Imágenes de células vivas durante el estiramiento mecánico

Resumen

A novel imaging protocol was developed using a custom motor-driven mechanical actuator to allow the measurement of real time responses to mechanical strain in live cells. Relevant to mechanobiology, the system can apply strains up to 20% while allowing near real-time imaging with confocal or atomic force microscopy.

Resumen

There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in their capability for measuring responses in real time in live cells or viable tissue. A protocol was developed with the use of a cell actuator to distend live cells grown on or tissues attached to an elastic substrate while imaging with confocal and atomic force microscopy (AFM). Preliminary studies show that tonic stretching of human bronchial epithelial cells caused a significant increase in the production of mitochondrial superoxide. Moreover, using this protocol, alveolar epithelial cells were stretched and imaged, which showed direct damage to the epithelial cells by overdistention simulating one form of lung injury in vitro. A protocol to conduct AFM nano-indentation on stretched cells is also provided.

Introducción

Las células se someten a cargas mecánicas en muchos tejidos, y esta estimulación mecánica se ha demostrado para promover cambios en los patrones de la expresión génica, la liberación de factores de crecimiento, citoquinas, o remodelación de la matriz extracelular y el citoesqueleto ^1-4. Las señales intracelulares transducidas a partir de tales estímulos mecánicos se producen a través del proceso de mechanotransduction ^5-7. En el sistema respiratorio, uno de los resultados de mechanotransduction es el aumento de especies reactivas de oxígeno (ROS) ^8,9 y citoquinas pro-inflamatorias ¹⁰ en las células epiteliales pulmonares en la presencia de deformación por tracción cíclica. Una fuerte evidencia también sugiere que la deformación por tracción excesiva conduce a dirigir lesión en el epitelio alveolar, además de las respuestas bioquímicas de las células ^11-14. Aunque el enfoque aquí es principalmente sobre la respuesta de las células pulmonares a la deformación mecánica, las vías inducidas por mechanotransduction juegan un papel clave en los basic función de muchos tejidos en el cuerpo humano, incluyendo la regulación del tono vascular ¹⁵ y el desarrollo de la placa de crecimiento ^16.

El creciente interés en mechanotransduction se ha traducido en el desarrollo de numerosos dispositivos para la aplicación de cargas mecánicas fisiológicamente relevantes a las células cultivadas y el tejido. En particular, los dispositivos que aplican una tensión de tracción, que es una forma común de la carga mecánica experimentada por el tejido, son populares ^11,17-19. Sin embargo, muchos de los dispositivos disponibles están diseñados ya sea como un biorreactor para aplicaciones de ingeniería de tejidos o no son propicias para la formación de imágenes en tiempo real con estiramiento. Por lo tanto, existe la necesidad de desarrollar herramientas y métodos que se pueden visualizar las células y tejidos en tensión para facilitar la investigación de las vías de mecanotransducción.

En este documento, un dispositivo de estiramiento mecánico en el plano fue diseñado y protocolos fueron desarrollados para aplicar mformas ultiple de la cepa a los tejidos y células, mientras que permiten imágenes de las respuestas bioquímicas y mecánicas en tiempo real (Figura 1A-D). El dispositivo utiliza seis pinzas uniformemente espaciadas dispuestas circunferencialmente para captar una membrana flexible y aplicar una, distensión radial en el plano a aproximadamente 20% (Figura 1B). El dispositivo de accionamiento puede ser colocado en una incubadora de cultivo celular durante un período prolongado de tiempo, mientras que el motor (Figura 1C) se coloca fuera de la incubadora y controlado por software propietario proporcionada por el proveedor del motor. El motor está conectado a un conductor lineal, que gira una leva interna, conduciendo las seis abrazaderas de camilla de manera uniforme en la tensión y la relajación.

