Imagens de células vivas durante Mecânica estiramento

Resumo

A novel imaging protocol was developed using a custom motor-driven mechanical actuator to allow the measurement of real time responses to mechanical strain in live cells. Relevant to mechanobiology, the system can apply strains up to 20% while allowing near real-time imaging with confocal or atomic force microscopy.

Resumo

There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in their capability for measuring responses in real time in live cells or viable tissue. A protocol was developed with the use of a cell actuator to distend live cells grown on or tissues attached to an elastic substrate while imaging with confocal and atomic force microscopy (AFM). Preliminary studies show that tonic stretching of human bronchial epithelial cells caused a significant increase in the production of mitochondrial superoxide. Moreover, using this protocol, alveolar epithelial cells were stretched and imaged, which showed direct damage to the epithelial cells by overdistention simulating one form of lung injury in vitro. A protocol to conduct AFM nano-indentation on stretched cells is also provided.

Introdução

As células são submetidas a cargas mecânicas em muitos tecidos, e este estímulo mecânico foi mostrado para promover a alterações dos padrões de expressão de genes, a libertação de factores de crescimento, citoquinas, ou remodelação da matriz extracelular e do citoesqueleto ^1-4. Os sinais intracelulares transduzidas de tais estímulos mecânicos ocorrer através do processo de mecanotransdutores ^5-7. No sistema respiratório, um resultado de mecanotransdutores é o aumento de espécies reactivas de oxigénio (ROS) e ^8,9 citocinas pró-inflamatórias ¹⁰ em células epiteliais pulmonares, na presença de cíclica esforço de tensão. Uma forte evidência também sugere que a tensão de tracção excessiva leva a dirigir a lesão do epitélio alveolar, para além das respostas bioquímicas das células ^11-14. Embora o foco é principalmente na resposta de células pulmonares a deformação mecânica, as vias induzidas por mecanotransdutores desempenhar um papel-chave nos basic função de muitos tecidos no corpo humano, incluindo a regulação do tónus vascular e ¹⁵ o desenvolvimento da placa de crescimento ^16.

O interesse crescente em mecanotransdutores resultou no desenvolvimento de numerosos dispositivos para a aplicação de cargas mecânicas fisiologicamente relevantes para células cultivadas e tecidos. Em particular, dispositivos de aplicação de um esforço de tensão, que é uma forma comum de carregamento mecânico experimentado pelo tecido, são populares ^11,17-19. No entanto, muitos dos dispositivos disponíveis ou são concebidos como um biorreactor para aplicações de engenharia de tecidos ou não são favoráveis ​​para imagiologia em tempo real com estiramento. Como tal, existe uma necessidade para desenvolver ferramentas e métodos que podem visualizar as células e tecidos em tensão para facilitar a investigação das vias de mecanotransdutores.

Aqui, um dispositivo de estiramento mecânico no plano foi concebido e protocolos foram desenvolvidos para aplicar multiple formas de estirpe para os tecidos e células, enquanto permitindo imagiologia das respostas bioquímicas e mecânicas em tempo real (Figura 1A-D). O dispositivo utiliza seis grampos espaçados uniformemente dispostas circunferencialmente de compreender uma membrana flexível e aplicar uma no plano, a distensão radial até aproximadamente 20% (Figura 1B). O dispositivo de accionamento pode ser colocado em uma incubadora de cultura de células por um período prolongado de tempo, enquanto o motor (Figura 1C) está posicionado do lado de fora da incubadora e controlada por software proprietário fornecido pelo fornecedor do motor. O motor é ligado a um controlador linear, o qual roda um ressalto interno, conduzindo os seis grampos esticadores uniformemente em tensão e relaxamento.

