Mekanik Stretch sırasında Canlı Hücre Görüntüleme

Özet

A novel imaging protocol was developed using a custom motor-driven mechanical actuator to allow the measurement of real time responses to mechanical strain in live cells. Relevant to mechanobiology, the system can apply strains up to 20% while allowing near real-time imaging with confocal or atomic force microscopy.

Özet

There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in their capability for measuring responses in real time in live cells or viable tissue. A protocol was developed with the use of a cell actuator to distend live cells grown on or tissues attached to an elastic substrate while imaging with confocal and atomic force microscopy (AFM). Preliminary studies show that tonic stretching of human bronchial epithelial cells caused a significant increase in the production of mitochondrial superoxide. Moreover, using this protocol, alveolar epithelial cells were stretched and imaged, which showed direct damage to the epithelial cells by overdistention simulating one form of lung injury in vitro. A protocol to conduct AFM nano-indentation on stretched cells is also provided.

Giriş

Hücreler, bir çok dokuda mekanik yüklere maruz kalır ve bu, mekanik uyarma gen ekspresyonu, büyüme faktörleri, sitokinler, ya da hücre dışı matrisin yeniden verildiği şekillerindeki değişiklikleri teşvik etmek ve ^1-4 hücre iskeletinin gösterilmiştir. Bu tür mekanik uyarıcılara karşı hücre içi sinyallere mechanotransduction ^5-7 işleminde meydana gelir. Solunum sisteminde, mechanotransduction bir sonucu, reaktif oksijen türlerinin (ROS), siklik bir çekme gücü mevcudiyetinde pulmoner epitel hücrelerinde ^8,9 ve pro-inflamatuar sitokinlerin ¹⁰ artıştır. Güçlü kanıtlar ayrıca aşırı gerilim soyu hücrelerinin ^11-14 biyokimyasal yanıtların yanı sıra, alveol epiteline yaralanması doğrudan yol açtığını göstermektedir. Odak Burada mekanik deformasyon akciğer hücrelerinin yanıtı esas olmasına rağmen, mechanotransduction neden yollar bas önemli bir rol oynardamar tonusu ¹⁵ düzenlenmesinde ve büyüme plağının ¹⁶ geliştirilmesi dahil olmak üzere insan vücudunda birçok dokuda, bir ic fonksiyonu.

mechanotransduction artan ilgi kültürlenmiş hücreler ve doku için fizyolojik olarak ilgili mekanik yüklerin uygulanması için çok sayıda cihazı geliştirilmesi ile sonuçlanmıştır. Özel olarak, doku tarafından yaşanan mekanik yüklenme ortak bir biçimi olan bir çekme gücü, uygulama tertibatının ^11,17-19 popülerdir. Ancak, mevcut cihazların çoğu ya doku mühendisliği uygulamaları için biyoreaktör olarak tasarımlanmış veya streç ile gerçek zamanlı görüntüleme için elverişli değildir. Bu nedenle, mechanotransduction arasında yolların araştırılmasını kolaylaştırmak için gerilim hücre ve dokuları görselleştirmek araçları ve yöntemlerinin geliştirilmesi için bir ihtiyaç vardır.

Burada, bir düzlem mekanik germe cihazı tasarlanmıştır ve protokoller m uygulamak için geliştirilmiştirultiple dokulara soyunun formları ve hücreler, gerçek zaman (Şekil 1A-D), biyokimyasal ve mekanik yanıtların görüntüleme imkan verir. Cihaz, esnek bir membran kavramak ve yaklaşık% 20 (Şekil 1B) bir düzlemsel radyal distansiyon yukarı uygulamak için çevresel olarak yerleştirilmiş olan eşit aralıklı kelepçeler kullanılmaktadır. Motor (Şekil 1C) inkübatör dışına yerleştirilmiş ve motor satıcı tarafından sunulan özel yazılım tarafından kontrol edilir ise çalıştırma tertibatı, uzun bir zaman süresi için bir hücre kültürü inkübatöründe yerleştirilebilir. kas gerginliği ve gevşeme eşit altı sedye kelepçeler sürüş bir iç cam döner lineer sürücü bağlanır.