Además del dispositivo mecánico, membranas flexibles personalizados se crean a partir de cultivo de células de las membranas disponibles comercialmente listos para ser utilizado en el sistema mecánico. Entonces paredes circulares (con un diámetro de aproximadamente28 mm) se hicieron y se une a la membrana flexible para que las células podrían ser cultivadas sólo en esta región del perfil de deformación bien descrito. Con el fin de determinar si la colocación de estas membranas dentro del dispositivo de accionamiento proporcionaría cepa uniforme e isotrópico en el centro de la membrana flexible, se realizó análisis de elementos finitos utilizando el software disponible comercialmente (Figura 1E-F). La membrana flexible se modeló con condiciones de contorno simétricas y utilizando todos los elementos cuadriláteros para la malla. Los anillos concéntricos visto en el gráfico de contorno de máxima deformación principal se muestra en la Figura 1F indican la distribución isotrópica de la cepa.

La tensión experimentada por la membrana se midió mediante la grabación de imágenes de marcas a través de la carga (Figura 2). La figura 2D muestra que la cepa promedio membrana medido en direcciones radiales y axiales era aproximadamente linealcon respecto al motor aplicado cuenta hasta una deformación máxima lineal de 20%. No hubo diferencia significativa entre los niveles de deformación medidos durante la distensión en comparación con los medidos durante la retracción de nuevo a la posición de reposo. A continuación, se midió el desplazamiento de las células humanas bronquiales epiteliales (16HBE) y sus núcleos cultivadas sobre la membrana de encargo flexible. Marcados con fluorescencia (DAPI) núcleos de las células 16HBE se obtuvieron imágenes utilizando un objetivo 20X en un microscopio confocal, mientras que el desplazamiento de célula entera se midió con imágenes de contraste de fase grabadas con un microscopio digital. Como se ve en la Figura 3, la cepa medido por el desplazamiento de los núcleos fue similar al medido por el desplazamiento de las marcas en la membrana, hasta ~ 20% de deformación lineal. Esto confirma que la deformación aplicada a las membranas se transmite a las células adherentes. Los protocolos que describen el uso del dispositivo de encargo en un microscopio tradicional y una fuerza atómica microscópicase se proporcionan en los siguientes pasos.

Protocolo

1. Construcción de membrana con paredes bien para Retención de Cultivo Celular Medios (ver Figura 1D para el producto final)

1. El uso de polidimetilsiloxano (PDMS) láminas revestidas con colágeno I, cortar el contorno de la membrana flexible con un bisturí o un troquel.
2. Coloque cada membrana en una placa de Petri de 60 mm para el almacenamiento.
3. Creación de paredes:
   1. Mezclar PDMS en una proporción de 10: 1 en peso de elastómero de A a elastómero B (endurecedor).
   2. Vierta 5 ml de PDMS completamente mezclados en tubos de 50 ml.
   3. Colocar 50 ml tubos con PDMS sin curar horizontalmente en un horno de hibridación.
   4. Utilice la función de rotor para revestir las paredes interiores de los tubos a 8 rpm durante el tiempo de curado. A TA, la PDMS se curarán completamente en 2 días.
   5. Retire los PDMS de tubo en una campana de cultivo celular estéril.
   6. Usando una nueva hoja de afeitar, particionar el cilindro de PDMS en secciones de 4 mm de altura.
   7. Coloque las secciones, las cuales servirán de wa membranaLLS, en un recipiente placa de Petri sin permitir que las paredes se conviertan arrugado.
4. Seleccionar y el centro de una pared de PDMS en una membrana, mientras que el mantenimiento de los dos en la placa de Petri.
5. Colocar suavemente PDMS sin curar (10: 1 ratio) en el perímetro exterior de la pared para ser utilizados como pegamento. Evitar la formación de huecos entre la pared y la membrana, ya que es allí para retener líquido.
6. Coloque cada placa de Petri que contiene la membrana completado y cubierto en un horno a 70 ° C durante 24 horas para curar.

2. Correlación de Rotaciones de motor con abrazadera Desplazamiento o Crecimiento radial de calibración (Figura 2)

1. Inicie el software de control del motor.
2. Plegar las abrazaderas del dispositivo utilizando la configuración manual en el software del motor.
3. Medir la distancia y registrar la posición de conteo del motor entre las abrazaderas opuestas tanto en el desplazamiento mínimo y máximo de las abrazaderas.
4. Calcular el porcentaje de cambio en el dIstance entre las abrazaderas como una función del recuento de motor (~ 0-75k recuentos). Esto indicará la cepa potencial máximo alcanzado en la membrana.