Em adição ao dispositivo mecânico, membranas flexíveis personalizadas foram criadas a partir de membranas de cultura de células imediata disponíveis comercialmente para serem utilizados no sistema mecânico. Em seguida, as paredes circulares (com um diâmetro de aproximadamente28 mm) foram feitos e ligados para a membrana flexível, de modo que as células podem ser cultivadas apenas na região do perfil estirpe bem descrito. A fim de determinar se o posicionamento destas membranas no interior do dispositivo de accionamento proporcionaria deformação uniforme e isotrópico no centro da membrana flexível, a análise de elementos finitos foi realizada usando o software comercialmente disponível (Figura 1E-F). A membrana flexível foi modelada com condições de contorno simétricas e utilizando todos os elementos quadrilaterais para a malha. Os anéis concêntricos visto no gráfico de contorno da estirpe principal máxima mostrada na Figura 1F indicam a distribuição isotrópica da estirpe.

A tensão experimentado por a membrana foi medida por gravar imagens de marcações através de carga (Figura 2). A Figura 2D mostra que a tensão média de membrana medido em direcções radiais e axiais era aproximadamente linearno que diz respeito ao motor aplicado conta-se a uma estirpe linear máxima de 20%. Não houve diferença significativa entre os níveis de tensão medidos durante a distensão em comparação com os medidos durante a retracção de volta para a posição de repouso. Em seguida, o deslocamento de células epiteliais brônquicas humanas (16HBE) e seus núcleos cultivadas sobre a membrana flexível costume foram medidos. Marcado por fluorescência (DAPI) núcleos das células 16HBE foram visualizados utilizando uma objectiva de 20x num microscópio confocal, enquanto que o deslocamento de células inteiras foi medida com imagens de contraste de fase gravados com um microscópio digital. Como pode ser visto na Figura 3, a tensão medida pelo deslocamento de núcleos foi semelhante ao medido por deslocamento de marcações na membrana, até ~ 20% de deformação linear. Isto confirma que a estirpe aplicada às membranas foi transmitida para as células aderentes. Os protocolos que descrevem a utilização do dispositivo personalizado em um microscópio tradicional e uma força atómica microscope são fornecidos nas seguintes etapas.

Protocolo

1. Construção de membrana com Bem Paredes de Retenção de celular Meios de Cultura (ver Figura 1D para o produto final)

1. Usando o polidimetilsiloxano (PDMS) folhas revestidas com colagénio I, cortar o contorno da membrana flexível com um bisturi ou uma matriz.
2. Colocar cada membrana numa placa de 60 mm de Petri para o armazenamento.
3. Criação de paredes:
   1. Misture PDMS em uma proporção de 10: 1 em peso, de elastômero A a elastômero B (agente de cura).
   2. Pour 5 ml de PDMS totalmente misturadas em tubos de 50 ml.
   3. Coloque tubos de 50 ml com PDMS não curado horizontalmente num forno de hibridação.
   4. Utilizar a função do rotor para revestir as paredes interiores dos tubos a 8 rpm durante o tempo de cura. À TA, o PDMS será totalmente curado em 2 dias.
   5. Remover o PDMS do tubo em uma capa de cultura de células estéril.
   6. Usando uma nova lâmina de barbear, particionar o cilindro de PDMS em seções 4 mm de altura.
   7. Coloque as seções, que servirão de wa membranalls, para um recipiente de placa de Petri, sem permitir que as paredes se tornar vincado.
4. Escolher e um centro da parede de PDMS em uma membrana, mantendo os dois na placa de Petri.
5. Suavemente colocar PDMS não curado (10: 1) de razão no perímetro exterior da parede a ser utilizados como cola. Evitar a formação de lacunas entre a parede ea membrana uma vez que é lá para reter líquido.
6. Colocar cada placa de Petri contendo a membrana e completou coberto num forno a 70 ° C durante 24 horas para curar.

2. Correlação de rotações do motor com braçadeira de deslocamento ou Crescimento Radial de Calibração (Figura 2)

1. Inicie o software que controla o motor.
2. Deslocar os grampos do dispositivo usando a configuração manual no software do motor.
3. Medir a distância e registrar a posição do motor de contagem entre opostos grampos em ambos deslocamento mínimo e máximo dos grampos.
4. Calcule a variação percentual no distance entre os grampos em função da contagem do motor (~ 0-75k contagens). Isto irá indicar a tensão máxima atingida no potencial de membrana.