Mekanik cihaz ek olarak, özel esnek zarların mekanik bir sistemde kullanılmak üzere ticari olarak temin edilebilen hücre kültürü hazır zarlarından oluşturulmuştur. Yaklaşık bir çapı olan, dairesel sonra duvar (28 mm) yapılmıştır ve hücreler, sadece iyi tarif edilen suş profili bu bölgede kültürlenebilir böylece esnek bir zar üzerine bağlanmıştır. Harekete geçirme cihazı içinde bu membranların yerleştirilmesi, esnek bir zarın merkezinde tek tip ve izotropik streynini sağlayabilir olup olmadığını belirlemek için, sonlu eleman analizi, ticari olarak temin edilebilen yazılımı (Şekil 1E-F) kullanılarak yapıldı. Esnek zar simetrik sınır koşulları ve örgü için tüm dörtgen elemanlar kullanan ile modellenmiştir. Şekil 1F gösterilen maksimum asal zorlanma kontur arsa görülen eş halkalar zorlanma izotropik dağılımını göstermektedir.

membran tarafından hissedilen gerginlik yükleme (Şekil 2) vasıtasıyla işaretler görüntüleri kaydedilerek sürekli olarak ölçüldü. Şekil 2B, radyal ve eksenel yönde ölçülen ortalama membran soyu yaklaşık doğrusal olduğunu göstermektediruygulanan motoru ile ilgili olarak% 20 oranında bir maksimum doğrusal suşu kadar sayar. Geri dinlenme pozisyonuna geri çekilmesi sırasında ölçülen kıyasla distansiyon sırasında ölçülen gerilme düzeyleri arasında anlamlı bir fark yoktu. Daha sonra, özel bir esnek zar üzerinde kültürlenmiş insan bronşiyal epitel hücreleri (16HBE) ve bunların çekirdeklerinin değiştirme ölçüldü. Bütün hücre yer değiştirmesi, bir dijital mikroskop ile kaydedilen faz kontrast görüntüleri ile ölçüldü ise 16HBE hücrelerinin floresan etiketli (DAPI) çekirdekler, konfokal mikroskop altında bir 20x objektif kullanılarak görüntülendi. Şekil 3'te görüldüğü gibi, çekirdek yer değiştirmesi ile ölçülen gerilme, up ~% 20 lineer streyn zar üzerinde işaretlerin yer değiştirmesi ile ölçülen benzer olmuştur. Bu membranların uygulanan gerilme yapışık hücrelere iletilen olduğunu doğrulamaktadır. Geleneksel mikroskop özel cihazın kullanımını anlatan protokolleri ve atomik kuvvet mikroskopE, aşağıdaki adımlarda verilmiştir.

Protokol

Tutma Hücre Kültürü Medya Kuyu Walls (nihai ürün için Şekil 1D bakınız) Membran 1. İnşaat

1. Kollajen I ile kaplanmış polidimetilsiloksan (PDMS) yaprak kullanarak, neşter veya bir kalıp esnek membran hatlarını kesti.
2. Depolanması için bir 60 mm Petri kabı, her membran yerleştirin.
3. Duvarların Oluşturma:
   1. B (sertleştirici) elastomer elastomer A: 1 ağırlık oranında, bir 10 PDMS karıştırın.
   2. 50 ml tüpler içine tam olarak karıştırılır PDMS 5 ml dökün.
   3. Yatay bir hibridizasyon fırında sertleşmemiş PDMS ile 50 ml'lik tüpler yerleştirin.
   4. Kür süresinde 8 rpm'de kaplamak için tüplerin iç duvarları rotor işlevini kullanın. Oda sıcaklığında, PDMS tam 2 gün içinde tedavi edilecek.
   5. Steril hücre kültürü kaputu tüpten PDMS çıkarın.
   6. Yeni bir jilet kullanarak, bölümlerde yüksekliği 4 mm içine PDMS silindir bölümlemek.
   7. Membran wa olarak görev yapacak bölümleri, koyunlls, izin vermeden bir Petri kabı kabına duvarları buruşuk olmak.
4. Petri kabındaki iki korurken, bir zar üzerinde PDMS bir duvar seçin ve merkezi.
5. Tutkal olarak kullanılmak üzere, duvarın dış çevre üzerinde (1 oranında 10) hafifçe sertleşmemiş PDMS yerleştirin. Bu sıvı tutmak için olmadığı duvar ve zar arasındaki boşluk oluşmasını önler.
6. Her petri çanağı tamamlanmış membran içeren ve tedavi etmek için 24 saat boyunca 70 ° C'de bir fırın içinde kapalı bir yer.

Kalibrasyon için Kelepçe Yerinden veya Radyal Büyüme (Şekil 2) Motorlu Münavebesindeki 2. Korelasyon

1. Motorun kontrol yazılımını başlatın.
2. Motor yazılımı manuel ayarını kullanarak cihazın kelepçeleri yerinden.
3. Mesafeyi ölçün ve kelepçeler minimum ve maksimum deplasman hem de kelepçeler karşıt arasındaki motor sayısı konumunu kaydedin.
4. D yüzde değişim hesaplayınMotor sayımı (~ 0-75k sayımları) 'in bir fonksiyonu olarak kelepçeler arasında istance. Bu membran üzerinde elde edilen maksimum potansiyel gerginlik gösterecektir.