3. Aplicación de estiramiento en la línea celular epitelial de pulmón de ratón (MLE12)

1. Semilla MLE12 células en 2,5 millones de células en la membrana flexible (Paso 1) por pocillo a confluentes en dos días. La densidad de siembra puede variar para diferentes tipos de células.
2. Asegúrese de que el accionador mecánico está en una posición completamente relajada.
   1. Retire el medio de cultivo celular.
   2. El uso de 1,5 mm golpes de biopsia, sacador dos agujeros en cada uno de los seis abrazadera (véase la Figura 1D) lengüetas de la membrana. La colocación radial de los orificios determina la cantidad de pre-tensión las experiencias de membrana inicialmente. Perforar los agujeros en un radio de 20,5 mm en las fichas de membrana si no se desea pre-tensión.
   3. Coloque la membrana en la camilla con los agujeros perforados alineando con los pasadores dentro de las abrazaderas.Coloca los mejores abrazaderas en su lugar. Apriete los tornillos de uno a la vez alternando los lados.
   4. Añadir 1 ml de medio de cultivo celular.
3. Coloque el dispositivo en la platina del microscopio de centrado el centro de la membrana con la trayectoria de la luz.
4. Use cinta adhesiva o imanes (si es posible) para fijar el dispositivo a la etapa. Una vez fijo, controlar el en el plano (paralelo a la membrana) y vertical (dirección z) del dispositivo mecánico con el controlador de platina del microscopio.
5. Aplicar tramo con el software proporcionado por el fabricante por controlar manualmente la posición y la velocidad de rotación del motor ^20.

4. Medición de la mitocondriales especies reactivas del oxígeno (ROS)

1. Una vez que las células son confluentes, añadir 1-2 ml de DMEM RT con indicador de superóxido mitocondrial (5 mM concentración final) directamente sobre las células.
2. Incubar durante 10 minutos a 37 ° C.
3. Lavar las células suavemente tres veces con tampón calentado en un baño de agua para37 ° C.
4. Coloque inmediatamente la membrana flexible en la camilla (Paso 2.2) ya en el lugar con un microscopio confocal vertical.
5. Añadir 1 ml de DMEM con medio libre de rojo de fenol y 25 mM de HEPES.
6. Establecer filtros de excitación / emisión de 510/580 nm.
7. Imagen de varios campos de cada 15 min para crear el curso de tiempo deseado de la producción de superóxido mitocondrial.
8. A partir de las imágenes capturadas, la intensidad de fluorescencia registro histogramas en cada intervalo de tiempo utilizando un software capaz de cuantificar la intensidad de fluorescencia.

5. Aplicación de Estiramiento y Fuerza Atómica Microscopía (AFM)

NOTA: Estos pasos se proporcionan para un AFM específica y la combinación de microscopio óptico (Figura 4 y Lista de Materiales).