3. Aplicação de estiramento na linha celular epitelial de pulmão do rato (MLE12)

1. Semente MLE12 células em 2,5 milhões de células sobre a membrana flexível (Passo 1) por cavidade a ser confluente dentro de dois dias. A densidade de sementeira pode variar para diferentes tipos de células.
2. Certifique-se o actuador mecânico está numa posição completamente relaxado.
   1. Remover o meio de cultura de células.
   2. Usando 1,5 milímetros punções, dois furos em cada um dos seis braçadeira (ver Figura 1D) separadores de membrana. O posicionamento radial dos furos determina a quantidade de pré-tensão da membrana inicialmente as experiências. Perfurar os orifícios com um raio de 20,5 mm nas abas de membrana se sem pré-tensão é desejado.
   3. Posicione a membrana na maca com os buracos perfurados se alinhando com os pinos dentro dos grampos.Coloque grampos superiores no lugar. Aperte os parafusos, um por vez alternando os lados.
   4. Adicionar 1 ml de meio de cultura de células.
3. Colocar o dispositivo na platina do microscópio de centragem meio da membrana com o percurso da luz.
4. Use fita ou ímãs (se possível) para fixar o dispositivo para o palco. Uma vez fixo, o controlo (em paralelo com a membrana) e no plano vertical (direcção z) do dispositivo mecânico com o controlador de fase do microscópio.
5. Aplicar estiramento com o software fornecido pelo fabricante por meio do controle manualmente a posição e velocidade de rotação do motor ^20.

4. Medição da mitocondriais Espécies Reativas de Oxigênio (ROS)

1. Uma vez que as células estão confluentes, adicionar 1-2 mL de MEMD com RT indicador superóxido mitocondrial (5 uM de concentração final) directamente nas células.
2. Incubar durante 10 min a 37 ° C.
3. Lavar as células suavemente três vezes com tampão aquecido num banho de água a37 ° C.
4. Imediatamente coloque a membrana flexível na maca (Passo 2.2) já em vigor sob um microscópio confocal vertical.
5. Adicionar 1 ml de DMEM com acesso médio de vermelho de fenol e 25 mM de HEPES.
6. Definir filtros de excitação / emissão de 510/580 nm.
7. Vários campos de imagem cada 15 min para criar o curso da produção de superóxido mitocondrial tempo desejado.
8. A partir de imagens capturadas, a intensidade de fluorescência registro histogramas a cada intervalo de tempo usando software capaz de quantificar a intensidade de fluorescência.

5. Aplicação de estiramento e Microscopia de Força Atômica (AFM)

Observação: Essas etapas são fornecidas para um AFM específico e combinação microscópio óptico (Figura 4 e Lista de Materiais).

