치료하는 24 시간 동안 70 ℃의 오븐에서 덮여를 놓습니다.

교정 용 클램프 변위 또는 레이디 얼 성장 (그림 2)와 모터의 회전 2. 상관 관계

1. 모터를 제어하는​​ 소프트웨어를 시작합니다.
2. 모터 소프트웨어의 수동 설정을 사용하여 장치의 클램프를 변위.
3. 거리를 측정하고 클램프의 최소 및 최대 변위 모두에서 클램프를 반대 사이의 모터 카운트 위치를 기록한다.
4. D의 변화율을 계산모터 카운트 (~ 0-75k 개수)의 함수로서 클램프 사이 istance. 이 막에 달성의 최대 잠재적 인 변형을 나타냅니다.

마우스 폐 상피 세포주에 스트레치 3. 응용 프로그램 (MLE12)

1. 물론 당 유연한 막에 250 만 세포 (1 단계)에서 종자 MLE12 세포는 이틀 컨 플루 언트합니다. 파종 밀도는 다른 세포 유형에 따라 다를 수 있습니다.
2. 기계 액추에이터는 완전히 편안한 위치에 있는지 확인합니다.
   1. 세포 배양 용지를 제거합니다.
   2. 여섯 클램프 각각의 두 펀치 구멍, 1.5 mm에게 생검 펀치를 사용하여 멤브레인의 탭 (도 1d 참조). 구멍의 반경 방향 위치는 멤브레인 경험 초기 사전 장력의 양을 결정한다. 어떠한 미리 장력이 요구되지 않은 경우 멤브레인 탭 20.5 mm의 반경 펀치 구멍.
   3. 펀치 구멍이 클램프 내에서 핀을 일렬로 들것에 막을 놓습니다.장소에 최고 클램프를 놓습니다. 나사 한 번 교류 측면에서 하나를 조입니다.
   4. 1 ml의 세포 배양 배지를 추가합니다.
3. 빛의 경로와 멤브레인의 중앙을 중심으로 현미경의 무대 장치를 놓습니다.
4. 무대에 장치를 고정하는 테이프 또는 자석 (가능한 경우)를 사용합니다. 일단 고정, 현미경의 스테이지 제어기와 기계 장치의 면내 (막으로 평행 한 방향) 및 수직 (Z 방향)을 제어한다.
5. 수동 회전 모터 ^(20)의 위치 및 속도를 제어함으로써, 제조사에 의해 제공된 소프트웨어를 사용하여 연신을 적용한다.

미토콘드리아 활성 산소 종의 4. 측정 (ROS)

1. 세포가 컨 플루 언트되면, 직접 세포에 미토콘드리아 초과 산화물 표시 등 (5 μm의 최종 농도)와 RT DMEM의 1-2 ml를 추가합니다.
2. 37 ℃에서 10 분 동안 품어.
3. 워시 세포는 부드럽게 버퍼와 세 번에 물을 욕조에 따뜻하게37 ° C.
4. 즉시 똑바로 공 초점 현미경으로 이미 자리에 들것 (단계 2.2)에 유연한 막 놓습니다.
5. 페놀 레드 무료 매체 HEPES 25 mm의 DMEM의 1 ML을 추가합니다.
6. 580분의 510 nm의 여기 / 방출 필터를 설정합니다.
7. 이미지 여러 필드는 매 15 분 미토콘드리아 슈퍼 옥사이드 생산의 원하는 시간 코스를 만들 수 있습니다.
8. 캡처 된 이미지에서, 기록 형광 강도는 형광 강도를 정량화 가능한 소프트웨어를 사용하여 각 시간 간격 히스토그램.

스트레칭과 원자 힘 현미경 (5) 응용 프로그램 (AFM)

참고 :이 단계는 특정 원자 현미경과 광학 현미경 조합 (그림 4 및 재료 목록) 제공됩니다.