Fare Akciğer Epitel Hücre Hattı Stretch 3. Uygulama (MLE12)

1. Oyuk başına esnek bir zar üzerinde 2.500.000 hücreleri (Aşama 1) Tohum MLE12 hücreler iki gün içinde birleşmiş olması. tohum yoğunluğu farklı hücre tipleri için farklı olabilir.
2. Mekanik aktüatör tamamen rahat bir konumda olduğundan emin olun.
   1. Hücre kültürü ortamı çıkarın.
   2. Altı kelepçenin her iki delikler, 1.5 mm biyopsi kalıplar kullanılarak membran çıkıntıları (Şekil 1D bakınız). deliklerin radyal yerleştirme membran deneyimleri başlangıçta ön gerilim miktarını belirler. Hiçbir ön gerilim isteniyorsa membran sekmelerde 20.5 mm yarıçapında delikler.
   3. Delikli delik kelepçeler içinde iğne ile sıraya ile sedye üzerinde membran yerleştirin.Yerde üst kelepçeleri yerleştirin. Vidaları zaman alternatif tarafta bir tane sıkın.
   4. 1 ml hücre kültür ortamı ekleyin.
3. Işık yolu ile membran orta merkezleme mikroskop sahnede cihazı yerleştirin.
4. Sahneye cihazı sabitlemek için bant veya mıknatısları (mümkünse) kullanın. Bir kez, sabit, mikroskop aşamasında kontrol ünitesi ile mekanik bir cihazın düzlem (zara paralel) ve dikey (z-yönü) kontrol eder.
5. Manuel motor dönüş ²⁰ konumunu ve hızını kontrol ederek üretici tarafından sağlanan yazılım ile streç uygulayın.

Mitokondriyal reaktif oksijen türlerinin 4. Ölçüm (ROS)

1. Hücreler birleştiklerinde, sonra, doğrudan hücrelerde mitokondriyal süperoksit göstergesi (5 uM nihai konsantrasyon) ile RT DMEM 1-2 ml ekleyin.
2. 37 ° C'de 10 dakika süreyle inkübe edin.
3. Yıkama Hücreler nazikçe tampon maddesi ile üç defa bir su banyosu içinde ısıtılmıştır37 ° C.
4. Hemen dik konfokal mikroskop altında zaten yerinde sedyeye (Adım 2.2) esnek membran yerleştirin.
5. Fenol-kırmızı içermeyen ortamda ve HEPES 25 mM DMEM 1 ml ilave edilir.
6. 510/580 nm uyarım / emisyon filtreleri ayarlayın.
7. Görüntü birden alanlar her 15 dk mitokondriyal süperoksit üretiminin istenilen zaman ders oluşturmak için.
8. Çekilen görüntülerin itibaren, rekor floresan yoğunluğu floresan yoğunluğu miktarının yeteneğine sahip yazılımı kullanarak her zaman aralığında histogramlar.

Streç ve Atomik Kuvvet Mikroskobu 5. Uygulama (AFM)

Not: Bu adımlarda, belirli bir AFM ve optik mikroskop kombinasyonu (Şekil 4 ve Malzeme Listesi) için verilmiştir.