1. Prepare o AFM para o experimento.
   1. Aumentar a altura da cabeça AFM para a sua posição máxima na direcção z.
   2. Coloque extensores sobre as pernas da AFM paralevantar o avião no qual AFM cantilever contatos da amostra. O espécime e a cabeça AFM tem de ser levantada para acomodar a altura do dispositivo mecânico.
2. Prepare o microscópio óptico (se disponível).
   1. Remova a placa de scanner de AFM. Remova o objetivo desejado.
   2. Adicionar um espaçador para o objectivo. A altura do espaçador dependerá do objetivo eo AFM específico set-up, mas é necessário se imageamento óptico é desejada desde avião de observação será mudança na direção z de um montante igual à maca e altura adaptador (Figura 5A). Note-se que a AFM geralmente proporciona uma baixa ampliação de imagens a partir de um trajecto óptico de cima do dispositivo.
   3. Monte o objectivo pretendido de volta em sua localização. Coloque o scanner de volta para a AFM.
   4. Inicie o software AFM. Comece todas as fontes luminosas necessárias, incluindo a fonte de luz para medições de fluorescência.
   5. Montar um chip com um cantilever queÉ conveniente que as medições desejadas. 200 pN / rigidez nm ou menos é preferida quando se mede o módulo de elasticidade de células vivas.
   6. Alinhar o laser e calibrar a rigidez cantilever de acordo com as sugestões do fabricante em uma lamela de vidro montado sobre o dispositivo.
3. Prepara-se uma membrana que no Passo 1, mas com as seguintes modificações.
   1. Imediatamente antes da montagem da membrana no dispositivo de alongamento, cortar as paredes de cerca de 1 mm de altura. Isto evita a interferência entre as paredes experimentado membrana e a célula de carga.
   2. Montagem da membrana no dispositivo mecânico como descrito 3.2.1-3.2.3.
   3. Remover o meio de cultura de células, para evitar danos AFM para o scanner, no caso de um derramamento.
   4. Acoplar o dispositivo com um adaptador (Figura 5A). Coloque o dispositivo mecânico com o adaptador no scanner.
   5. Distender a membrana para o nível de tensão de tracção desejada.
4. Nano-recuo de células esticadas.
   1. Adicionar uma limitada (<0,5 mL) de volume da mídia sobre as células para evitar scanner de AFM ou danos microscópio devido a um derrame.
   2. Envolver o cantilever com a membrana.
   3. Seguir o protocolo do dispositivo de AFM em particular para verificar as áreas de interesse.

Resultados

Espécies Reativas de Oxigênio e Deformação

Estudos anteriores mostraram aumentos de espécies reativas de oxigênio (ROS) em vias aéreas e células epiteliais alveolares em resposta ao estiramento cíclico ^21. Espécies reactivas de oxigénio incluem moléculas e radicais livres derivados de oxigénio molecular com alta reactividade com lípidos, proteínas, polissacáridos, ácidos nucleicos e ^22-24. ROS servir como um sinal intracelular comum para regula...

Discussão

Um dispositivo único para imagens de células vivas durante estiramento mecânico foi desenvolvido; e este dispositivo foi usado em um protocolo para estudar epiteliais do pulmão mechanobiology celular. Em estudos preliminares, verificou-se que uma única estiramento realizada estimulou a produção de superóxido mitocondrial em células epiteliais brônquicas. Além disso, foi demonstrado que o aumento dos níveis de tensão mecânica causou danos directos para a integridade de uma monocamada de células epiteliais ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
SmartMotor NEMA 34: 3400 Series	MOOG Animatics	SM3416D	Integrated motor, controller, amplifier, encoder and communications bus
Flexcell Membrane (Collagen I coated)	Flexcell International Corp	SM2-1010C	3.5" x 5.25" x 0.020"
Sylgard 184	Dow Corning Corporation		10:1
Hoechst 33342	Sigma-Aldrich	H1399	DAPI stain
MitoSOX	Sigma-Aldrich	M36008
Tiron	Sigma-Aldrich	D7389	mitochondrial superoxide label
DMEM			superoxide inhibitor
FBS
HEPES
50 ml tubes	Fisher Scientific	06-443-19	Any centriguge tube can be used to create an area for imaging.
Hybridization oven	Bellco Glass
MLE12 Cells	ATCC	CRL-2110	Mouse Lung Epithelial Cells
16HBE cells	ATCC	CRL-2741	Human Bronchial Epithelial Cells
AFM Indentation Experiments
Cantilever Beams for Nano-indentation	Budget Sensors	Si-Ni30
AFM	Asylum Research	MFP3D
Olympus microscope	Olympus	IX-71	Inverted microscope with 20X and 40X objectives.
AFM Leg Extenders	Asylum Research	Not available	AFM microscope
Finite Element Analyses
ABAQUS	Simulia	6.12
Software
ImageJ	NIH
Microscopes
Digital microscope	Life Technologies	EVOS XL Core	Initially a self standing company, now owned by Life Technologies.
Confocal microscope	Zeiss	LSM 710	2-photon upright microscope