1. 실험을위한 AFM을 준비합니다.
   1. Z 방향의 최대 위치로 AFM 헤드의 높이를 증가시킨다.
   2. AFM의 다리에 익스텐더를 넣어비행기를 해제하는 AFM은 캔틸레버 연락처 샘플을에서. 시험편 AFM 헤드는 기계 장치의 높이를 수용하도록 해제 될 필요가있다.
2. (사용 가능한 경우) 광학 현미경을 준비합니다.
   1. AFM 스캐너 플레이트를 제거합니다. 원하는 목표를 제거합니다.
   2. 목적에 스페이서를 추가합니다. 스페이서의 높이는 대물과 특정 AFM 셋업에 달려 있지만, 관측 평면 들것 및 어댑터의 높이 (도 동일한 양만큼 z- 방향으로 이동되기 때문에 광학 이미징이 요구되는 경우에 필요하다 5A). AFM은 일반적으로 상기 장치 광로 저배율 이미징을 제공합니다.
   3. 그 위치에서 원하는 목표를 다시 마운트합니다. AFM에 다시 스캐너를 설치.
   4. AFM 소프트웨어를 시작합니다. 형광 측정을위한 광원을 포함한 모든 필요한 광원을 시작합니다.
   5. 캔틸레버 빔 칩을 탑재하는원하는 측정에 적합합니다. 생균의 탄성률을 측정 할 때 200 PN / nm 이하의 강성이 바람직하다.
   6. 레이저를 맞추고 장치에 장착 된 유리 커버 슬립에 제조업체의 제안에 따라 캔틸레버의 강성을 보정.
3. 단계 1에서와 같이 막을 제조되지만 다음과 변형.
   1. 즉시 스트레칭 장치에 막을 설치하기 전에, 높이 약 1mm로 벽을 잘라. 이는 멤브레인 벽과로드 셀 간의 간섭 발생을 방지한다.
   2. 3.2.1-3.2.3 설명 된대로 기계 장치에 막을 마운트합니다.
   3. 유출시 AFM 스캐너의 손상을 방지하기 위하여 세포 배양 배지를 제거한다.
   4. 커플 어댑터 (도 5a)와 장치. 스캐너의 어댑터와 기계 장치를 놓습니다.
   5. 원하는 인장 변형 레벨 막을 스트레칭.
4. 신장 세포의 나노 압입.
   1. 때문에 유출에 AFM 스캐너 또는 현미경 손상을 방지하기 위해 세포에서 미디어의 제한 (<0.5 ml)에 볼륨을 추가합니다.
   2. 멤브레인 외팔보를 작동.
   3. 관심 분야를 스캔하고 특정 AFM 장치의 프로토콜을 따르십시오.

결과

활성 산소 종 및 변형

이전의 연구는 환상 스트레칭 ^21에 응답기도 및 폐포 상피 세포에서 반응성 산소 종 (ROS)의 증가를 보여 주었다. 활성 산소는 분자와 지질, 단백질, 다당류, 핵산 ^22-24 높은 반응성 산소 분자에서 파생 된 활성 산소를 포함한다. ROS는 일반적인 세포 내 이온 채널의 기능을 조절하는 신호 단백질 키나제 / 포스파타제 활성 및 유전자 ?...

토론

기계적 스트레칭 동안 라이브 세포 이미징의 고유 장치가 개발되었다; 그리고이 장치는 폐 상피 세포 제어 공학을 연구 프로토콜에서 사용되었다. 예비 연구에서, 단일 개최 스트레칭 기관지 상피 세포에서 미토콘드리아 초과 산화물의 생산을 자극 한 것으로 나타났습니다. 또한, 기계적인 변형의 수준 증가는 폐포 상피 세포 단층의 무결성에 대한 직접적인 손상을 야기하는 것이 입증되었다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
SmartMotor NEMA 34: 3400 Series	MOOG Animatics	SM3416D	Integrated motor, controller, amplifier, encoder and communications bus
Flexcell Membrane (Collagen I coated)	Flexcell International Corp	SM2-1010C	3.5" x 5.25" x 0.020"
Sylgard 184	Dow Corning Corporation		10:1
Hoechst 33342	Sigma-Aldrich	H1399	DAPI stain
MitoSOX	Sigma-Aldrich	M36008
Tiron	Sigma-Aldrich	D7389	mitochondrial superoxide label
DMEM			superoxide inhibitor
FBS
HEPES
50 ml tubes	Fisher Scientific	06-443-19	Any centriguge tube can be used to create an area for imaging.
Hybridization oven	Bellco Glass
MLE12 Cells	ATCC	CRL-2110	Mouse Lung Epithelial Cells
16HBE cells	ATCC	CRL-2741	Human Bronchial Epithelial Cells
AFM Indentation Experiments
Cantilever Beams for Nano-indentation	Budget Sensors	Si-Ni30
AFM	Asylum Research	MFP3D
Olympus microscope	Olympus	IX-71	Inverted microscope with 20X and 40X objectives.
AFM Leg Extenders	Asylum Research	Not available	AFM microscope
Finite Element Analyses
ABAQUS	Simulia	6.12
Software
ImageJ	NIH
Microscopes
Digital microscope	Life Technologies	EVOS XL Core	Initially a self standing company, now owned by Life Technologies.
Confocal microscope	Zeiss	LSM 710	2-photon upright microscope