1. Preparar el AFM para el experimento.
   1. Aumentar la altura de la cabeza AFM a su posición máxima en la dirección z.
   2. Ponga extensores en las patas de la AFM alevantar el plano en el que AFM en voladizo en contacto con la muestra. El espécimen y la cabeza AFM necesita ser levantado para dar cabida a la altura del dispositivo mecánico.
2. Preparar el microscopio óptico (si está disponible).
   1. Retire la placa de escáner AFM. Retire el objetivo deseado.
   2. Añadir un espaciador para el objetivo. La altura del espaciador dependería de lo objetivo y lo AFM específica puesta a punto, pero es necesario si se desea imágenes ópticas desde plano de observación será cambio en la dirección z en una cantidad igual a la camilla y la altura del adaptador (Figura 5A). Tenga en cuenta que la AFM por lo general proporciona imágenes bajo aumento de un camino óptico por encima del dispositivo.
   3. Montar la parte trasera objetivo deseado en su ubicación. Coloque el escáner de nuevo en el AFM.
   4. Inicie el software de AFM. Iniciar todas las fuentes luminosas necesarias, como la fuente de luz para mediciones de fluorescencia.
   5. Montar un chip con una viga en voladizo quees apropiado para las mediciones deseadas. Se prefiere 200 pN / rigidez nm o menos cuando se mide el módulo de elasticidad de células vivas.
   6. Alinear el láser y calibrar la rigidez en voladizo de acuerdo con las sugerencias del fabricante sobre un cubreobjetos de vidrio montado en el dispositivo.
3. Preparar una membrana como en el Paso 1, pero con las siguientes modificaciones.
   1. Inmediatamente antes de montar la membrana en el dispositivo de estiramiento, cortar las paredes a aproximadamente 1 mm de altura. Esto evita la interferencia experimentada entre las paredes de la membrana y la célula de carga.
   2. Montar la membrana en el dispositivo mecánico tal como se describe 3.2.1-3.2.3.
   3. Retire el medio de cultivo de células para evitar daños en el escáner AFM en caso de un derrame.
   4. Pareja el dispositivo con un adaptador (Figura 5A). Coloque el dispositivo mecánico con el adaptador en el escáner.
   5. Estire la membrana al nivel de deformación a la tracción deseada.
4. Nano-sangría de células estirados.
   1. Añadir un (<0,5 ml) Volumen limitado de los medios en las células para evitar escáner AFM o daños microscopio debido a un derrame.
   2. Involucrar a la viga en voladizo con la membrana.
   3. Siga el protocolo del dispositivo de AFM en particular a analizar áreas de interés.

Resultados

Especies reactivas del oxígeno y Deformación

Estudios anteriores han demostrado aumentos en especies reactivas de oxígeno (ROS) en las vías respiratorias y las células epiteliales alveolares en respuesta al estiramiento cíclico ^21. Especies reactivas de oxígeno incluyen moléculas y radicales libres derivados del oxígeno molecular con alta reactividad a los lípidos, proteínas, polisacáridos, y ácidos nucleicos ^22-24. ROS servir como una señal intra...

Discusión

Un dispositivo único para imágenes de células vivas durante el estiramiento mecánico fue desarrollado; y este dispositivo se utilizó en un protocolo para estudiar mecanobiología células epiteliales de pulmón. En estudios preliminares, se encontró que un solo tramo celebrada estimuló la producción de superóxido mitocondrial en las células epiteliales bronquiales. Además, se demostró que el aumento de los niveles de tensión mecánica causaron daño directo a la integridad de una monocapa de células epitel...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
SmartMotor NEMA 34: 3400 Series	MOOG Animatics	SM3416D	Integrated motor, controller, amplifier, encoder and communications bus
Flexcell Membrane (Collagen I coated)	Flexcell International Corp	SM2-1010C	3.5" x 5.25" x 0.020"
Sylgard 184	Dow Corning Corporation		10:1
Hoechst 33342	Sigma-Aldrich	H1399	DAPI stain
MitoSOX	Sigma-Aldrich	M36008
Tiron	Sigma-Aldrich	D7389	mitochondrial superoxide label
DMEM			superoxide inhibitor
FBS
HEPES
50 ml tubes	Fisher Scientific	06-443-19	Any centriguge tube can be used to create an area for imaging.
Hybridization oven	Bellco Glass
MLE12 Cells	ATCC	CRL-2110	Mouse Lung Epithelial Cells
16HBE cells	ATCC	CRL-2741	Human Bronchial Epithelial Cells
AFM Indentation Experiments
Cantilever Beams for Nano-indentation	Budget Sensors	Si-Ni30
AFM	Asylum Research	MFP3D
Olympus microscope	Olympus	IX-71	Inverted microscope with 20X and 40X objectives.
AFM Leg Extenders	Asylum Research	Not available	AFM microscope
Finite Element Analyses
ABAQUS	Simulia	6.12
Software
ImageJ	NIH
Microscopes
Digital microscope	Life Technologies	EVOS XL Core	Initially a self standing company, now owned by Life Technologies.
Confocal microscope	Zeiss	LSM 710	2-photon upright microscope