1. Deney için AFM hazırlayın.
   1. Z-doğrultusunda maksimum pozisyona AFM baş yüksekliğini artırın.
   2. AFM ayakları üzerine genişleticiler koyUçağı kaldırmak hangi AFM konsol temas örnek de. Numune ve AFM kafası mekanik bir cihaz yüksekliğine uyacak kaldırılması gerekir.
2. (Varsa) optik mikroskop hazırlayın.
   1. AFM tarayıcı plakasını sökün. İstenilen hedefe çıkarın.
   2. Amaç için bir ayırıcı ekleyin. aralama yüksekliği objektif ve belirli AFM set-up bağlı olacaktır, ancak gözlem uçağı sedye ve adaptör yüksekliği (Şekil eşit miktarda z-yönünde kayma olacağından optik görüntüleme isteniyorsa gerekli olduğunu 5A). AFM genellikle cihazın üzerinde bir optik yolundan düşük büyütme görüntüleme sağladığını unutmayın.
   3. Konumu istenen amaç geri monte edin. AFM geri tarayıcıyı yerleştirin.
   4. AFM yazılımını başlatın. Floresan ölçümleri için ışık kaynağı dahil gerekli bütün ışık kaynakları başlatın.
   5. Bir konsol kiriş ile bir çip monte olduğunuarzu edilen ölçümler için uygundur. Canlı hücrelerin elastik modülü ölçerken 200 pN / nm ya da daha az sertlik tercih edilmektedir.
   6. Lazer hizalama ve cihaz üzerine monte edilmiş bir cam lamel üzerinde üreticinin önerilerine göre konsol sertliği kalibre.
3. Aşama 1 'de olduğu gibi bir zar hazırlama, ancak şu değişiklikler yapılmıştır.
   1. Hemen germe aygıtının için membran takmadan önce, yüksekliği yaklaşık 1 mm duvar kesti. Bu membran duvar ve yük hücresi arasında yaşanan girişimi önler.
   2. 3.2.1-3.2.3 tarif edildiği gibi mekanik bir cihaz ile ilgili membran monte edin.
   3. Bir dökülme durumunda AFM tarayıcı zarar görmesini önlemek için hücre kültürü ortamı çıkarın.
   4. Çift bir adaptör (Şekil 5A) ile bir cihaz. Tarayıcının adaptörle mekanik cihaz yerleştirin.
   5. İstenen gerilme gerinim seviyesine membran gerin.
4. Gergin hücrelerin Nano-girinti.
   1. Nedeniyle dökülme için AFM tarayıcı veya mikroskop zarar görmesini önlemek için hücreler üzerinde medya sınırlı (<0.5 ml) hacmi ekleyin.
   2. Membran ile konsol kiriş Engage.
   3. Ilgi alanları taramak için belirli AFM cihazının protokolünü izleyin.

Sonuçlar

Reaktif Oksijen Türleri ve Deformasyon

Daha önce yapılan çalışmalar, siklik streç ²¹ tepki olarak hava yolu ve alveolar epitel hücrelerinin, reaktif oksijen türlerinin (ROS) artış göstermiştir. Reaktif oksijen türleri, molekülleri ve lipitler, proteinler, polisakkaritler, nükleik ^{asitler, 22-24,} yüksek reaktiviteye sahip moleküler oksijenden türemiş serbest radikalleri içerir. ROS, ortak bir hücre içi iyon kanalı fonksiyonu düzenleyen b...

Tartışmalar

Mekanik streç sırasında canlı hücre görüntüleme için benzersiz bir cihaz geliştirildi; ve bu cihaz, akciğer epitelyal hücre mechanobiology incelemek için bir protokol kullanılmıştır. Ön çalışmalarda, tek tutulan streç bronşiyal epitel hücrelerde mitokondrial süperoksid üretimini uyardığı tespit edildi. Buna ek olarak, mekanik zorlanma artmış seviyeleri alveolar epitel hücrelerinin bir tek tabaka bütünlüğü doğrudan bozukluklara sebep olduğu gösterilmiştir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
SmartMotor NEMA 34: 3400 Series	MOOG Animatics	SM3416D	Integrated motor, controller, amplifier, encoder and communications bus
Flexcell Membrane (Collagen I coated)	Flexcell International Corp	SM2-1010C	3.5" x 5.25" x 0.020"
Sylgard 184	Dow Corning Corporation		10:1
Hoechst 33342	Sigma-Aldrich	H1399	DAPI stain
MitoSOX	Sigma-Aldrich	M36008
Tiron	Sigma-Aldrich	D7389	mitochondrial superoxide label
DMEM			superoxide inhibitor
FBS
HEPES
50 ml tubes	Fisher Scientific	06-443-19	Any centriguge tube can be used to create an area for imaging.
Hybridization oven	Bellco Glass
MLE12 Cells	ATCC	CRL-2110	Mouse Lung Epithelial Cells
16HBE cells	ATCC	CRL-2741	Human Bronchial Epithelial Cells
AFM Indentation Experiments
Cantilever Beams for Nano-indentation	Budget Sensors	Si-Ni30
AFM	Asylum Research	MFP3D
Olympus microscope	Olympus	IX-71	Inverted microscope with 20X and 40X objectives.
AFM Leg Extenders	Asylum Research	Not available	AFM microscope
Finite Element Analyses
ABAQUS	Simulia	6.12
Software
ImageJ	NIH
Microscopes
Digital microscope	Life Technologies	EVOS XL Core	Initially a self standing company, now owned by Life Technologies.
Confocal microscope	Zeiss	LSM 710	2-photon upright microscope